Diese Methode kann Schlüsselfragen in den Bereichen Stammzellen und Krebs beantworten, wie die Heterogenität der Stammzelle aussieht und wie die Therapie in empfindlichen Krebszellen isoliert werden kann. Der Hauptvorteil dieser Studie besteht darin, dass sie eine technisch robuste einzellige Genexpressionsanalyse mit Impfungen kombiniert, um eine weitere nachgelagerte Charakterisierung von Zielsubpopulationen zu erreichen. Obwohl diese Methode verwendet werden kann, um den Krebs und die Stammzellheterogenität zu untersuchen, kann sie auch Einblicke in Gengrundierung und Abstammungspotenzial geben.
Um das Protokoll zu beginnen, bereiten Sie auf einer RNA/DNA-freien Bank genügend Lysepuffer für 96 Brunnen mit 10% extra vor, indem Sie 390 Mikroliter freies Wasser, 17 Mikroliter 10%NP-40, 2,8 Mikroliter 10 Millimolar dNTP, 10 Mikroliter 0,1 Molar DTT und 5,3 Mikroliter RNAse-Hemmer mischen. Wirbel und drehen Sie die Röhre. Als nächstes verteilen Sie vier Mikroliter Lysepuffer auf jeden Brunnen einer 96-Well-PCR-Platte und versiegeln Sie die Platten mit Klebefolie.
Drehen Sie die Platten nach unten, um die Flüssigkeit an der Unterseite zu sammeln. Halten Sie die Platten auf Eis bis zur Zellsortierung für maximal 24 Stunden. Sobald die FACS-Maschine richtig eingerichtet wurde, führen Sie eine Neuanalyse der Zielpopulation durch, indem Sie mindestens 100 Zielzellen in ein neues Mikrozentrifugenrohr mit 100 Mikroliter Fleckenpuffer sortieren.
FACS analysiert die sortierten Zellen, indem es die sortierte Probe aufzeichnet, und stellt sicher, dass sie im Sortiertor landen. Richten Sie dann die einzellige Plattensortierung ein, indem Sie den Tropfen in gut A1 in der 96-Well-Platte zentrieren. Wenn es zentriert ist, sortieren Sie 50 bis 106 Mikrometer Partikel in allen Brunnen um den Rand einer leeren 96-Well-Platte, um sicherzustellen, dass alle Brunnen eine Zelle in der Mitte jedes Brunnens erhalten.
Entfernen Sie den Klebefilm von den Platten. Sortieren Sie eine einzelne Zelle von Lin-CD34 plus CD38 minus Zellen in 92 der 96 Brunnen. Aktivieren Sie die Indexsortierung in der FACS-Sortiersoftware, um das immunphenotypic Profil für CD45RA, CD49F und CD90 für jede einzelne Zelle zu speichern.
Sortieren Sie zwei Bohrungen mit 10 bzw. 20 Zellen für Linearitätssteuerungen in der PCR-Verstärkung. Brunnen H1 und H2 werden in der Regel verwendet. Bewahren Sie zwei Brunnen ohne Zellen als keine Vorlagensteuerelemente auf, in der Regel Brunnen H3 und H4. Versiegeln Sie die Platten mit klarer Klebefolie und drehen Sie die Platten mit 300-facher Schwerkraft für eine Minute.
Die Platten auf Trockeneis einfrieren. Dann lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Machen Sie Reverse-Transkription und spezifische Zielverstärkung Mix durch Hinzufügen von 632,5 Mikroliter von zweifachen Reaktionsmix, 101,2 Mikroliter Taq / SuperscriptIII, 151,8 Mikroliter Primer-Mix, und 0,7 Mikroliter in Kontroll-RNA gespickt.
Wirbeln Sie die Lösung und drehen Sie sie nach unten, um die Flüssigkeit an der Unterseite des Rohres zu sammeln. Halten Sie die Mischung auf Eis, bis sie bereit ist, der Probe hinzugefügt zu werden. Als nächstes die Lysatplatten auf Eis auftauen.
Fügen Sie 8,75 Mikroliter der zuvor vorbereiteten Reverse-Transkription und spezifischen Zielverstärkungsmischung zu 92 Brunnen hinzu, einschließlich der Linearität und ohne Vorlagensteuerungen. Fügen Sie 8,75 Mikroliter ohne Reverse-Transkriptions-Kontrollmischung zu den vier verbleibenden Brunnen hinzu. Dann versiegeln Sie die Platten mit klarer Klebefolie und drehen Sie die Platten, um Flüssigkeit am Boden zu sammeln.
Führen Sie die Umgekehrte Transkription und die spezifische Zielverstärkung durch Ausführen der Platte in einer PCR-Maschine gemäß dem Vorverstärkerprogramm durch. Bereiten Sie die Assay-Ladeplatte vor, indem Sie drei Mikroliter Assay-Ladereagenz auf jeden Brunnen einer 96-Well-Platte pfeifen. Fügen Sie drei Mikroliter jeder Grundierung zu einzelnen Brunnen in der Assay-Ladeplatte hinzu.
