Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft Zuschüsse HALLO-698 / 10-1 und RU-1652 / 1-1 unterstützt. Wir danken Doreen Mai für hervorragende technische Unterstützung und das Unternehmen Dyomics GmbH, Jena für die freundliche Unterstützung.

HINWEIS: Alle Vorgänge werden von der regionalen Tierausschuss und im Einklang mit internationalen Leitlinien für die ethische Nutzung von Tieren zugelassen. 1. Herstellung der Materialien und Instrumente <ol><li> Vorbereitung der spontan gebildeten Vesikeldispersion (SFV) <ol><li> Auflösen und die Stammlösungen der folgenden Phospholipide: 214 mg / ml Ei-Phosphatidylcholin (EPC), 134 mg / ml Cholesterin, 122 mg / ml 1,2-Distearoyl--sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N - [Methoxy (Polyethylen Glykol) -2000] (Ammoniumsalz) (mPEG 2000 -DSPE) und 2 mg / ml 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N - (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4 yl) (Ammoniumsalz) (NBD-DOPE) in Chloroform und lagern in Glasfläschchen. </li><li> Einrichten ca. 3 ml Chloroform in einem Rundkolben, und übertragen Sie die entsprechende Volumen von Phospholipid-Stammlösung in den Rundkolben zu Liposomen EP, Haft-C: Chol: mPEG 2000 -DSPE in einem Molverhältnis von 6,5: 3: 0,5. Für Doppelfluoreszenzmarkierung von Liposomen hinzufügen 0,3 mol% NBD-DOPE in die Lipid-Lösung. </li><li> Nach Abdampfen des Chloroforms aus der organischen Phospholipid-Lösung unter vermindertem Druck (300 mbar) bei 55 ° C unter Verwendung eines Rotationsverdampfers. </li><li> Nachdem eine homogene Phospholipid-Film gebildet wird, verringern den Druck auf 10 mbar für 1-2 Stunden, um restliche Chloroform Anzahlung zu entfernen. </li><li> Während das Chloroform verdampft, aufzulösen DY-676-COOH (6,181 uM) in 10 mM Tris-Puffer pH 7,4 und füllen ein Dewar-Gefäß mit flüssigem Stickstoff. Schalten Sie ein Ultraschallbad und bei 50 ° C eingestellt. </li><li> Bringen Sie ein geeignetes Volumen (0,5-1 ml) der DY-676-COOH (6,181 uM) Lösung für das Rundkolben, um das trockene Phospholipidfilm und kräftig vortexen, bis ein spontan gebildeten Vesikel (SFV) Dispersion Formen hydratisieren. Sicherstellen, dass alle Phospholipide dispergiert werden, um Lipidverlust zu vermeiden. </li><li> Sorgfältig transfer den Rundkolben mit dem SFV Dispersion in flüssigem Stickstoff einfrieren und die Dispersion für 3-5 min. Setzen Sie den Rundkolben in einem Ultraschallbad bei 50 ° C, um die Dispersion auftauen vortexen die Dispersion kräftig 1-2 min. Wiederholen Sie diesen Vorgang sechsmal, also insgesamt sieben Frost-Tau-Zyklen. </li></ol></li><li> Extrusion von SFV homogene Liposomvesikel bilden <ol><li> Übertragen der SFV Dispersion in eine 1 ml Spritze (Spritze-a) und Extrudieren der Dispersion durch ein 100 nm Polycarbonat-Membran mit einem LiposoFast Basis-Extruder in spritzen b. </li><li> Extrudieren der Dispersion von der Spritze-b, zurück in die Spritze-a, dann zehnmal wiederholen Sie den Zyklus. Aufgrund der Extrusion der Lösung in der Spritze sich von einem trübes Aussehen auf eine klare Dispersion mit der Zeit. Nach zehn Zyklen (zwanzig Einzelextrusionsschritten) zu entfernen Spritze-b aus dem Gerät und extrudieren die Dispersion für das letzte Mal von der Spritze-a direkt in eine sterile1,5 ml Reaktionsgefäß. </li></ol></li><li> Die Reinigung des liposomal verkapselten DY-676-COOH aus freien Farbstoff <ol><li> Vorbereiten einer Gelchromatographiesäule mit G25 Kügelchen in 10 mM Tris-Puffer pH 7,4 (Säulenlänge 28 cm, Durchmesser 0,8 cm) eingeweicht. </li><li> Übertragen Sie 0,5 ml extrudierte Vesikel-Dispersion auf das Gelbett und lassen Sie die Beispielablauf in die Gelmatrix. </li><li> Eluieren die Liposomen mit 10 mM Tris-Puffer pH 7,4 (Figur 1A) und wäscht die Säule bis die freien Farbstoff restlos aus der Säule. Wenn es sein muss, sammeln und verwerten die freie Farbstoff durch Entsalzung und Austrocknung nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Konzentrieren der eluierten Liposomen durch Ultrazentrifugation (200.000 x g, 2 Stunden bei 8 ° C) und dann zu dispergieren sie in ausreichenden Volumen an sterilem 10 mM Tris-Puffer pH 7,4. </li></ol></li><li> Die Quantifizierung der