Name: using in vitro live-cell imaging to explore chemotherapeutics delivered by lipid-based nanoparticles
Uploaded: 2017-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles at JoVE.com

Die Mikroskopie Einrichtungen verwendet, sind Teil des Erasmus Optical Imaging Center und möchten wir den Mitarbeitern der Organisation der Islamischen Konferenz für ihre Dienste.

1. Vorbereitung <ol><li>montieren die bildgebende Kammer, die aus zwei Teilen besteht.
	<ol><li>Ein 25-mm-Deckglas ( Abbildung 1A -1) im Unterteil der Kammer ( Abbildung 1A-2) und verschrauben den oberen Teil in den Unterteil ( Abbildung 1A-3). Ziehen Sie nicht zu hart, wie das Glas zerbrechen kann. Autoklaven die ganze Kammer ( Abbildung 1A -4).</li>
	</ol></li> <li>Bereiten Zellkulturmedium durch Ergänzung Dulbecco &#39; s Modified Eagle &#39; s Medium (DMEM) ohne Phenol rot mit 10 % Hitze-inaktivierten fetalen Kälberserum (FCS) und 1 mM L-Glutamin unter sterilen Bedingungen. Shop bei 4 ° C und Warm auf 37 ° C vor dem Gebrauch.</li>
	<li>Halten die Zellen mit Zellkulturmedium in Fläschchen mit Standardzellen Kulturtechniken Kultivierung. 
	Hinweis: Hier zwei Maus-Zelllinien, Melanom B16BL6 11 und Lewis Lunge Karzinom (LLC) und zwei menschliche Melanome, BLM und 1F6 12 dienten.</li>
	<li>Machen 0,1 % Gelatine durch Wiegen und Auflösen von Gelatine in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei 37 ° C über Nacht. Sterilisieren Sie die Lösung durch einen 0,22-µm-Filter filtern und speichern Sie es auf 4 ° c</li>
</ol> 2. Platte Zellen <ol><li>Sterilisationsbeutel in eine laminare Strömung Kabinett die bildgebende Kammer entfernen, sorgfältig anziehen die Kammer, und legen Sie sie in eine Petrischale. 
	Hinweis: Zur Vermeidung von Kontamination halten die bildgebende Kammer in einer Petrischale bis die Kammer unter dem Mikroskop platziert werden kann.</li>
	<li>Mantel des Glases der bildgebenden Kammer mit 1 mL 0,1 % sterile Gelatine für 20 min bei 37 ° C und 5 % CO 2. 
	Hinweis: Dies ermöglicht bessere Zellhaftung.</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium aus dem Zellkulturflaschen (siehe Schritte 1.2 und 1.3), einmal mit 1 X PBS waschen und lösen die Zellen mittels Trypsin 0,25 %. Inaktivieren die Trypsin durch Zugabe von Zellkulturmedium, sammeln die Zellen sie spin-down bei 1.100 x g für 5 min und das Pellet in 5 mL Zellkulturmedium Aufschwemmen.</li>
	<li>Verdünnen 20 µL Zellsuspension mit 20 µL Trypan blau (die von toten Zellen aufgenommen wird). Die Anzahl der lebenden und toten Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer; die Zahl der toten Zellen soll 10 % nicht überschreiten.</li>
	<li>Aspirieren Sie die Gelatine und Platte Zellen in einer Verdünnung, die für ein Maximum von 70 % innerhalb von 24 h ermöglicht. Z. B. eine Verdünnung von 5 x 10 4 oder 10 x 10 4 Zellen in 1 mL. Können die Zellen bei 5 % CO 2 und 37 ° C für 24 h halten</li>
</ol> 3. Zeitraffer-Mikroskopie ( Abbildung 2) Hinweis: hier ein confocal Mikroskop mit einem maßgeschneiderten Bühne Halter verwendet wurde, obwohl die meisten Hersteller eine Palette von Inkubatoren bieten für live Cell imaging, die sind auch geeignet, um Nanoparticulated-Drug-Delivery untersuchen.
<ol><li>Bewerten die Zellen unter dem Mikroskop auf Konfluenz, zellulären Morphologie und Verschmutzung. Legen Sie die Kammer zurück in den CO-2-Inkubator. 
	Hinweis: Die Konfluenz sollte 70 % nicht überschreiten. Wenn die zelluläre Morphologie ist inkonsistent (d. h. die Zellen nicht haften) oder Kontamination festgestellt, verwerfen die bildgebende Kammer.</li>
	<li>Schalten die confocal Mikroskop ( Abb. 1E -1), fluoreszierendes Licht ( Abbildung 1E -2) und Computer ( Abb. 1E-3).</li>
	<li>Verbinden die Objektiv-Heizung zum Ziel und setzen Sie ihn auf 35 ° C (-4 Figur 1E + einfügen).</li>
	<li>Bereiten die Inkubation Einheit, wie in Abbildung 1 b gezeigt. 
	Hinweis: Dieses Gerät besteht aus einem beheizten Objekttisch ( Abbildung 1 b -1), eine Fluss-Bühne mit einem Stecker für die CO 2 Röhren ( Abbildung 1 b -2) und CO-2-Sonde ( Abbildung 1 b -3), und einen roten schließen Patch ( Abbildung 1 b -4). Dieser Patch wird verwendet, um das Gerät vorübergehend zu schließen, bis die bildgebende Kammer platziert ist.</li>
	<li>Stellen die Inkubation Gerät auf den Mikroskoptisch und dem in - und out - flow CO 2 Schläuche anschließen ( Abb. 1E-5). CO 2 Hauptventil ( Abb. 1E-6) zu öffnen und den CO 2 Controller ( Abb. 1E-7) einschalten. Prüfen, ob der Controller ist mit 5 % CO 2. 
	Hinweis: Für feuchte, CO 2 verläuft durch einen Luftbefeuchter ( Abb. 1E-8). Für Hypoxie Experimente, ein separater O 2 Regler ( Abb. 1E-9) ist im Setup enthalten.</li>
	<li>Stellen Sie die Bühne Temperatur auf 37 ° C ( Abb. 1E -10). Für Hyperthermie Experimente, stellen Sie die Temperatur auf 42 ° c erlauben die Inkubation Einheit um die gewählte Temperatur und CO 2 Prozent erreichen.</li>
	<li>Nehmen die bildgebenden Kammer aus den wichtigsten CO 2 Inkubator und transportieren die Kammer in einer Petrischale auf die Mikroskopie Zimmer.</li>
