We would like to thank Patrick C. Lee, Cyril Ramathal, and Saravanan Karumbayaram (SK) for their assistance in performing the iPSC derivation and characterization experiments; Aaron Cooper for performing the iPSC analysis experiments; Vittorio Sebastiano and Renee A. Reijo Pera for directing the initial reprogramming efforts; SK, William E. Lowry, Jerome A. Zack, and Donald B. Kohn for directing the establishment of the UCLA GMP facilities permitting the conversion and characterization of clinical-grade iPSCs; Gustavo Mostoslavsky for providing us with the STEMCCA polycistronic reprogramming vector. This work is based on a research collaboration with Fibrocell Science and the Clinical Investigations for Dermal Mesenchymally Obtained Derivatives (CIDMOD) Initiative to generate safe personalized cellular therapeutics. This work was supported by funding from the Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research at UCLA, The Phelps Family Foundation, Fibrocell Science, Inc., and the UCLA CTSI Scholar&#8217;s Award to JAB.

. HINWEIS: Diese Methode wurde in der Forschung im Awe et al berichteten 10 verwendet. 1. Reprogrammierung Erwachsene menschliche Fibroblasten der Haut mit STEMCCA <ol><li> Thaw Erwachsenen dermalen Fibroblasten (HUFS), Durchgang 4 oder niedriger, in einem 37 ° C Wasserbad für 2 Minuten, dabei nicht an die Spitze der Ampulle mit Wasser tauchen. </li><li> Legen Sie die 1-ml Aufschlämmung von menschlichen Fibroblasten in einen 15-ml-Erlen Fläschchen und langsam setzen 4 ml Standard HUF Medien, auf 37 ° C vorgewärmt, in einem tropfenweise Mode, zu verdünnen aus Dimethylsulfoxid (DMSO) und resuspendieren Zellen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 200 xg für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Saugt den Überstand und resuspendiere Zellen in einem ausreichenden Volumen an Medium, um eine Suspension von 100.000 Zellen / ml zu erstellen und dann 2 ml in ein Well einer Sechs-Well-Platte für 20 Minuten mit 0,2% Gelatine vorbeschichtet. HINWEIS: Eine Schwester auch mit einer gleichen Anzahl von Zellen pro Zeile und Zustand muss fo ausgesät werdenr die Zellzählung / Multiplizität der Infektion (MOI) Berechnung. </li><li> Rock the Platte hin und her und hin und her, um gleichmäßige Verteilung der Zellen. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator. </li><li> Am Tag der Weiterleitung erhalten Zellzahl (n) von der Schwester gut (e) etwa 24 Stunden nach der ersten HUF Beschichtung. </li><li> Auftauen 2 x 10 8 TU, oder gleichwertig, lentiviralen Konzentrat (STEMCCA) und mit Wasser auf 1 x 10 8 TU / ml in HUF Medien. </li><li> Transduzieren Zellen bei einer 10-MOI-Verhältnis in HUF Medien mit 8 ug / ml Transfektionsagens ergänzt. Mischungs transduziert Vertiefungen gleichmäßig beimpft und über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator. </li><li> Etwa 24 Stunden nach lentivirale Transduktion, schalten Sie das HUF Medien Standard humanen pluripotenten Stammzellen (PSC) Medium. </li><li> An den Tagen 2 bis 6, ändern Medien täglich mit menschlichen PSC Medium. </li><li> An Tag 6 der Platte zwei 0,2% Gelatine beschichteten 10-cm-Platten von1,5 bis 1,75 x 10 6 MEFs ab CF1-Mäuse in HUF Medien 12 abgeleitet. </li><li> Am Tag 7, darauf achtend, nicht mehr als 100 × g, Gebrauch Raumtemperatur Trypsin zentrifugieren, um von einem Brunnen der sechs-Well-Platte und Durchgang heben Sie den Tag ab 7 umprogrammiert Fibroblasten in einer 