gekapselten DY-676-COOH-Konzentration <ol><li> Eine Eichkurve, die durch Auflösen von DY-676-COOH (0, 82, 124,247, 494, 988 nM) in 10 mM Tris-Puffer, pH 7,4, enthaltend 0,1% Triton X100. </li><li> Löse 2 ul (100 nmol Lipidendkonzentration einer 50 mmol / L stock) der Liposomen für 5 min bei Raumtemperatur in 100 ul Tris-Puffer, der 1% Triton X100, um die Bläschen zu zerstören und Freigabe des eingekapselten Farbstoffes. Dann verdünnte Proben mit 10 mM Tris-Puffer, pH 7,4 auf eine endgültige Triton-X100-Konzentration von 0,1% (v / v) was ein Gesamtvolumen von 1 ml. Bereiten Sie alle Proben in Doppelbestimmung. </li><li> Messung der Absorption und Emission von allen Proben (freie DY-676-COOH und Triton-X100 behandelten Liposomen) bei einer Anregung λ = 645 nm und einer Emissions λ = 700 nm. Herzustellen und verwenden eine Eichkurve des freien Farbstoffs, um die Konzentration des eingekapselten Farbstoffes zu bestimmen. </li></ol></li><li> Liposomen-Charakterisierung <ol><li> Bestimmen Sie die Größe und Zetapotential der Liposomen durch dynamische Lichtstreuung. Verdünne die liposomalen Proben sterilfiltriert (0,2 um) 10 mM Tris-Puffer pH 7,4 bis aconzentration von 100-300 &amp; mgr; M (Lipid). Übertragen Sie die verdünnten Proben in geringer Lautstärke Einwegküvette und messen Sie die Probe gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Charakterisierung der Liposomen durch Elektronenmikroskopie, um die Größe, die Integrität und Homogenität der liposomalen Vesikel nach Standardprotokollen zu untermauern. </li></ol></li></ol> 2. Validierung des Fluoreszenz-Abschrecken und Aktivierung der hergestellten Liposomen <ol><li> Physikalisch-chemische Analyse der Fluoreszenzlöschung und Aktivierung <ol><li> Bereiten Sie zwei 1,5-ml-Röhrchen für die Lip-Q und 2 Röhren für den freien DY-676-COOH. Über 100 nmol Gesamtlipide (2,38 ul einer 42 mmol / l Lip-Q-Stammlösung, enthält 138 ug / ml des verkapselten DY-676-COOH) in die entsprechenden Röhrchen. Ablösefrei DY-676-COOH entspricht der Farbstoffgehalt von Lip-Q (0,38 &amp; mgr; g, die zum Beispiel von 138 g / 1.000 ul x 2,38 ul Lip-Q verwendet, ergibt). Inkubieren einer Wannee jeder Sonde bei 4 ° C und gefrier das zweite Rohr bei -80 ° C über Nacht (16 h). </li><li> Heizen Sie einen Heizblock auf 30 ° C. Füllen Sie eine Kühlbox mit Crushed Ice und Gleichgewicht ein Aliquot von 10 mM Tris-Puffer pH 7,4, auf Raumtemperatur. </li><li> Sonden entfernen von 4 ° C und bei Raumtemperatur äquilibrieren von -80 ° C auf 30 ° C für 5 min (in Aluminiumfolie eingewickelt, um vor Licht zu schützen), und schnell auftauen Sonden. Kühlen Sie die aufgetauten Proben auf Eis für 1 Minute vor der Übertragung auf Raumtemperatur (auch in Aluminiumfolie eingewickelt, um den Inhalt vor Licht zu schützen). </li><li> Zugabe von 10 mM Tris-Puffer (pH 7,4) zu jeder der Sonden auf 100 ul Endvolumen und äquilibrieren alle Sonden bei RT für 10 min. </li><li> Pipette 80 ul jeder Sonde in geringer Lautstärke Glasküvette und Messung der Absorption von jeder Sonde 400 bis 900 nm mit einem Spektrometer. Bringen Sie die Sonde in die entsprechenden Röhrchen. </li><li> Übertragen wurden 80 ul jeder Probe in einen geeigneten Glasküvetteund Messung der Fluoreszenzemission auf einem Spektrofluorometer von spannenden Sonden bei 674 nm und Messung der Fluoreszenz von 694 bis 800 nm. </li></ol></li><li> Die zelluläre Aufnahme und Fluoreszenz-Aktivierung <ol><li> Holen Sie sich und Kultur die folgenden Zelllinien in den entsprechenden Nährmedien nach Standardbedingungen (37 ° C, 5% CO 2 und 95% befeuchteten Atmosphäre). Hier verwenden Sie die Maus-Makrophagen-Zelllinie J774A.1 (Dulbecco mit 10% (v / v) fötalem Kälberserum modifiziertem Eagle-Medium, ergänzt), dem menschlichen Glioblastom-Zelllinie U-118 mg (MEM mit essentiellen Vitaminen und 10% (v / v) fötales Kälberserum) und dem menschlichen Fibrosarkom-Zelllinie, HT-1080 (RPMI mit 5% FCS). </li><li> Mantel 8-Well-Kammerobjektträger mit Poly-L-Lysin (Add 100 ul 0,001% Poly-L-Lysin in jede Vertiefung und bei 37 ° C für 10 min. Aspirieren Lösung und ließ die Kammer-Objektträgern zu trocknen für mindestens 4 h bei RT auf einem sterilen Werkbank. die Kammer-Objektträgern