	<li>Die bildgebende Kammer ( Abbildung 1A-4) in eine maßgeschneiderte, 35 mm Durchmesser inszenieren Halter ( Abbildung 1A -5) und die Kammer mit einem maßgeschneiderten Dichtung Deckel schließen ( Abbildung 1A-6). 
	Hinweis: Der Deckel kann CO 2 übergeben und verhindert Verdunstung und Kontamination.
	<ol><li>Inkubation Gerät öffnen, ersetzen Sie den roten Patch mit der bildgebenden Kammer und schließen Sie das Gerät ( Abbildung 1). Tun Sie dies so schnell wie möglich zu verhindern, dass die Abkühlung der Zellen. Stellen Sie sicher, dass keine Kabel zwischen Bühne und das Mikroskop stecken.</li>
	</ol></li> <li>Lassen Sie das Gerät für 30 min. akklimatisieren</li>
	<li>Öffnen Sie die Software und die Laser einschalten. 
	Hinweis: Hier, 488 nm Argon, 543 nm Helium-Neon und 633 nm Helium-Neon Laser dienten.</li>
	<li>Eine neue Datenbank zu machen, indem Sie auf &#34; New &#34; unter die Registerkarte "Datei" Namen und speichern Sie die Datenbank.</li>
	<li>Die Konfiguration festlegen, indem Sie auf &#34; Config &#34; unter die Registerkarte "Acquire" Select &#34; Kanalmodus &#34; und &#34; eingleisig &#34;, ein einzelnes Fluorophore zu bewerten oder &#34; Multi-Track &#34; für mehrere Fluorophore. Wählen Sie die entsprechende Bandpass-Filter entsprechen der Fluorophor (z. B. 560 bis 615 nm Bandpass-Filter für Dox und Dox-NP; siehe die Ergebnisse repräsentativ für weitere Beispiele). Wählen Sie den Hellfeld Kanal in einem der Tracks.</li>
	<li>Stellen Sie den Scan-Regler durch Klicken auf &#34; Scan &#34; unter die Registerkarte "Acquire" Set die Rahmengröße (1.024 x 1.024), Scan-Geschwindigkeit (optimal), Richtung (8-Bit, Single) scannen, und Scannen Sie Durchschnitt (4) durch Klicken auf &#34; Modus. &#34; setzen die Lochkamera (200 µm), gewinnen und ausgeglichen () z.B., 580, 700 und 835; (siehe Abbildung 3), und Laserleistung (488 = 10 543 = 100 % %, 633 = 100 %) durch Klicken auf &#34; Kanäle. &#34;</li> <li>Speichern Sie diese Einstellungen durch Klicken auf &#34; Config &#34; in der Konfiguration Registerkarte, und speichern Sie sie in der Konfigurationsdatenbank.</li>
	<li>Legen Sie durch Klicken auf den Zeitraffer &#34; Multi Time X &#34; ( Abbildung 1) in die Registerkarte "Makro" Klick &#34; Single Lage &#34;.</li>
	<li>Zu den Zellen im Fokus, den automatische Fokus in das Makro durch Klicken auswählen &#34; Auto Focus. &#34; 
	Hinweis: Autofokus wird mit dem 633-nm-Laser mit der Reflexion des Glases als Referenzpunkt erreicht.</li>
	<li>Gelten die gespeicherte Konfiguration durch Klicken auf &#34; eingleisig &#34; oder &#34; Multi Track &#34; Scrollen auf die erforderliche Konfiguration in der Konfigurationsdatenbank, Einstellung des Zeitintervalls (z. B. 15 min), Anzahl der Scans (z.B. 97) und Klicken &#34; Load Config. &#34; Hinweis: mit diesen Einstellungen, eine Zeitreihe von 97 x 15 min = 24 h vorgenommen werden.</li>
	<li>Nennen den Zeitraffer in die &#34; Basis Dateinamen &#34; und wählen Sie die Datenbank (hergestellt in Schritt 3.11) durch Klicken auf &#34; Bilddatenbank &#34; um den Zeitraffer zu retten. Legen Sie einen temporären Ordner durch Klicken auf &#34; Tmp Image Ordner. &#34; Hinweis: Wenn das System stoppt oder aus irgendeinem Grund abstürzt, befinden sich die Bilder in diesem Ordner.</li>
	<li>Inkubation Gerät öffnen, heben Sie den bildgebenden Ring, einen Tropfen Immersionsöl auf das Ziel, und schließen Sie das Gerät so schnell wie möglich. Konzentrieren und wählen Sie eine Position in der bildgebenden Kammer. 
	Hinweis: Diese Position enthält Zellen in einem monomolekularen Film, mit einem Minimum von 70 % Konfluenz, so dass für die Darstellung der einzelnen Zellen.</li>
	<li>Die Konfigurationseinstellungen für den Hintergrund zu überprüfen und ggf. korrigieren. 
	Hinweis: Der Hintergrund kann durch Verringerung der Gewinn oder Laser macht korrigiert werden. Jede Änderung in der Konfiguration muss gespeichert werden (siehe Schritt 3.17) und geladen (siehe Schritt 3.18) wieder in das Makro.</li>
	<li>In der laminaren Strömung Kabinett, verdünnen, freie Medikament oder Nanopartikel in einer Konzentration von 5 µg/mL Medikament oder 0,05 µmol der Lipide im Zellkulturmedium. Durch einen 0,22-µm-Spritze-Filter filtern, wenn die Droge/Nanopartikel nicht steril sind.</li>
	<li>Die Inkubation Kammer zu öffnen, heben Sie den Dichtringen Deckel das Medium aus den Zellen zu entfernen, fügen Sie 1 mL der verdünnten Medikament/Nanopartikel und schließen Sie das Gerät so schnell wie möglich.</li>
	<li>Konzentrieren sich auf die Zellen und beginnen den Zeitraffer durch Klicken auf &#34; Startzeit &#34; im Makro Multi Time X.</li>
	<li>Überprüfen Sie regelmäßig, ob die Zellen noch im Fokus oder verwenden Sie den Autofokus (siehe Schritt 3.16). Das Programm speichert automatisch in der Datenbank den Zeitraffer; Schließen Sie die Datenbank nicht, während das Programm ausgeführt wird.</li>
</ol> 4. Analyse der Daten <ol><li>abhängig von der ursprünglichen Fragestellung verwenden Software-Programme wie ImageJ zur Datenanalyse (siehe Abschnitt Ergebnisse für Beispiele).</li></ol>