1.16-Verhältnis, durch Plattierung alle Zellen gleichmäßig auf zwei 10-cm-Platten, die mit frischen menschlichen PSC Medien, die am Vortag mit MEFs vergoldet wurden. Verteilen Zellaggregate im Uhrzeigersinn Spiralbewegung und in eine 37 ° C, 5% CO 2 befeuchteten Inkubator über Nacht. </li><li> Etwa 48 Stunden nach dem Aussäen der Zellen auf neu programmiert MEFs und jeden Tag danach, ändern Sie verbrachte menschlichen PSC Medien durch frische Medien. </li><li> Nach 3 bis 4 Wochen, nehmen einzelne Kolonien mit typischer ESC artige Morphologie mit einer 21-Gauge-Nadel und Subklonierung in eine 24-Well-Platte durch Einbringen von etwa 8 bis 10 Einzelteile der spezifischen Kolonien in einzelne Vertiefungen in einer 0,2% Gelatine beschichtete 24-Well-Platte Vorimpfteilchened mit MEFs ab CF1-Mäuse in der menschlichen PSC Medium abgeleitet. HINWEIS: Nach dem Ausbau des gepickten Kolonien haben die Kolonien als pluripotent von Embryoidkörperbildung und Expressionsanalyse von Pluripotenzmarker auf Proteinebene charakterisiert werden. </li></ol> 2. Vektor-Integration Standortanalyse und STEMCCA Excision <ol><li> Analysieren Sie den STEMCCA Integrationsstelle von nicht einschränkenden lineare Verstärkung PCR wie beschrieben 10. </li><li> Nach Untersuchung auf eine Integration in einen gewünschten Bereich des Genoms, Verbrauch STEMCCA durch Absaugen von der alten menschlichen ESC Medium zu gewährleisten. Dann kombinieren 45 ul konzentrierter Adeno-Cre-PuroR Virus mit 8 ug / ml Transfektionsmittel in 3 ml Standard PSC Medien für 24 Stunden. </li><li> Nach der 24-stündigen Inkubationszeit, absaugen des gemischten Virusüberstand und waschen Sie die Zellen zweimal mit menschlichen PSC Medien. Platzieren frischen menschlichen PSC Medien zusammen mit 2 &amp; mgr; g / ml Puromycin für einen Zeitraum von 5 Tagen, wenn der Medien täglichen with frisches Medium und Antibiotikum. </li><li> Nach 5 Tagen Subklon verbleibenden Kolonien mit einem 21-Gauge-Nadel auf 0,2% Gelatine beschichtete Vertiefungen in einer Platte mit 12 Vertiefungen mit MEFs aus CF1mice abgeleitet vorbeschichtet und erweitern, wie oben beschrieben. HINWEIS: Nach ausreichender Expansion eine gefrorene Lager zu erhalten, wird die Umwandlung in Feeder-freien Bedingungen erforderlich. Erwarten mindestens 95% der Stammzellkolonie Tod, da die meisten Zellen nicht erfolgreich transduziert werden und wird Antibiotikum über den Zeitraum von 5 Tagen Inkubation erliegen. Obwohl Adeno-Cre-PuroR integriert an einer 0,001 bis 1% Wirkungsgrad in Wirtschromosomen von infizierten Zellen, reexposing eine Stichprobe von Faktor freie Kolonien Puromycin 100% Zelltod zu gewährleisten wird bestätigen, keine Integration hat 13 aufgetreten. </li><li> Auftauen eines Fläschchens vorge aliquotierten Basalmembranmatrix auf Eis über einen Zeitraum von ca. 2 h (Empfehlungen des Herstellers), bis die Matrix eine Flüssigkeit und verdünnt bis zu einer Endkonzentration von 1:30 in kaltem Basalmedium. Coauf gewünschte Anzahl von Vertiefungen in einer Sechs-Well-Platte mit 1 ml pro Vertiefung. Lassen Sie sitzen bei Raumtemperatur für 1 Stunde. </li><li> Gitterschnitt (mit einer 18-Gauge-Nadel oder ein Glas oder Kunststoff &quot;tip&quot;) mindestens 20 bis 30 Kolonien, die von einem gut vorher mit MEFs beschichtet. Achten Sie darauf, zu reduzieren MEF erhebend und übertragen von der Platte. <ol><li> Generieren Sie die Schraffur-Gerät durch eine Reihe verschiedener Ansätze, von