Versiegeln Sie die Platte mit Klebefolie und drehen Sie sie nach unten. Nach dem Spinnen der Platte, bereiten Sie die Verdünnungsplatte durch Pipettieren acht Mikroliter Nuklease freies Wasser in alle Brunnen einer 96-Well-Platte. Fügen Sie der Verdünnungsplatte zwei Mikroliter verstärkter Proben hinzu.
Versiegeln Sie die Platte mit Klebefolie. Mischen Sie die Platte für 10 Sekunden. Dann drehen Sie die Platte nach unten.
Als nächstes bereiten Sie die Probenbelastungsmischung vor, indem Sie 352 Mikroliter Master-Mix sorgfältig mit 35,2 Mikroliter Probenladereagenz mischen. Bereiten Sie die Probenladeplatte vor, indem Sie 3,3 Mikroliter Lademischung auf jeden Brunnen einer 96-Well-Platte ausstatten. Fügen Sie 2,7 Mikroliter aus der verdünnten Probe in jede Bohrung der Probenladeplatte ein.
Versiegeln Sie die Platte mit Klebefolie und drehen Sie sie nach unten. Nehmen Sie einen neuen 96 by 96 mikrofluidischen Chip heraus. Bereiten Sie die Einlässe vor, indem Sie sie mit einer Spritze mit einer Kappe aufspochen, um sicherzustellen, dass sie bewegt werden können.
Fügen Sie das volle Volumen der Spritzen zu jedem Ventil hinzu, während Sie den Chip auf 45 Grad kippen und das Ventil drücken. Primen Sie den Chip mit dem IFC-Controller. Laden Sie jeden Assay-Einlass mit 4,25 Mikrolitern aus jedem der Brunnen in der Assay-Ladeplatte und vermeiden Sie Blasen.
Wenn Blasen im Brunnen erscheinen, entfernen Sie sie mit einer Pipettenspitze. Laden Sie weiterhin jeden Probeneinlass mit 4,25 Mikrolitern aus jeder der Brunnen in der Probenladeplatte, wodurch Blasen vermieden werden und Blasen mit einer Pipettenspitze entfernt werden. Laden Sie den Chip mit dem Integrated Fluidics Circuit Controller oder IFC Controller.
Überprüfen Sie, ob der Chip gleichmäßig aussieht und alle Kammern geladen wurden. Entfernen Sie Staub von der Oberfläche des Chips, indem Sie ihn mit Klebeband berühren. Führen Sie schließlich den Chip in der Multiplex-Plattform für mikrofluidische Genexpression aus.
Eine Heatmap eines erfolgreichen Laufs zeigt den gleichmäßig verteilten Ausdruck über Proben mit einem starken Signal von etwa sieben bis 25 CTs. Diese Verstärkungskurve von spiked in control RNA bestätigt, dass alle Brunnen eine klare Expression von etwa 10 CT mit wenig bis keiner Variation haben, was bestätigt, dass die Vorverstärkung und qPCR-Reaktionen für alle Zellen erfolgreich waren. Prinzipkomponentenanalyse oder PCA, das die Ähnlichkeiten zwischen Zellgruppen mithilfe der Dimensionsreduktion visualisiert, kann nützlich sein, um Cluster von molekular getrennten Zellen voneinander zu unterscheiden, um hier vier Untergruppen zu identifizieren.
Um den Immunphenotyp von Zellen aus verschiedenen molekularen Clustern zu identifizieren, laden Sie die Index-FCS-Datei in FlowJo. Öffnen Sie den Skript-Editor, und fügen Sie das Indexskript ein, drücken Sie Ausführen. Jede Zelle befindet sich nun in einem separaten Tor.
Fügen Sie jede Zelle in den Layout-Editor ein und färben Sie sie entsprechend der molekular definierten Gruppierung von SCXV, die in der Datei sample_complete_data.xls verfügbar ist. FACS-Plots zeigen die Zelloberflächenmarkerexpression für die hämatopoetischen Stammzellmarker CD90 und CD45RA, die verwendet werden können, um zwischen den Clustern zu unterscheiden und sie für die funktionelle Analyse zu isolieren. Nach diesem Verfahren können andere Techniken wie die RNA-Sequenzierung neu entdeckter Subpopulationen oder In-vitro- und In-vivo-Experimente durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. welche molekularen Mechanismen diese Heterogenität verursachen und wie sich die Subpopulation funktionell unterscheidet.
Diese Strategie ebnete den Forschern den Weg, nicht nur Heterogenität bei normaler und bösartiger Hämatopoese zu untersuchen, sondern kann auch verwendet werden, um die entdeckten Subpopulationen prospektiv zu isolieren, um sie weiter zu untersuchen.