<ol>
	<li>Duggan, S. T., Keating, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pegylated+liposomal+doxorubicin:+a+review+of+its+use+in+metastatic+breast+cancer,+ovarian+cancer,+multiple+myeloma+and+AIDS-related+Kaposi's+sarcoma.">Pegylated liposomal doxorubicin: a review of its use in metastatic breast cancer, ovarian cancer, multiple myeloma and AIDS-related Kaposi's sarcoma.</a> Drugs. 71 (18), 2531-2558 (2011).</li><li>Gabizon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+circulation+time+and+enhanced+accumulation+in+malignant+exudates+of+doxorubicin+encapsulated+in+polyethylene-glycol+coated+liposomes.">Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes.</a> Cancer Res. 54 (4), 987-992 (1994).</li><li>Ten Hagen, T. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Wie in der Vergangenheit beobachtet, kann Fixierung liposomale darin fast sofort zerstören und DXR veröffentlicht Form dieser zerstörten Liposomen noch die Zeit hatte, um den Kern, so dass die Interpretation der Daten sehr schwierig und sogar irreführend. Mit einigen mikroskopisch kleine Anpassungen kann der chemotherapeutische Schicksal in lebenden Zellen und Geweben routinemäßig untersucht werden, zu bestätigen oder histologische Beobachtungen zu stürzen. Eine neuere Arbeit zeigte die Aufnahme, Entlassung und Lokalisierung von DXR in Zellen mit freien und gekapselte Dox mit Leben-Zelle Zeitraffer bildgebenden9behandelt. Diese Arbeit beschreibt den Versuchsaufbau im Detail. Mit diesem Modell ist es möglich, visualisieren die unmittelbare Beförderung von Dox in den Zellkern, wo sammelt es kontinuierlich, bis die Zelle schließlich stirbt. Im Gegensatz dazu wenn Dox-NP verwendet wird, werden nur geringe Mengen an freigegebenen Dox im Kern gefunden. Obwohl Dauerbelastung kontinuierliche DXR Aufbau ergibt, das Fluoreszenzsignal ist viel niedriger im Dox-NP-versus Dox-behandelten Zellen, die einen Unterschied in zellulären Konzentration und anschließende Zytotoxizität. Darüber hinaus zeigte sich mithilfe von live-Zell-Marker, dass, wenn Zellen Dox-NP auszusetzen, DXR und die Nanocarrier in den Lysosomen befinden. Dies bedeutet, dass die komplette Liposomen von der Zelle aufgenommen wird und die Beteiligung von einem endocytic Weg während der Aufnahme von diesen Nanopartikeln zeigt. Die DXR im Zellkern ist eindeutig von freigegebenen Dox. Allerdings ist mit dieser Methode, wie die DXR und Träger Co lokalisieren und scheinen in Lysosomen gefangen werden, es immer noch nicht schlüssig ob dies ist gekapselt oder Dox veröffentlicht. Es ist möglich, dass die innere Stabilität der Nanopartikel verhindert Dox loslassen in den Lysosomen lokalisiert.
In diesem Protokoll zeigt live Cell Imaging über eine bestimmte mikroskopische Setup mit einem maßgeschneiderten Bühne Halter (die Spezifikationen auf Anfrage ausgehändigt). Confocal Mikroskop-Hersteller bieten jedoch eine Reihe von Inkubatoren, die live Cell Imaging durchführen. Erhaltung der Zelle Kulturbedingungen (d. h. Temperatur, CO2, pH-Wert, Feuchtigkeit und Sterilität) ist das wichtigste Kriterium für diese Inkubatoren und erfordert einige vorläufige Tests, um die richtigen Bedingungen festzulegen, die weiter erklärt. Automatisierte Übernahme Programme können auch von den gleichen Herstellern geliefert werden. Ein "Multi" Positionswahl macht es möglich, mehrere Positionen in der gleichen Kammer Bild verfeinern statistische Analyse. Allerdings erfordert diese Option in das Makro in diesem Manuskript erwähnt feste XYZ Positionen, mit denen die Möglichkeit, für Z-Drift korrigieren verloren geht. Scannen die Z-Dimension kann in diesem Makro und verwendet ein Schwerpunkt Flugzeug für die Analyse einbezogen werden. Dies erfordert jedoch zusätzliche scannen, wodurch die Möglichkeit der Phototoxizität und bleichen.
Wie bei alle fluoreszierenden Messungen, ist Überbelichtung ein Problem, vor allem, wenn zwei Verbindungen mit einer verschiedene zelluläre Aufnahme vergleichen. Die fluoreszente Intensität hängt nicht nur von der intrinsischen Signal der Verbindung, sondern auch auf die Geschwindigkeit der Aufnahme, die Konzentration und die Droge-Belichtungszeit. Wie in Abbildung 3 dargestellt, ist die nukleare DXR-Inhalt der Dox-behandelten Zellen bereits sichtbar, während kein Signal bei Dox-NP-behandelten Zellen vorkommt. Nur durch eine Erhöhung der Verstärkung kann die DXR im Dox-NP-behandelten Zellen visualisiert werden, führt zu Überbelichtung im Dox-behandelten Zellen. Darüber hinaus auch intrazellulär Dox-NP ist heterogen verteilt, was unvermeidlich unter führen kann- oder Überbelichtung. Vor allem bei der Untersuchung der zellulären DXR Verlockende Falle wurde der Gewinn deutlich reduziert, um einzelnen Organellen (zahlen 5 b und 5 C) zu unterscheiden. So sind die Messungen von Pixeldichte vertreten die repräsentative Bilder für die richtige Interpretation der Ergebnisse beizufügen.
Phototoxizität, Bleichen und ein niedriges Signal-Rausch-Verhältnis sind ebenfalls wichtige Themen in der Fluoreszenz-Mikroskopie und ein Kompromiss zwischen der Qualität des Bildes und die Bildaufnahme muss festgelegt werden. Auch wenn das Mikroskop-Setup optimal ist, wird die Bildqualität jedoch auch weitgehend durch die Qualität der Zellen und der zusätzlichen Verbindung bestimmt. DXR gibt ein starkes Signal, und mit den entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen Bleichen wurde nicht beobachtet, auch nach längerer Zeit (bis zu 72 h). Die Reduzierung der das Fluoreszenzsignal kann jedoch auch eine Folge der Fluth. Ausfluss ist ein wichtiges Phänomen in der Droge Widerstand15 und tritt auf, wenn die Droge aus den intrazellulären Ort des Geschehens Zellen abzupumpen. Eine Abnahme der das Fluoreszenzsignal im Laufe der Zeit kann daher auch ein Ergebnis von Dox Efflux9sein. Vergleicht man das Fluoreszenzsignal nicht gescannt Lage am Ende des Experiments mit das letzte Bild aus der Time-Lapse-Serie zeigen, Bleichen (d.h. das Signal wird höher sein an der Stelle nicht gescannt) oder Efflux (d. h., beide Signale werden identisch sein). In Programmen wie ImageJ16gibt es verschiedene Justizvollzugsanstalten Möglichkeiten (z. B. Hintergrund, Drift, Bleichen, etc.). Auch wenn die fluoreszente Intensität im Laufe der Zeit zunimmt, kann die Konfigurationseinstellungen vorab bewertet in einem Pilotversuch Überbelichtung zum Jahresende im Zeitraffer (Schritt 3.21) zu minimieren. Alternativ kann eine bildgebende Kammer mit Zellen bereits, das Medikament für den gewünschten Zeitraum verwendet werden, um die Einstellungen zu initialisieren. Schließlich für diese Art von Analyse, giftige Droge Konzentrationen (Schritt 3.22) sollte vermieden werden und vordefinierte mit konventionellen Bio-Assays.
Zellen sind ständig kultiviert und gepflegt im Medium ohne Phenol rot. Phenol rot fluoresziert im roten Teil des Spektrums und zellulare Organellen, am ehesten Lysosomen, Darstellung von falsch-positiven Informationen (Schritt 1.2) beobachtet werden. Damit kann für die Überwachung der einzelnen Zellen, sollten Zelle Zusammenfluss 70 % (Schritt 3.1.) nicht überschreiten. Die CO2 -Strömungsgeschwindigkeit (Schritt 3.5) muss geregelt werden, in einem Experiment Validierung, wenn die Ausrüstung gekauft wird oder nach der Wartung. Wenn die Geschwindigkeit zu hoch ist, wird Medium verdampfen. Wenn die Drehzahl zu niedrig ist, steigt der pH-Wert des Mediums, die beeinflussen Zellwachstum. Als das Medium ohne das Phenol rot pH Indikator Veränderung des pH-Wertes können nicht beobachtet werden und sind daher leicht zu übersehen. Nachdem die CO2 Strömung validiert wurde, können diese Einstellungen in allen zukünftigen versuchen verwendet werden.
Mit der beschriebenen Methode hier, kann das Schicksal von Nanopartikeln einfach untersucht werden mit live Cell Imaging und Zeitraffer-Mikroskopie. In diesem Verfahren wurden im Handel erhältlichen Nanopartikel eingesetzt. Aber das Schicksal von wärmeempfindlichen17, kationische Liposomen10; Liposomen angereichert mit kurzkettigen Shingolipids18; und Nanopartikel Kapselung von anderen Drogen,8,19 wurden auf diese Weise im Tumor und normale Zellen untersucht.