der komplizierter Heizung, ziehen, und Veredelung von Glas Pasteurpipette in offene Flamme, die einfache Verwendung einer sterilen Kunststoffpipettenspitze oder, wie in unserem Fall, 21- und / oder 18-Gauge-Nadeln. </li></ol></li><li> Saugen Sie die Matrix aus dem beschichteten auch nach der Inkubation. </li><li> Stücke der Kolonien zu entfernen durch vorsichtiges Abschaben von der alten Platte mit einem 200-ul-Pipette und vorsichtig in 3 ml frischem kombinierten Medien 1 in der Matrix beschichtete Platte zu platzieren. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2 befeuchteten Inkubator. Medienwechsel 48 h nach der Passage. </li><li> Extrahieren genomischer DNA aus postherausgeschnitten und Feeder-freien konvertierten hiPSCs, bei mehr als 80% Konfluenz, mit kommerziellen DNA-Extraktion-Kits. </li><li> Analysieren Sie für die richtige Exzision mit für exogene Integrationen des STEMCCA Lentivirus Primer: gDNA-Hendo-MycS-forward, 5&#39;-acgagcacaagctcacctct-3 &#39;; gDNA-hWPRE-Rückwärts, 5&#39;-tcagcaaacacagtgcacacc-3 &#39;. Rekonstituieren Sie lyophilisierte Primer mit PCR-grade Wasser zu einer 10-uM Stammlösung. </li><li> Führen Sie einen PCR mit den folgenden fünfstufigen Protokoll: anfängliche Denaturierung bei 95 ° C für 3 min; 35 Zyklen von jeweils der folgenden: Denaturierung bei 98 ° C für 20 sec, Primer-Annealing bei 62 ° C für 15 sec, und Verlängerung bei 72 ° C für 15 sec; gefolgt von einem einzigen Zyklus abschließenden Extension bei 72 ° C für 3 min. </li><li> Machen Sie eine 3% Agarosegel durch Auswiegen 1,5 Gramm Agarose und stellen Sie es in 50 ml 1x Tris-Acetat-EDTA-Puffer. Mikrowelle bis Agarose aufgelöst und in DNA-Gel-Färbung bei pRoper Verdünnung mischen und verzichten richtige Volumen in Gelkassette für 1 Stunde bei Raumtemperatur verfestigen. </li><li> Last 12 ul PCR-Produkt mit 3 &amp; mgr; l Ladepuffer gemischt und zu einer 3% igen Agarose-Gel. Führen Sie das Gel für 30 min bei 80 V. </li><li> Visualisieren Sie mit UV-Licht für die Abwesenheit einer Bande, die richtige Entfernung. </li></ol> 3. Die Quantifizierung der Genexpression Unterschiede mithilfe von Quantitative PCR von Pre- und Post-geschnitten hiPSCs <ol><li> Auszug Gesamt-RNA aus postherausgeschnitten und Feeder-freien konvertierten hiPSCs mit Hilfe von kommerziellen RNA-Extraktion-Kits. </li><li> Reverse Transkription und bis zu 1 ug Gesamt-RNA von mit kommerziellen Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden verankerten Oligo (dT) 18 und Random Hexamer Primer. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die PCR-Protokoll ist für die Gen-Transkripte von mehr als oder weniger als 4 kb zugeschnitten. Spezifische Primer müssen jedoch für alle Gen STEMCCA ursprünglich integriert i gemacht werdennto. </li><li> Rekonstituieren Sie den lyophilisierten Primer PCR-grade Wasser zu einer 20 uM Stammlösung. </li><li> Verwenden Sie 5 ng der Probe pro 20 ul Reaktion, die von 10 uM UPL Sonde besteht, 2x LightCycler® 480 Probes Meister, und 20 &amp; mgr; M Vorwärts- und Rückwärtsprimer. </li></ol> 4. Umwandlung in GMP-grade Bedingungen <ol><li> Am ersten Tag der Umstellung der Post-geschnitten hiPSCs über den GMP-Grade-Bedingungen, machen eine Mischung aus Medien, die aus menschlichen PSC kombiniert Medien 1 (kombinierte Medien 1) und klinischer Qualität der guten Herstellungspraxis (GMP) kompatible Medien (kombinierte Medien 2 ) in einem Verhältnis von 80:20. </li><li> Absaugen der alten