Spülen 3mal mit 200 ul Hanks Salzlösung versiegeln sie mit Paraffin und Aluminiumfolie und bei 4 ° C bis benötigt. </li><li> Während die Kammer-Objektträgern versiegen, Filter-Sterilisation der Liposomen und Farbstofflösung und bei 4 ° C bis benötigt. </li><li> Zur Sondenaufnahme Analyse mit dem ganzen Körper in vivo NIR Fluoreszenz-Bildgebungssystem, herzustellen 5 kleine Kulturflaschen für jede der 3-Test-Zellinien (15 Kolben insgesamt). Seed 2 x 10 6 J774A.1, U-118 mg und HT-1080-Zellen pro Kulturflasche mit 5 ml des jeweiligen Kulturmediums (in verfünffacht) und wachsen 16-24 Std. Parallel zu den Kulturflaschen, Samen 30.000 Zellen jeder Zelllinie (J774A.1 und HT-1080-) oder 20.000 Zellen (U-118 mg) und 2 Vertiefungen der Schieberkammer jeweils und wachsen in 500 ul Kulturmedium für 16-24 Std . </li><li> Am nächsten Tag wird mit 100 nmol (endgültige Lipidmenge) Lip-Q zu 2 Flaschen pro Zelllinie und einer gut jeder Zelllinie an der Kammerobjektträger.Sofortüberweisung 1 Flasche pro Zelllinie bis 4 ° C, und der zweite Kolben zurück in den Inkubator. ANMERKUNG: Das Volumen der Sonden in die Kolben gegeben, und die Kammer-Objektträgern die gleichen sind, wodurch die Konzentration auf Kammer-Objektträgern 10-fach höher (5 ml ist, um 500 &amp; mgr; l Kulturmedium). Dies ist notwendig, weil mikroskopischen Nachweis ist weniger empfindlich als die NIR Fluoreszenz-Bildgebungssystem, in dem die Zellpellets aus den Kolben abgebildet werden. </li><li> Fügen Sie den kostenlosen DY-676-COOH in einer Konzentration entspricht dem Farbstoffgehalt von Lip-Q an die Zellen in 2 Flaschen pro Zelllinie und einer gut jeder Zelllinie an der Kammer Rutsche, dann sofort übertragen 1 Flasche pro Zelllinie auf 4 ° C (Energieverlust) und der andere Kolben zusammen mit der Kammerobjekt zurück zum Inkubator. Alle Zellen einer Inkubationszeit von 24 Stunden bei den entsprechenden Bedingungen. Die Zellen in der Flasche ohne Fühler dienen als unbehandelten Kontrolle. </li></ol></li><li> NIRF Bildgebung und semi-quantitative Analyse <ol><li> Nach 24 Stunden Inkubationsdauer, Ernte der Zellen in Kolben durch Waschen der Zellen 2 mal mit Hanks gepufferter Salzlösung (HBSS) schaben Zellen in 500 &amp; mgr; l HBSS und Pellet durch Zentrifugation (5 min bei 200 · g) in 500 &amp; mgr; l Röhrchen. </li><li> Die Röhrchen mit den Zellpellets (und HBSS) in einer NIRF-Imager und Bild mit Hilfe von Filtern für die Anregung (615-665 nm) und Emissions (Schnitt in&gt; 700 nm). </li><li> Abzüglich Autofluoreszenz und bewerten die Intensität der Ziel gegen Autofluoreszenz nach Herstelleranweisungen. Dadurch werden die semi-quantitative Niveaus der Fluoreszenzintensität als Durchschnittssignal (skaliert Zählimpulse / s), der Zählerwerte nach Skalierung für Belichtungszeit Kameraverstärkung, Klassifizierung und Farbtiefe darstellt, so dass die Messwerte untereinander vergleichbar zu ergeben. </li></ol></li><li> Die konfokale mikroskopische Analyse <ol><li> Nach 24 Stunden Inkubation Ernte der Zellen auf Kammer-Objektträgern durch Auswaschen 2 mal mit 500 ul HBSS. </li><li> Befestigen Sie die cells mit 200 ul HBSS, enthaltend 3,7% (v / v) Formaldehyd 30 min bei RT. </li><li> Während Fixierung los ist, verdünnen Sie die DNA-Färbung, Hoechst-33258 1:50 mit Montagelösung. </li><li> Nach der Fixierung, Waschen Sie die Zellen 2 mal mit HBSS dann trennen die Kammern von den Glasobjektträger. Dann werden 50 ul Befestigungslösung, enthaltend die DNA-Fleck auf jedem Fleck entsprechend den Vertiefungen der Kammer gleitet. Decken Sie die Zellen mit Deckgläsern, versiegeln Kanten mit transparentem Nagellack und der Luft trocknen für 10 min bei RT (dunkel). </li><li> Bildzellen auf einem geeigneten Fluoreszenzmikroskop oder konfokalen Mikroskop. Verwenden Sie die folgenden Anregungs- und Emissions Einstellungen für die Visualisierung der entsprechenden Komponenten: Kerne (Hoechst-33258: Anregung 405 nm, Emission 420 bis 480 nm). NBD-DOPE (liposomale Lipid: Anregung 488 nm, Emission 530 nm). DY-676-COOH (NIR Fluoreszenzfarbstoff: Anregung 633-645 nm, Emission 650 bis 700 nm). HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Fluoreszenzmikroskop einvailable mit geeigneten