Die Fähigkeit, einen biologischen Prozess, z. B. Zell-Zell-Interaktionen, folgen inter- und intrazellulären Transport, zytotoxische zusammengesetzte Aufnahme und Protein-Protein Interaktion der einzelnen Moleküle in lebenden Zellen und Geweben, hat großes Interesse in den letzten gewonnen zehn Jahren bietet die zusätzliche Dimension der "Real Time". In diesem Manuskript ist eine Methode, um den intrazellulären Schicksal frei Dox und Dox gegründet Nanopartikel (Dox-NP) beschrieben.
Nanopartikel haben seit Jahrzehnten zur Behandlung von bestimmten Krebsarten. DOX-NP ist zugelassen für die Behandlung von AIDS-assoziiertes Kaposi-Sarkom, fortgeschrittene Eierstock- und Brustkrebs, und Multiples Myelom1. Es war eines der ersten liposomalen Nanopartikeln entwickelt und eingeführt in der klinischen Einstellung. Die freie Form, Dox, wird erheblich auf die Durchblutung, Begrenzung die Tumor-Website in ausreichender Menge erreichen gelöscht. Darüber hinaus wird von schweren und Begrenzung der Dosis Nebenwirkungen, wie Stomatitis und Herzinsuffizienz Behandlung begleitet. Wenn in pegyliertem liposomalen Nanopartikel verkapselt erhöht die Zirkulation Zeit von Minuten an Tag2. Diese Art von Cholesterin-haltigen Liposomen ist recht stabil und diese Stabilität bestimmt die Pharmakokinetik von gekapselten Droge.
Diese Steifigkeit hat jedoch einen Nachteil. Die zytotoxische Fähigkeit eines Stoffes gegen Tumorzellen ist ersten ausgewerteten in-vitro-, und es hat sich gezeigt, dass die Dox ist stärker als Dox-NP in zytotoxischen3,4 Proben. Es wurde vermutet, dass die Stabilität des Trägers die Freisetzung und zelluläre Aufnahme des Medikaments verhindert, und es lohnt sich, dieses Phänomen weiter zu untersuchen. Liposomalen Eigenschaften, gebaut um die aggressiven Elemente in die Blutbahn zu dauern und die Tumor-Website erhalten, zu erreichen führte die beeinträchtigt Bioverfügbarkeit der zytotoxische Komponente (d. h. Dox) an die Ziel-Site (d. h. der tumor Zellkern). Dox-NP verwegen die Antwort im Vergleich zu der freien Form verbessert, war es noch der klinische Wert wie Kapselung kardiotoxische Effekte5deutlich reduziert. In den folgenden Jahren wurden weitere Verbindungen in Nano-Carrier6gekapselt. Außerdem ändern die Träger ausgelöste Wirkstofffreisetzung (z.B. bei der Tumor-Website) ergab aber Stabilität in die Blut-Zirkulation7,8erhalten. Trotz jahrelanger Untersuchungen und klinische Anwendung sind die intratumorale Schicksale der darin wie Dox-NP noch nicht ganz klar. In einer kürzlich erschienenen Publikation zeigte sich, dass die Nanopartikel als Ganzes aufgegriffen wird, während die Dox in den Lysosomen9gefangen bleibt.
Zelluläre Aufnahme von Nanopartikeln und Drug Release sind dynamische Prozesse, die am besten mit live Cell Imaging überwacht werden können. Darüber hinaus klassische Histologie, in denen Zellen inkubiert werden und danach fixiert, können falsche Ergebnisse geben, wenn die Fixierung den liposomalen Träger zerstört und Artefakten führt. Die wichtigste Voraussetzung für das live Cell Imaging ist die Visualisierung, vorzugsweise durch Fluoreszenz, der den gewünschten Prozess. Bestimmte Verbindungen, wie Dox, haben eine intrinsische rote Fluoreszenz. Fluoreszierende Markierungen in die Halterung eingeführt werden können, auch Zellorganellen mit live-Zell-Markern visualisiert werden können. Auf diese Weise kann ein Array von Parametern, wie Aufnahme des Trägers, Wirkstofffreisetzung und zellulären Lokalisation des Trägers und Droge, abgebildet und analysiert werden. Hier wird ein Verfahren beschrieben, in denen das interzelluläre Schicksal der Dox und Dox-NP in mehrere Tumorzellen in Echtzeit gefolgt ist. Auch diese Methode kann leicht an die idealen Bedingungen zu schaffen, für (z. B. Nanopartikel10in Rechnung gestellt gezielte) und ausgelöst (z.B. Hyperthermie7) Wirkstofffreisetzung.