kombinierten Medien ein und legen Sie 3 ml der neuen kombinierten Medien 1 und 2 vorgewärmten, im Verhältnis von 80:20. Medien ändern sich täglich für 3 Tage mit diesem bestimmten Verhältnis. Ortszellen wieder in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Am Tag 4, stellen die zusammengeführten Medien 1 und 2 in einem Verhältnis von 50:50. Absaugen des alten Mediums und replace mit vorgewärmtem Medium, mit den zusammengeführten Medien 1 und 2 im Verhältnis 50:50. Änderungsmedien für 3 Tage mit diesem bestimmten Verhältnis. Ortszellen wieder in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Am Tag 7, stellen die zusammengeführten Medien 1 und 2 in einem Verhältnis von 20:80. Absaugen des alten Mediums und Ersetzen mit vorgewärmten Medien, mit den kombinierten Medien 1 und 2 an der 20:80 Verhältnis. Änderungsmedien für 3 Tage mit diesem bestimmten Verhältnis. Ortszellen wieder in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Am Tag 10, stellen die kombinierten Medien 1 und 2 zu einem 0: 100 Verhältnis. Absaugen des alten Mediums und Ersetzen mit vorgewärmter Medien, mit den kombinierten Medien 1 und 2 an der 0: 100 Verhältnis. Ändern Medien jeden Tag an diesem bestimmten Verhältnis. Die Zellen sind nun in vollständig definiert Xeno-freien Medien. Ortszellen wieder in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator. HINWEIS: Während dieser gesamten Umwandlungsprozess wird Routine Passagieren mit einer 18-Gauge-Nadel für eine einwandfreie Kolonie Größe und Dichte zu erhalten. Plan für passaging Zellen alle 4 bis 5 Tage auf der Grundlage der Koloniegröße, Konfluenz und Differenzierung. </li><li> Coat eine Vertiefung in einer Platte mit sechs Vertiefungen mit einer definierten xeno freien Substrat, wie vom Hersteller empfohlen. </li><li> Mechanisch Gang ein konfluenter gut, bereits umgewandelt Xeno freien Medien Bedingungen, von einem Sechs-Well-Platte mit einer 18-Gauge-Nadel. Wichtig ist, legen Sie die neuen Medien (kombinierte Medien 2) auf die Zellen mit 1x ROCK-Hemmer für 1 Stunde, bevor Passage vor, eine Bedingung die Medien. </li><li> Saugen Sie das synthetische Substrat-Lösung aus der neuen Platte, dass die Zellen, die sich zu übergeben. Entfernen Sie alle Medien, die die Stammzellklumpen von der alten Platte und Transfer zum neuen Platte. </li><li> Ortszellen wieder in einem 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator für 2 Tage bei minimalem physische Störungen (idealerweise Platten, einmal im Inneren Inkubator nicht direkt in keiner Weise berührt), um maximale Befestigung ermöglichen. HINWEIS: Die Zellen werden täglich Medien Änderungen erfordern. Kontinuierliche passaging alle 4 Tage wird wichtig sein. Mit einer 21-Gauge-Nadel, Durchgang nur die Teile der Kolonien mit optimalen ESC-ähnliche Morphologie (Hoch nukleozytoplasmatischen Verhältnis). Dies wird für die richtige Auswahl hiPSC Kolonien, die gut wachsen wird und schließlich ergeben homogene Kolonien zu gewährleisten. Insgesamt Zeit, Ableitung von ESC artige Kolonien zwischen 15-20 Tage nach der ersten kombinierten Medienwechsel. </li><li> Frieren Sie sich die GMP-Grade postgeschnitten hiPSCs vom ersten Gitterschnitt all der Kolonien mit Hilfe eines 18-Gauge-Nadel. Nehmen Sie alle Teile aus mit Hilfe eines 200 ul Pipette und übertragen alle Medien mit den Zellen in ein 15 ml konischen Röhrchen und Zentrifuge bei 200 xg für 5 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Während