Filtern, die Anregungs- und Emissionswellenlängen von mehr als 630 nm zu ermöglichen ausgestattet. </li></ol></li></ol> 3. Liposomen-basierte In-vivo-Fluoreszenz-Imaging von Entzündungen <ol><li> Vorbereitung der Tiere und Materialien <ol><li> Haus 8-12 Wochen alte männliche NMRI-Mäuse mit einem Gewicht von ca. 36 g unter Standardbedingungen mit Futter und Wasser ad libitum. </li><li> Sieben Tage vor dem Start der Experimente geben allen Mäusen eine geringe Pheophorbid Diät, um Gewebeautofluoreszenz zu verringern. </li><li> Vierundzwanzig Stunden vor dem Beginn eines jeden Versuchs, rasieren Mäusen in den gewünschten Bereich (zB gesamte Rückenbereich, wenn der Bildhinterbeinödeme gewünscht). </li><li> Wiegen Sie die Tiere und die Berechnung der Höhe der Sonde pro Maus (Lip-Q und Lip-dQ bei 10 &amp; mgr; Mol (Lipidkonzentration pro kg Gewicht und frei DY-676-COOH (entspricht injiziert werden) zum Inhalt des Lip-Q verwendet Farbstoff) . </li><li> Bild die Tiere ineine Ganzkörper-NIR Fluoreszenz-Imager mit den gleichen Einstellungen für den Zellpellets verwendet. Diese Messung liefert die Autofluoreszenz der Tiere. </li><li> Man löst 10 mg Zymosan-A in 1 ml isotonischer Kochsalzlösung und über Nacht lagern bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Induktion der Entzündung und in vivo Bildgebung NIRF <ol><li> Bereiten Sie drei Spritzen pro Maus die folgenden Lösungen mit. Füllen Sie eine Spritze mit 50 ul Zymosan-A-Lösung (10 mg / ml) und die zweite Spritze mit 50 ul isotonische Kochsalzlösung. Füllen Sie die dritte Spritze mit den Sonden, wobei Lip-Q und Lip-dQ (10 mmol / kg Körpergewicht (Lipid)) für Versuchstiere und frei DY-676-COOH (Konzentration wie in Lip-Q) bezeichnet für die Kontrolltiere. Achten Sie darauf, die Sonden mit sterilem HBSS zu 150 ul Endvolumen verdünnt. </li><li> Bewerben Augencreme auf die Augen der Tiere bis zur Trockenheit zu vermeiden und zu betäuben Tiere mit 2% Isofluran, bis sie tief eingeschlafen sind und wenn an den Pfoten berührt nicht reagieren (Dies dauert etwa 2 min). </li><li> Platzieren Sie die Maus auf eine warme Matte (noch unter Narkose) und injizieren Sie die Zymosan-A-Lösung subkutan am rechten Hinterbein und die Salzlösung auf der linken Hinterbein. Injizieren Sie sich sofort die Sonde intravenös und Bild das Tier danach dann der Rekordzeit von Injektion / Messung (als t = 0 h). Speichern Sie die Bilder als Bildwürfel und wiederholen Sie die Schritte für alle anderen Tiere und jeweiligen Sonden. </li><li> Bild die Tiere alle 2 Stunden für 10 Stunden nach der Injektion und dann nach 24 Stunden nach der Injektion, um sicherzustellen, dass die Phase der Messkammer ist warm (zum Beispiel, indem Sie eine warme Matte unten), um Unterkühlung zu vermeiden. Nach jeder Messung wird, legen Sie die Tiere in einem Käfig mit Futter und Wasser ad libitum und platzieren Sie den Käfig in einem gemäßigten Tierkammer. Euthanize die Tiere durch erste Betäubung mit 2% Isofluran, bis die Tiere nicht mehr auf Berührung reagieren, dann einschläfern mit Kohlendioxid für 5-10 Minuten, so dasssicher sein, dass die Tiere aufhören zu atmen vollständig und Totenstarre eintritt. </li><li> Sezieren die Mäuse nach Standardprotokollen, die Online beurteilt werden kann (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) und Bild Organe. </li><li> Auswerten der Messergebnisse nach den Anweisungen des Herstellers durch erste Abzug der Gesamtfluoreszenz der Tiere (Entmischung) dann Zuweisen Regionen von Interesse für die Autofluoreszenz (linke Hinterbein mit Kochsalzlösung) und Ziel Fluoreszenz entzündeten Bereich (rechte Hinterbein mit Zymosan-A). </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Da Liposomen kann auch als Trägersysteme für Fluoreszenzfarbstoffe dienen, Abbildung von Zielkrankheiten ermöglichen sie. Die Verkapselung von hohen Konzentrationen von fluoreszierenden Farbstoffen, wie den NIRF-Farbstoff, DY676-COOH hier verwendet, führt zu einem hohen Maß an Fluoreszenzlöschung des eingeschlossenen Farbstoff. Fluoreszenzlöschung, ein Phänomen mit vielen Fluorophoren zu sehen in einer hohen Konzentration kann in verschiedenen in vivo-Abbildungsanwendungen, bei denen eine hohe Empfindli...