<table><tbody><tr><td>DMEM (no phenol-red)</td><td>Sigma</td><td>D1145</td><td>Supplemented with 1 mM L-glutamine and 10 % FCS</td></tr><tr><td>Trypsin-versene (EDTA)</td><td>Lonza</td><td>BE17-161E</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td>Heat inactivate for 30 min at 55 &amp;ordm;C</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin from bovine skin</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td>Make a 0,1% solution in PBS, sterile</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Stericup 0,22 &amp;micro;m filter - 500 ml&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>Trypan-blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Cells: Lewis lung carcimoma</td><td>ATCC</td><td>CRL-1642</td><td></td></tr><tr><td>Cells: B16BL6</td><td>Dr. P. Brouckaert, Ghent University</td><td>donated</td><td>Ref.10</td></tr><tr><td>Cells: BLM and 1F6</td><td>Dr. van Muijen, University of Nijmegen</td><td>donated</td><td>Ref.11</td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Greiner</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Doxorubicin</td><td>Actavis&amp;nbsp;</td><td></td><td>mentioned as dox in the manuscript</td></tr><tr><td>Doxil/Caelyx</td><td>Janssen-Cilag</td><td></td><td>mentioned as Dox-NP in the manuscript</td></tr><tr><td>Syringe filter 0.2 &amp;micro;m</td><td>VWR international</td><td>10462200</td><td></td></tr><tr><td>Lysotracker-green DND-26</td><td>Invitrogen</td><td>L7526</td><td>mentioned as lyosomal marker (LM)-green in manuscript</td></tr><tr><td>Lysotracker-red DND-99</td><td>Invitrogen</td><td>L7528</td><td>mentioned as lyosomal marker (LM)-red in manuscript</td></tr><tr><td>Attofluor cell ring</td><td>Invitrogen</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass 25 mm #1</td><td>Thermo scientific</td><td>CB00250RA1</td><td></td></tr><tr><td>Stage holder + sealing lid</td><td>Custom made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEISS LSM 510 microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software LSM 510 version 3.2 SP2</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td></tr></tbody></table>

using in vitro live-cell imaging to explore chemotherapeutics delivered by lipid-based nanoparticles

Konventionelle bildgebende Verfahren bieten detaillierte Informationen über zelluläre Prozesse. Jedoch diese Angabe beruht auf statischen Bildern in einem ansonsten dynamischen System, und aufeinanderfolgende Phasen leicht übersehen oder falsch interpretiert. Live Cell Imaging und Zeitraffer-Mikroskopie, in denen lebende Zellen für Stunden oder sogar Tage in einer mehr oder weniger kontinuierliche Weise verfolgt werden können, sind daher sehr informativ. Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Untersuchung des Schicksals der chemotherapeutischen Nanopartikel nach der Lieferung von Doxorubicin (Dox) in lebenden Zellen. DOX ist ein intercalating Mittel, das aus seiner Nanocarrier biologisch aktiv freigegeben werden muss. Trotz ihrer klinischen Eintragung für mehr als zwei Jahrzehnten sind seinen Aufnahme, Verteilung und Wirkstofffreisetzung noch nicht vollständig verstanden. Dieser Artikel untersucht die Hypothese, die dass die Lipid-basierte Nanopartikel werden von den Tumorzellen aufgenommen und langsam abgebaut. Freigegebene Dox ist dann in den Zellkern umgesiedelt. Um die Fixierung Artefakte zu vermeiden, können live Cell Imaging und Zeitraffer-Mikroskopie, beschrieben in diesem experimentellen Verfahren angewendet werden.