Liposomen wurden intensiv untersucht und als eine der biokompatiblen biomedizinischen Arzneimittelabgabesysteme für klinische Anwendungen 1,2. Sie werden hauptsächlich aus Phospholipiden und Cholesterin, die beide biokompatible Verbindungen nachahmen Teile Natur Zellmembranen besteht. Erwägung, hydrophilen Substanzen können in dem wässrigen Innenraum eingeschlossen werden können lipophile Wirkstoffe in der Liposomen-Phospholipid-Doppelschicht 3 eingebracht werden. Einkapselung von Stoffen in wässrigen Inneren von Liposomen gewährt Schutz gegen Abbau in vivo und verhindert auch das Host-System von toxischen Wirkungen von Zytostatika für die Therapie von Krankheiten verwendet werden, zum Beispiel Chemotherapeutika auf die Zerstörung von Tumorzellen gerichtet. Die Modifikation der liposomalen Oberfläche mit Polymeren, wie Polyethylenglycol (PEGylierung) erweitert die liposomale Blutzirkulationszeit in vivo aufgrund sterischer Stabilisierung 4. MoreovER, Liposomen können hohe Konzentrationen von mehreren Substanzen, wie Proteine ​​5,6, hydrophilen Substanzen 7,8 und Enzyme 9 sequestrieren. Sie dienen somit als zuverlässige klinische therapeutische und diagnostische Instrumente, die ihre Zustimmung für die Lieferung von Zytostatika verdienen wie Doxorubicin für die Krebstherapie 4. Aufgrund ihrer Flexibilität können Liposomen auch mit Fluorochromen für diagnostische und bildgeführte chirurgische Zwecke geladen werden. Fluoreszenz-Bildgebung liefert eine kostengünstige und nicht-invasive in vivo-Diagnosewerkzeug, erfordert jedoch einige grundlegende Anforderungen. Es konnte gezeigt werden, dass Fluoreszenzfarbstoffe, die am besten für die in-vivo-Bildgebung angepasst haben charakteristische Absorptions- und Emissionsmaxima im Bereich, wo Lichtverteilung und Streuung sowie Gewebeautofluoreszenz aus dem Wasser stamm und Hämoglobin ist gering. So haben solche Sonden ihre abs / em Maxima zwischen 650 und 900 nm 10.<html> Außerdem ist die Stabilität von Farbstoffen in vitro und in vivo kritisch, Opsonisierung und schnellen Clearance kann stark ihre Anwendung für die in vivo-Bildgebung 11 begrenzen. Andere Effekte, wie geringe Stabilität und eine geringe Empfindlichkeit oder zytotoxische Wirkung auf Zielorgane wie Indocyaningrün (ICG) 12-16 zu sehen ist, sind unerwünscht und müssen berücksichtigt werden, wenn Sonden für die in-vivo-Bildgebung genommen werden. Diese Beobachtungen haben zur Entwicklung von aktiven verschiedenen präklinischen NIR Fluorochrome, Nanopartikel sowie neue Techniken für die in vivo-Abbildung von Entzündungsprozessen, Krebs und für die bildgeführte Chirurgie 17-20 geführt. Trotz der Stabilität der meisten präklinischen NIRF (Nah-Infrarot-Fluoreszenz) Farbstoffe in vitro, deren rasche Perfusion und Clearance durch die Leber und Nieren, behindern den Einsatz in der in-vivo-optischen Bildgebungs von Erkrankungen und entzündlichen Prozessen. ntent &quot;&gt; Wir haben daher für die Einkapselung von Farbstoffen stellen ein Protokoll wie das gut charakterisiert Nahinfrarot-Fluoreszenzfarbstoff DY-676-COOH, das für seine Tendenz bei relativ hohen Konzentrationen 21 in Liposomen bekanntlich Selbst Quench. Bei hohen Konzentrationen H- Dimerbildung und / oder pi-Stapelwechselwirkungen zwischen Fluorophor-Moleküle innerhalb Förster-Radius Ergebnis des jeweils anderen in Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) zwischen den Fluorochrommoleküle entfernt. Bei niedrigen Konzentration in den Raum zwischen den Fluorophor-Moleküle zu, wodurch pi-Stacking-Interaktion zu verhindern, und H-Dimerbildung und dadurch hohe Fluoreszenzemission. Der Wechsel zwischen hoher und niedriger Konzentration und dem begleitenden Fluoreszenzlöschung und die Aktivierung ist eine vielversprechende Strategie, die zur optischen Abbildung 22 ausgenutzt werden kann. In dieser Hinsicht, Verkapselung von hohen Konzentrationen an NIRF-Farbstoff DY-676-COOH in wäßrigen Innenraum von Liposomen ist fastigen für die in vivo-Bildgebung ist als der freie Farbstoff. Die Aufgabe des Verfahrens liegt vor allem in der richtigen Verkapselung und zweitens bei der Validierung der Vorteile aus Einkapseln hohen Konzentrationen des Farbstoffs resultiert. Vergleich der Abbildungseigenschaften des abgeschreckten Liposomen mit der des freien Farbstoffes und auch mit einem nicht-abgeschreckt Liposomenformulierung mit geringer Konzentration des Farbstoffs ist unverzichtbar. Wir zeigen durch eine einfache, aber sehr effektive Filmflüssigkeitszufuhr und Extrusions Protokoll in Verbindung mit alternativen Frost-Tau-Zyklen, die Verkapselung von Abschrecken Konzentrationen von DY-676-COOH in Liposomen möglich ist. Andere Methoden, um Liposomen herzustellen, wie die Umkehrphasenverdampfungsverfahren 23 sowie der Ethanol-Injektionsmethode 24 ermöglichen Liposomzubereitung mit hoher Einschlusseffizienz für viele hydrophile Substanzen. Allerdings ist die Art der zu verkapselnden Substanz können die Einkapselungseffizienz beeinflussen. TatsächlichDas hier vorgestellte Film Flüssigkeitszufuhr und Extrusions Protokoll ergeben, die höchste Effizienz für die Verkapselung von DY-676-COOH. Um die Vorteile der liposomalen Verkapselung von DY-676-COOH, einem Zymosan-induzierte Ödem-Modell, das die Untersuchung von Entzündungsprozessen innerhalb von einigen Stunden erlaubt illustrieren, wurde verwendet. Hier wird gezeigt, daß Liposomen mit einer hohen Konzentration des eingekapselten DY-676-COOH in vivo optische Bildgebung von Entzündungsprozessen als der freie Farbstoff oder das nicht-abgeschreckt Liposomenformulierung mit niedriger Farbstoffkonzentrationen besser geeignet für den ganzen Körper. So ist die zugrunde liegende Protokoll bietet eine einfache und schnelle Methode, um abgeschreckt fluoreszierende Liposomen und die Validierung ihrer Aktivierung und Bildgebung Potenzial sowohl in vitro als auch in vivo zu produzieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="872">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:267px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:309px;">Materials and equipments for preparation of liposomes</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">egg phospahtidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051P</td>
			<td>Dissolve in Chloroform and store in glass vials (214 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td>Dissolve in Chloroform and store in glass vials (134 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880120P</td>
			<td>Dissolve in Chloroform and store in glass vials (122 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:309px;">1,2-dioleoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810145P</td>
			<td>Dissolve in Chloroform and store in glass vials (2mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Sartorius MC1 (d = 0.01 mg)</td>
			<td>Sartorius AG</td>
			<td>Research RC 210 P</td>
			<td>used for weighing the phospholipids</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Rotavapor</td>
			<td>B&#252;chi Labortechnik AG</td>
			<td>R-114</td>
			<td>used for hydration of phospholipid film</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Waterbath</td>
			<td>B&#252;chi Labortechnik AG</td>
			<td>R-481</td>
			<td>used for hydration of phospholipid film</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Vacuum Controller</td>
			<td>B&#252;chi Labortechnik AG</td>
			<td>B-720</td>
			<td>used for hydration of phospholipid film</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Vacobox</td>
			<td>B&#252;chi Labortechnik AG</td>
			<td>B-177</td>
			<td>used for hydration of phospholipid film</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Circulation Chiller</td>
			<td style="width:179px;">LAUDA DR. R. WOBSER 
			GMBH &#38; CO. KG</td>
			<td>WKL 230</td>
			<td>used for hydration of phospholipid film</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DY-676-COOH</td>
			<td>Dyomics GmbH</td>
			<td>676-00</td>
			<td>Dissolve in 10 mM Tris and store stock at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1086</td>
			<td>buffer 10 mM, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trichlormethan</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>Y015.2</td>
			<td>used for liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sonicator</td>
			<td>Merck Eurolab GmbH</td>
			<td>USR 170 H</td>
			<td>used for liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00)</td>
			<td>Scientific Industries Inc.</td>
			<td>SI-0256</td>
			<td>used for liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sephadex G25 medium&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Europe GmbH</td>
			<td>17-0033-01</td>
			<td>used for liposome purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X100</td>
			<td>Ferak Berlin GmbH</td>
			<td>505002</td>
			<td>used to destruct liposomes&#160; for dye quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LiposoFast-Basic</td>
			<td>Avestin Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for the extrusion of liposomes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polycarbonate filter membrane, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U)</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for the extrusion of liposomes via LiposoFast-Basic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluostar Optima</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for dye quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for the determination of liposome size and zetapotential</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Beckmann Coulter GmbH</td>
			<td style="width:119px;">XL 80</td>
			<td>used for concentration of the samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Rotor</td>
			<td style="width:179px;">Beckmann Coulter GmbH</td>
			<td style="width:119px;">SW 55 TI</td>
			<td>used for concentration of the samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:309px;">Materials and equipments for the evaluation of liposome and optical imaging&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Zymosan-A from Saccharomyces cereviciae</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">Z4250-250MG</td>
			<td>used for induction of inflammation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Isotonic Saline (0.9)</td>
			<td style="width:179px;">Fresenius GmbH</td>
			<td style="width:119px;">PZN-2159621</td>
			<td>used for the dilution of Zymosan-A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Isoflurane vaporizer</td>
			<td>Ohmeda Isotec 4</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for anesthesizing animals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Isoflurane</td>
			<td>Actavis GmbH&#160;</td>
			<td style="width:119px;">PZN-7253744</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Mat Pro 20 W</td>
			<td style="width:179px;">Lucky Reptile</td>
			<td style="width:119px;">61202-HTP-20</td>
			<td>used to keep animals warm during anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Omnican-F (1 ml injection)&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">PZN-3115465</td>
			<td>used for subcutaneous and intravenous application of probes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Panthenol eye cream</td>
			<td style="width:179px;">Jenapharm</td>
			<td style="width:119px;">PZN-3524531</td>
			<td>used to prevent dryness of the eyes of animals during anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:309px;">Hanks buffered saline solution</td>
			<td style="width:179px;">PAA Laboratories /Biochrom AG</td>
			<td style="width:119px;">L2045</td>
			<td>w/o Mg2+, Ca2+ and phenol red. For dilution of probes and for washing of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">8-Well chamber slides</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">354108</td>
			<td>used for cell culture followed by microscopy&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Cell culture flasks</td>
			<td style="width:179px;">Greiner BioOne</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture media</td>
			<td colspan="2">Gibco (life technologies GmbH)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal calf serum&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-Lysine solution (0,01% - 50&#160;ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4832</td>
			<td>used to coat cell culture chamber slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mountant Permafluor</td>
			<td>ThermoScientific&#160;</td>
			<td>S21022-3</td>
			<td>Mounting solution for microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Hoechst-33258</td>
			<td style="width:179px;">AppliChem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA stain for microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Hera-Safe</td>
			<td>Heraeus Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>sterile work bench used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HERA cell</td>
			<td>Heraeus Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Incubator used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">LSM510-Meta</td>
			<td style="width:179px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:309px;">Maestro-TM in vivo fluorescence imaging system</td>
			<td style="width:179px;">CRi, Woburn</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for whole body fluorescence imaging of small animals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Spectrophotometer (Ultrospec 4300 pro UV)</td>
			<td style="width:179px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for measurement of absorption</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Spectrofluorometer (Jasco FP-6200)</td>
			<td style="width:179px;">Jasco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for measurement of fluorescence emission</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Animals</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NMRI mice (8-12 weeks old, male)</td>
			<td style="width:179px;">Elevage Janvier, France</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for inflammation trials</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-quenching of a liposomal-encapsulated near-infrared fluorophore as a tool for in vivo optical imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Die Verkapselung von hohen Konzentrationen von fluoreszierenden Farbstoffen, wie den NIRF-Farbstoff DY676-COOH in wäßrigen Innenraum von Liposomen verwendet hier führt zu einem hohen Niveau der Fluoreszenzlöschung. Fluoreszenzlöschung, ein Phänomen mit vielen Fluorophoren in hoher Konzentration zu sehen ist, kann in verschiedenen in vivo-Abbildungsanwendungen, wo eine hohe Empfindlichkeit und eine zuverlässige Detektion des Zielgebiets gefordert werden ausgenutzt werden. Die Verwendung von Liposomen biet...