Kennzeichnung von liposomalen Träger mit verschiedenen Markern wurde zuvor beschriebenen9. Träger, beschriftet mit dunkelrote Dioctadecyl Tetramethylindotricarbocyanine Perchlorat (habe; Ex = 644 nm; EM = 665 nm) oder grüne 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(carboxyfluorescein) (CF-PE; Ex = 490 nm; EM = 515 nm) sind in diesem Manuskript vorgestellt. Interzellulären Ähnlichkeiten und Unterschiede in liposomalen Aufnahme, Entlassung und intrazelluläre Lokalisation, zeigen mehrere Tumorarten untersucht wurden. Dazu gehören zwei Mauslinien, B16BL6 Melanom11 und Lewis Lungenkarzinom (LLC), und zwei menschliche Melanome, ein hoch metastatischen (BLM) und ein nicht-metastasierten (1F6) Melanom12,13. Alle Experimente wurden mit lebenden Zellen durchgeführt. In allen versuchen eine Konzentration von 5 µg/mL Dox, 5 µg/mL Dox-NP oder 0,05 µmol von Nanopartikeln wurden verabreicht, für 3 oder 24 h. gemessen und analysiert Dox (im Freien, freigegeben, gekapselten, abgesonderten oder eingefügten Form) als DXR bezeichnet wurden. Eine 40 X (numerische Apertur: 1.3) Öl-Objektiv verwendet wurde, und Bildgebung erfolgte mit einem 488 nm Argonlaser (10 % / 0,2 mW Leistung) und 505 bis 550 nm Bandpass-Filter für CF-PE und lysosomalen Marker (LM)-grün. 543 nm Helium-Neon Laser (100 % / 0,2 mW Leistung) und 560, 615 nm Bandpass-Filter wurde für Dox, Dox-NP und lysosomalen Marker-rot verwendet. Ein 633 nm-Helium-Neon-Laser (100 % / 0.5 mW Leistung) und einer 640 nm lang-Pass-Filter wurde für verwendet haben.
Wegen seiner Kapselung waren die in-vitro- Zytotoxizität, Bioverfügbarkeit und Pharmakokinetik von Dox signifikant veränderten3,9,14. Der Unterschied zwischen die Bioverfügbarkeit des Medikaments in freien und gekapselten Form verabreicht wird in Abbildung 3gezeigt. DOX ist ein intercalating Wirkstoff und muss den Zellkern zu zytotoxischen eingeben. Abbildung 3 und verwandte Filme 1 und 2 zeigen einen 3 h Zeitraffer der BLM Zellen mit Dox oder Dox-NP unter identischen Bedingungen behandelt. Innerhalb weniger Minuten Dox Exposition nukleare DXR beobachtet werden (Abb. 3A, Film 1) und mit einem niedrigeren gewinnen (einfügen), im Zellkern verschuppen gesehen werden kann. Im Gegensatz dazu ist bei Dox-NP, intrazellulären DXR kaum sichtbar innerhalb dieses Zeitrahmens (Abb. 3 b, Movie 2). Nur durch eine Erhöhung der Photomultiplier Gain, DXR im Zytoplasma beobachtet werden (insert). Verwendung von ImageJ, wurden die Pixel-Dichte der zytoplasmatischen und nukleare DXR analysiert. Wie Zellen im Zeitraffer Bewertung in Bewegung sind, ist es wichtig, Leuchtstofflampen mit Hellfeld Bildern kombinieren. Dies bietet die Möglichkeit der Verfolgung einzelner Zellen und stabilisieren die XY-Drift mit speziellen Plugins in ImageJ. In der in Abbildung 3dargestellten Analyse diente das Hellfeld Bild eine Region of Interest (ROI) um das Zytoplasma (durchgezogene Linie) und Kern (gepunktete Linie) zu zeichnen. Der ROI-Manager in ImageJ finden Sie unter dem Menüpunkt Analyze &#62; Tools &#62; ROI-Manager. Diese ROIs in das fluoreszierende Bild verwendet, um die Pixeldichte zu analysieren, indem Sie über den Menüpunkt Analyze &#62; Maßnahme. Der Unterschied zwischen der Pixeldichte im Zellkern (Abbildung 3) und Zytoplasma (Abbildung 3D) der Dox - oder Dox-NP-behandelten Zellen bestätigt, was in den Bildern zu sehen ist. Darüber hinaus wurden Zellen inkubiert, für 24 h mit Dox oder Dox-NP, nach dem die Verbindung durch Medium ersetzt wurde und sofort mit erhöhter Empfindlichkeit der Photomultiplier Gain (Abbildung 4) abgebildet. Andere Einstellungen, wie z. B. Laserleistung, Offset, Lochkamera und Bildanzeige, waren identisch. Das niedrige DXR-Signal im Dox-NP-behandelten gegenüber Dox-behandelten Zellen fällt. Mit einem Gewinn von 700, wird DXR in den Dox-NP-behandelten Zellen sichtbar, während das Bild der Dox bereits überbelichtet ist. Diese einfachen in Vitro Experiment visualisiert einen signifikanten Unterschied in die Bioverfügbarkeit von versus gekapselte Droge frei.
Wenn Zellen kontinuierlich Dox-NP 24 Stunden ausgesetzt werden, baut DXR sich im Laufe der Zeit wie in Abbildung 5A und Filme 3 und 4 dargestellt. Das Signal erhöht im Zytoplasma, und später, DXR findet sich auch im Zellkern eingelagert. Diese Beobachtungen werden durch die Pixel-Dichte-Diagramme (Abb. 5 b) bestätigt. Die gemessenen zytoplasmatischen Pixeldichte ist niedriger bei BLM im Vergleich zu 1F6 Zellen aufgrund der Unterschiede in intrazelluläre Verteilung. Während DXR in 1F6 Zellen in der Zelle verteilt wird, konzentriert sich DXR in BLM Zellen mehr in ein Organell in der Nähe der Kern (Abbildung 5).
Daher war die Lokalisierung der Droge und Träger in verschiedenen Zelllinien (Abbildung 6) untersucht. Zellen wurden 24 Stunden mit Dox-NP/Tat und abgebildeten inkubiert. Mit dem Hellfeld Bild, war eine Überlagerung der Zellmembran (durchgezogene Linie) und Kern (gepunktete Linie) in das fluoreszierende Bild von drei verschiedenen Zelllinien gezogen. Es wird hier deutlich, dass die Träger, die mit beschriftet, folgt dem gleichen zytoplasmatischen Muster als DXR: in ein Organell in der Nähe der Kern im BLM, um den gesamten Kern in LLC, konzentriert und zufällig in das Zytoplasma in B16BL6 Zellen verteilt. Im Zellkern nur DXR und Nein gesehen werden kann, zeigt Dox veröffentlicht. Durch die Reduzierung der Photomultiplier Gain, einzelner zellulärer Vesikel mit DXR und Träger, beschriftet mit haben, sowie mit CF-PE (Zahlen 6 b und 6 C), gesehen werden können.