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Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluoreszenz-Abschrecken eines Liposomenverkapseltes NIR-Fluorophore als Instrument zur<em&gt; In-vivo-</em&gt; Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

fluorescence-quenching-liposomal-encapsulated-near-infrared

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

16.1K Aufrufe.  Jena University Hospital. The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity. 

Serie: Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Dreidimensionale Optische Auflösung photoakustische Mikroskopie

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Forschung

Biotechnik

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including skeletal muscle, bone and placenta. Contemporary studies demonstrate fusion of cells of the same type confers enhanced function. For example, when the trophoblast cells of the placenta fuse to form the syncytiotrophoblast, the syncytiotrophoblast is better able to transport nutrients and hormones across the maternal-fetal barrier than unfused trophoblasts1-4. More recent studies demonstrate fusion of cells of different types can direct cell fate. The "reversion" or modification of cell fate by fusion was once thought to be limited to cell culture systems. But the advent of stem cell transplantation led to the discovery by us and others that stem cells can fuse with somatic cells in vivo and that fusion facilitates stem cell differentiation5-7. Thus, cell fusion is a regulated process capable of promoting cell survival and differentiation and thus could be of central importance for development, repair of tissues and even the pathogenesis of disease.
Limiting the study of cell fusion, is lack of appropriate technology to 1) accurately identify fusion products and to 2) track fusion products over time. Here we present a novel approach to address both limitations via induction of bioluminescence upon fusion (Figure 1); bioluminescence can be detected with high sensitivity in vivo8-15. We utilize a construct encoding the firefly luciferase (Photinus pyralis) gene placed adjacent to a stop codon flanked by LoxP sequences. When cells expressing this gene fuse with cells expressing the Cre recombinase protein, the LoxP sites are cleaved and the stop signal is excised allowing transcription of luciferase. Because the signal is inducible, the incidence of false-positive signals is very low. Unlike existing methods which utilize the Cre/LoxP system16, 17, we have incorporated a "living" detection signal and thereby afford for the first time the opportunity to track the kinetics of cell fusion in vivo.
To demonstrate the approach, mice ubiquitously expressing Cre recombinase served as recipients of stem cells transfected with a construct to express luciferase downstream of a floxed stop codon. Stem cells were transplanted via intramyocardial injection and after transplantation intravital image analysis was conducted to track the presence of fusion products in the heart and surrounding tissues over time. This approach could be adapted to analyze cell fusion in any tissue type at any stage of development, disease or adult tissue repair.

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A method to track cell fusion in living organisms over time is described. The approach utilizes Cre-LoxP recombination to induce luciferase expression upon cell fusion. The luminescent signal generated can be detected in living organisms using biophotonic imaging systems with a sensitivity of detection of &tilde;1,000 cells in peripheral tissues.

Ein Cre-Lox P Rekombination Ansatz für den Nachweis von Cell Fusion In Vivo</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Viral Nanopartikel für<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an integral part of normal tissue renewal, excessive amount of remodeling activity is involved in tumors, arthritis, and many other pathological conditions. During collagen remodeling, the triple helical structure of collagen molecules is disrupted by proteases in the extracellular environment. In addition, collagens present in many histological tissue samples are partially denatured by the fixation and preservation processes. Therefore, these denatured collagen strands can serve as effective targets for biological imaging. We previously developed a caged collagen mimetic peptide (CMP) that can be photo-triggered to hybridize with denatured collagen strands by forming triple helical structure, which is unique to collagens. The overall goals of this procedure are i)&#160;to image denatured collagen strands resulting from normal remodeling activities in vivo, and ii) to visualize collagens in ex vivo tissue sections using the photo-triggered caged CMPs. To achieve effective hybridization and successful in vivo and ex vivo imaging, fluorescently labeled caged CMPs are either photo-activated immediately before intravenous injection, or are directly activated on tissue sections. Normal skeletal collagen remolding in nude mice and collagens in prefixed mouse cornea tissue sections are imaged in this procedure. The imaging method based on the CMP-collagen hybridization technology presented here could lead to deeper understanding of the tissue remodeling process, as well as allow development of new diagnostics for diseases associated with high collagen remodeling activity.

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

This procedure demonstrates in vivo near IR fluorescence imaging of collagen remodeling activities in mice as well as ex vivo staining of collagens in tissue sections using caged collagen mimetic peptides that can be photo-triggered to hybridize with denatured collagen strands.

Imaging denaturierten Kollagen-Stränge<em&gt; In-vivo-</em&gt; Und<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Über die Photo-ausgelöst Hybridisierung von Caged Collagen mimetischen Peptiden

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

Selektive Zellelimination aus Mixed 3D Culture Mit einem Nah-Infrarot-Technik Photoimmunotherapy

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Herstellung von 3D-Kollagen-Gel und Mikrokanäle für das Studium der 3D-Interaktionen<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and functionalize polymer chains with compounds that are able to improve biocompatibility, mechanical properties, or cell viability allows the design of novel materials to meet new challenges in the biomedical field. With the polymer functionalization strategies, click chemistry is a powerful tool to improve cell-compatibility and drug delivery properties of polymeric devices. Similarly, the fundamental need of biomedicine to use sterile tools to avoid potential adverse-side effects, such as toxicity or contamination of the biological environment, gives rise to increasing interest in the microwave-assisted strategy.
The combination of click chemistry and the microwave-assisted method is suitable to produce biocompatible hydrogels with desired functionalities and improved performances in biomedical applications. This work aims to synthesize RGD-functionalized hydrogels. RGD (arginylglycylaspartic acid) is a tripeptide that can mimic cell adhesion proteins and bind to cell-surface receptors, creating a hospitable microenvironment for cells within the 3D polymeric network of the hydrogels. RGD functionalization occurs through Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition. Some PAA carboxyl groups are modified with an alkyne moiety, whereas RGD is functionalized with azido acid as the terminal residue of the peptide sequence. Finally, both products are used in a copper catalyzed click reaction to permanently link the peptide to PAA. This modified polymer is used with carbomer, agarose and polyethylene glycol (PEG) to synthesize a hydrogel matrix. The 3D structure is formed due to an esterification reaction involving carboxyl groups from PAA and carbomer and hydroxyl groups from agarose and PEG through microwave-assisted polycondensation. The efficiency of the gelation mechanism ensures a high degree of RGD functionalization. In addition, the procedure to load therapeutic compounds or biological tools within this functionalized network is very simple and reproducible.

We present a protocol for the synthesis of RGD-functionalized hydrogels as devices for cell and drug delivery. The procedure involves copper catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC) between alkyne-modified polyacrylic acid (PAA) and a RGD-azide derivative. The hydrogels are formed using microwave-assisted polycondensation and their physicochemical properties are investigated.

Die Synthese von RGD-funktionalisierten Hydrogele als Werkzeug für therapeutische Anwendungen

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

Gezielte Plasma Membrane Lieferung eines Hydrophobic Transport Encapsulated in einem Liquid Crystal Nanoparticle Träger

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of flexible polymers nor of rigid rods. Underlying filaments remain outstretched due to their non-vanishing backbone stiffness, which is quantified via the persistence length (lp), but they are also subject to strong thermal fluctuations. Their finite bending stiffness leads to unique, non-trivial collective mechanics of bulk networks, enabling the formation of stable scaffolds at low volume fractions while providing large mesh sizes. This underlying principle is prevalent in nature (e.g., in cells or tissues), minimizing the high molecular content and thereby facilitating diffusive or active transport. Due to their biological implications and potential technological applications in biocompatible hydrogels, semiflexible polymers have been subject to considerable study. However, comprehensible investigations remained challenging since they relied on natural polymers, such as actin filaments, which are not freely tunable. Despite these limitations and due to the lack of synthetic, mechanically tunable, and semiflexible polymers, actin filaments were established as the common model system. A major limitation is that the central quantity lp cannot be freely tuned to study its impact on macroscopic bulk structures. This limitation was resolved by employing structurally programmable DNA nanotubes, enabling controlled alteration of the filament stiffness. They are formed through tile-based designs, where a discrete set of partially complementary strands hybridize in a ring structure with a discrete circumference. These rings feature sticky ends, enabling the effective polymerization into filaments several microns in length, and display similar polymerization kinetics as natural biopolymers. Due to their programmable mechanics, these tubes are versatile, novel tools to study the impact of lp on the single-molecule as well as the bulk scale. In contrast to actin filaments, they remain stable over weeks, without notable degeneration, and their handling is comparably straightforward.

Semiflexible polymers display unique mechanical properties that are extensively applied by living systems. However, systematic studies on biopolymers are limited since properties such as polymer rigidity are inaccessible. This manuscript describes how this limitation is circumvented by programmable DNA nanotubes, enabling experimental studies on the impact of filament rigidity.

DNA-Nanoröhren als ein vielseitiges Werkzeug, semiflexiblen Polymere zu studieren

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.