Zytoplasmatischen DXR Sequester in kleine Bläschen, und Zellen wurden mit einer live-lysosomale Zellmarkierung in grün oder rot gekennzeichnet. Die Bewegung dieser Lysosomen kann in den Zellen (Movie 5) verfolgt werden. Zytoplasmatischen DXR und die Nanocarrier colocalize innerhalb dieser Strukturen und der interzelluläre Unterschied in der DXR-Muster, wie in Abbildung 6zu sehen ist hier erklärt. Lysosomen sind zufällig verteilt Zytoplasma in B16BL6 und befinden sich neben den Zellkern im BLM Zellen (Abb. 7A). Mit ImageJ, NS1 zwischen DXR und Träger in den Lysosomen berechnet wurde (Abb. 7 b). Die Farbbilder wurden binäre (Prozess &#62; binäre &#62; stellen binäre) und mit dem NS1-Plug-in (Analyze &#62; ns1), eine NS1 Bild setzte sich aus DXR mit haben. Dadurch entsteht ein Farbbild von grün-rot-weiß mit weißen Pixel, colocalized Pixel beider Bilder. Über das Menü Punkt Prozess &#62; binäre &#62; machen Binär, die weißen Pixel werden getrennt und zu schwarzen Pixel, aus denen die Pixeldichte gemessen (Analyze &#62; Maßnahme). Danach erfolgte eine NS1 Bild zwischen diesem DXR-habe Bild und binäre Bild der lysosomalen Marker (LM) und Pixeldichte gemessen. Die NS1-Daten ist der Prozentsatz der Pixel positiv für DXR-Tat und DXR-Tat/lysosomalen Marker (Abbildung 7). Abbildung 7zeigt auch, dass die Träger, beschriftet mit CF-PE sowie wie in den Lysosomen befindet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Instrumente und Ausrüstung Setup. (A) imaging Kammer + Notwendigkeiten. 25 mm #1 Deckglas (1), Unterteil der Kammer (2), top Teil der Kammer (Platzd auf den Kopf nach unten) und o-Ring (3), Bühne Halter (4) und Dichtung Deckel (5). Maßstabsleiste: 2 cm. B) Inkubation Einheit. Beheizte Mikroskop Phase (1), fließen mit in - und out - flow für CO2 (2), eine CO-2 -Sonde (3) und ein Abschluss-Patch (4). Maßstabsleiste: 2 cm. C) Imaging Kammer in den Inkubator-Einheit, wie unter dem Mikroskop zu sehen. (D) Multi-Zeitreihen Makro. (E) Ausrüstung für die Bildgebung. Inverted Mikroskop (1), fluoreszierendes Licht (2), Computer (3), Ring-Heizung (4, einfügen) und Controller (4, Hauptfigur), CO2 Strömung Schläuche (5), CO2 -Wegeventil (6), CO2 Controller (7), CO2 Luftbefeuchter (8), O2 Ventil und Controller (9) und Bühne Temperaturregler (10). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig2.jpg"> 
Abbildung 2: der Mikroskop-Parameter im Protokoll Abschnitt 3 detaillierte schematische. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig3.jpg"> 
Abbildung 3: die kurzfristige Aufnahme von Dox und Dox-NP zu untersuchen.  BLM Zellen wurden kontinuierlich ausgesetzt Dox oder Dox-NP für 3 h und ein Zeitraffer aufgenommen. (A) noch Bilder von den Zeitraffer von Zellen mit Dox inkubiert. (B) noch Bilder von den Zeitraffer Zellen inkubiert mit Dox-NP. Maßstabsleiste = 50 µm (C) Pixel Dichte erhöhen der nuklearen DXR im Dox und Dox-NP-behandelten Zellen. (D) Pixel-Dichte-Erhöhung der zytoplasmatischen DXR im Dox und Dox-NP-behandelten Zellen. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD 3 Zellen pro Feld. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig4.jpg"> 
Abbildung 4: Untersuchung der langfristigen Aufnahme von Dox und Dox-NP in verschiedenen Zelllinien. Zellen wurden ausgesetzt Dox oder Dox-NP und 24 h später abgebildet. Bilder wurden sofort nach dem Entfernen der Drogen, mit 3 verschiedenen Gewinne. Maßstabsleiste = 50 µm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig5.jpg"> 
Abbildung 5: Untersuchung der zelluläre Aufnahme und Veröffentlichung von liposomalen Agenten. Zellen kontinuierlich Dox-NP 24 Stunden ausgesetzt waren, und ein Zeitraffer erfolgte. (A) noch Bilder von den Zeitraffer. Maßstabsleiste = 50 µm (B) Pixel Dichte erhöhen der DXR in den Zellkern und Zytoplasma. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD 3 Zellen pro Feld. (C) Bilder zeigen die Lokalisierung von DXR innerhalb der Zelle. Durchgezogene Linie: Zellmembran, gepunktete Linie: Kern. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig6.jpg"> 
Abbildung 6: Untersuchung der Lokalisierung von Drogen- und Träger in verschiedenen Zelllinien. (A) Zellen ausgesetzt Dox-NP/hat für 24 h und abgebildet wurden. Maßstabsleiste = 50 µm. (B) Zellen wurden 24 h Dox-NP/haben/CF-PE ausgesetzt und abgebildet mit niedriger Intensität, einzelne Vesikel zu unterscheiden. (C) Bright-Feld und DXR überlagern zeigt DXR in zytoplasmatischen Vesikeln (Pfeil). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig7.jpg"> 
Abbildung 7: Untersuchung der die intrazelluläre Lokalisation der Drogen- und Träger. Zellen wurden ausgesetzt Dox-NP/hast oder CF-PE/hat für 24 h und Lysosomen werden visualisiert, mit dem Leben-Zelle lysosomalen Marker (LM) in grün oder rot. (A) intrazelluläre Lokalisation der DXR und der Träger (Tat). Die Pfeile sind 3 Beispiele von DXR und hat in den Lysosomen lokalisiert. Maßstabsleiste = 50 µm. (B) Co Lokalisierung Analyse der DXR und der Träger (Tat) in Lysosomen (LM) mit ImageJ. (C) Anteil an Co Lokalisierung von DXR und der Träger in Lysosomen. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM 3 Versuche. (D) lysosomale Sequestrierung des Trägers visualisiert mit zwei verschiedenen Markern. Maßstabsleiste = 50 µm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/55405/55405mov1.jpg"> 
Film 1: im Zusammenhang mit Abbildung 3 : BLM-Zellen inkubiert mit Dox für 3 h. Zeitraffer: 19 Bilder mit einem Intervall von 10 min. Framerate: 3 fps. Maßstabsleiste = 50 µm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/Movie_1_BLM_Doxorubicin_for_3h.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum download)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/55405/55405mov2.jpg"> 
Film 2: im Zusammenhang mit Abbildung 3 : BLM-Zellen inkubiert mit Dox-NP für 3 h. Zeitraffer: 19 Bilder mit einem Intervall von 10 min. Framerate: 3 fps. Maßstabsleiste = 50 µm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/Movie_2_BLM_Doxil_for_3h.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum download)</a>
<img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/55405/55405mov3v3.jpg"> 
Film 3: im Zusammenhang mit Abbildung 5 : BLM-Zellen inkubiert mit Dox-NP für 24 h. Zeitraffer: 96 Bilder, mit einem Abstand von 15 min. Framerate: 8 Bilder pro Sekunde. Maßstabsleiste = 50 µm.<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/Movie_3,_BLM_Doxil_for_24h_correct2.a href=""></a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/Movie_3,_BLM_Doxil_for_24h_correct2.a>VI"Target ="_blank"> klicken Sie bitte hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum download).
<img alt="Movie 4" src="/files/ftp_upload/55405/55405mov4.jpg"> 
Film 4: im Zusammenhang mit Abbildung 5 : 1F6 Zellen inkubiert mit Dox-NP für 24 h Zeitraffer: 96 Bilder, mit einem Abstand von 15 min. Framerate: 8 Bilder pro Sekunde. Maßstabsleiste = 50 µm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/Movie_4_1F6_Doxil_for_24h.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum download)</a>
<img alt="Movie 5" src="/files/ftp_upload/55405/55405mov5.jpg"> 
Film 5: im Zusammenhang mit Abbildung 7 : Lysosomen von B16BL6 Zellen waren voller Flecken mit einem Leben Zellmarkierung. Zeitraffer: 10 Bilder mit einem Intervall von 10 s. Frame-Rate: 3fps. Maßstabsleiste = 50 µm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/Movie_5_B16BL6_lysotracker.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum download)</a>

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Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Live Cell Imaging ist ein mächtiges Werkzeug, um dynamische Prozesse zu visualisieren. Die Prüfung der fixen Zellen bietet nur statische Bilder, was zu Fehlinterpretationen und Verwirrung über den Prozess führen kann. Dieses Werk stellt eine Methode zur Aufnahme, Wirkstofffreisetzung und intrazelluläre Lokalisation der liposomalen Nanopartikel in lebenden Zellen zu studieren.

Verwendung von In-vitro- Live Cell Imaging zur Erkundung Chemotherapeutika geliefert durch Lipid-basierte Nanopartikel

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

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A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past decade. However, only a small number of nanomedicines have been approved for clinical use, whereas the majority of nanomedicines under clinical development have produced disappointing results. One major obstacle to the successful clinical translation of new cancer nanomedicines is the lack of an accurate understanding of their in vivo performance. This article features a rigorous procedure to characterize the in vivo behavior of nanomedicines in tumor-bearing mice at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels via the integration of positron emission tomography-computed tomography (PET-CT), radioactivity quantification methods, flow cytometry, and fluorescence microscopy. Using this approach, researchers can accurately evaluate novel nanoscale formulations in relevant mouse models of cancer. These protocols may have the ability to identify the most promising cancer nanomedicines with high translational potential or to aid in the optimization of cancer nanomedicines for future translation.

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

The poor understanding of the in vivo performance of nanomedicines stymies their clinical translation. Procedures to evaluate the in vivo behavior of cancer nanomedicines at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels in tumor-bearing immunocompetent mice are described here. This approach may help researchers to identify promising cancer nanomedicines for clinical translation.

Ein umfassendes Verfahren zur Bewertung der<em&gt; In Vivo</em&gt; Performance von Krebs Nanomedizin

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past ...

Forschung

Krebsforschung

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Evaluation von Nanopartikel-Aufnahme in Tumoren in Echtzeit über Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Medizin

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over the past decade, new and innovative technologies have greatly enhanced the practicality of live-cell imaging. Cells can now be kept in focus and continuously imaged over several days while maintained under 37 &#176;C and 5% CO2 cell culture conditions. Moreover, multiple fields of view representing different experimental conditions can be acquired simultaneously, thus providing high-throughput experimental data. Live-cell imaging provides a significant advantage over fixed-cell imaging by allowing for the direct visualization and temporal quantitation of dynamic cellular events. Live-cell imaging can also identify variation in the behavior of single cells that would otherwise have been missed using population-based assays. Here, we describe live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel. We demonstrate methods to visualize whether mitotically arrested cells die directly from mitosis or slip back into interphase. We also describe how the fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator (FUCCI) system can be used to assess the fraction of interphase cells born from mitotic slippage that are capable of re-entering the cell cycle. Finally, we describe a live-cell imaging method to identify nuclear envelope rupture events.

Live-cell imaging provides a wealth of information on single cells or whole populations that is unattainable by fixed cell imaging alone. Here, live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel are described.

Langfristige Leben-Cell Imaging zu Zelle Schicksal als Reaktion auf Paclitaxel bewerten

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Viral Nanopartikel für<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Biotechnik

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

Live-Imaging of Drug Responses in der Tumor-Mikroumgebung in Mausmodellen von Brustkrebs

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluoreszenz-Abschrecken eines Liposomenverkapseltes NIR-Fluorophore als Instrument zur<em&gt; In-vivo-</em&gt; Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

Feste Lipidnanopartikel (SLN) für die intrazelluläre Targeting-Anwendungen

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

Super-Resolution Imaging der natürlichen Killerzell Immunologische Synapse auf einem Glas-gestützten Planar Lipiddoppelschicht

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Immunologie und Infektion

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

Gezielte Plasma Membrane Lieferung eines Hydrophobic Transport Encapsulated in einem Liquid Crystal Nanoparticle Träger

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome formulation, liposomes may be preferentially taken up by different cell types in the body. This may influence the efficacy of the therapeutic particle as progression of different diseases is tissue- and cell-type-specific. In this protocol, we present one method for synthesizing and fluorescently labeling liposomes using DSPC, cholesterol, and PEG-2000 DSPE and the lipid dye DiD as a fluorescent label. This protocol also presents an approach for delivering liposomes in vivo and assessing cell-specific uptake of liposomes using flow cytometry. This approach can be used to determine the types of cells that take up liposomes and quantify the distribution and proportion of liposome-uptake across cell types and tissues. While not mentioned in this protocol, additional assays such as immunofluorescence and single-cell fluorescence imaging on a cytometer will strengthen any findings or conclusions made as they permit assessment of intracellular staining. Protocols may also need to be adapted depending on the tissue(s) of interest.

The goal of this protocol is to synthesize fluorescently-labeled liposomes and use flow cytometry to identify in vivo localization of liposomes at a cellular level.

Vorbereitung, Verabreichung und Bewertung der in vivo gewebespezifischen zellulären Aufnahme von fluoreszierenden farbstoffmarkierten Liposomen

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...

Verwendung von In-vitro- Live Cell Imaging zur Erkundung Chemotherapeutika geliefert durch Lipid-basierte Nanopartikel

Zusammenfassung

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Ein umfassendes Verfahren zur Bewertung der