die Zellen zentrifugiert, einen Gefriermedien, bestehend aus gleichen Volumen kalter kombinierten Medien 2 und Gefriermediums mit einer DMSO-Endkonzentration von 7,5%. </li><li> Nachdem die Zellen pelletiert, absaugen alte Medium und tropfenweise resuspendieren Sie das Pellet mit den gefrierenden Medien. Unmittelbar transfer zu Einfrierröhrchen und in einem -80 ° C Gefrierschrank gelegt. </li></ol> 5. Charakterisierung GMP-Grade-Post-geschnitten hiPSCs <ol><li> Um eine korrekte Ausdruck Pluripotenzmarker nach Umwandlung zu gewährleisten, verwenden QPCR um die Expression von Schlüssel Pluripotenzmarker (SOX2, OCT4 und NANOG) unter Verwendung der in Tabelle 1 mit den gleichen Schritten aufgeführten Primer quantifizieren wie in Schritt 3 QPCR Methoden erwähnt folgen der gleichen Schritte wie in Schritt 3 aufgeführt. </li><li> Verwendung der Durchflusszytometrie, um die nicht-menschlichen Sialinsäure Neu5Gc (N -glycolylneuraminic Säure) in Übereinstimmung mit in dem Kit enthalten sind, wie zuvor veröffentlicht am 10. Standardbedingungen zu erfassen. </li><li> Wäsche leicht die Zellkulturplatten mit Zellen unter Verwendung 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). </li><li> Distanzieren Kolonien durch Verwendung 1x Dissoziation Reagenz für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Während der 5-min Inkubationszeit von Schritt 5.4, bereiten Sie die Blockierungslösung (in bereitgestelltKit), indem sie eine 0,5% Blockierungsmittel in eiskaltem PBS. </li><li> Beschriften Sie den folgenden Satz von Rohren für die Durchflusszytometrie-Analyse: Ungefärbte; 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) DAPI; Kontroll-Antikörper 1: 200; Primärer Antikörper 1: 200; Sekundäre Antikörper 1: 200 Esel Anti-Huhn-IgG (H + L); Beispiel MEFs; Beispielpostgeschnitten Zellen auf Matrix; und Sample Postgeschnitten Zellen auf synthetische Substrat. </li><li> Sanft verdrängen Zellaggregate von Schritt 5.4 durch Zugabe von 2 ml Blockierungslösung und Transfer Inhalt in einen 15-ml konischen Röhrchen. Zentrifugieren bei 80 × g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Mit Blockierlösung und zentrifugiert wie in Schritt 5.7 fest Waschen Sie die Zellen zweimal. </li><li> Vorsichtig resuspendieren etwa 1 x 10 6 Zellen in 100 &amp; mgr; l Blockierlösung mit dem entsprechenden Verdünnungsvolumen von jedem Antikörper. Inkubiere unter leichtem Schütteln bei 4 ° C für 1 Stunde. </li><li> Wiederholen wäscht dreimal wie in Schritt 5.8. </li><li> Resuspendieren das Zellpellet in 400 ul Verdünnungspuffer Buffer (aus Kit) mit 1: 100 von DAPI für Rohre 2, 6, 7 und 8 wie unter Punkt 5.6 aufgeführt. </li><li> Stamm Zellen durch ein 40 &amp; mgr; M Sieb und Durchfluss-Zytometer laufen. </li></ol>

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	<li>Sommer, C. A., Mostoslavsky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+field+of+induced+pluripotency:+Recent+progress+and+future+challenges.">The evolving field of induced pluripotency: Recent progress and future challenges.</a> J Cell Physiol. 228, 267-275 (2013).</li><li>Lu, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defined+xeno-free+and+feeder-free+culture+system+for+the+derivation,+expansion+and+direct+differentiation+of+transgene-free+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 35, 2816-2826 (2014).</li><li>Karumbayaram, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+skin+biopsy+to+neurons+through+a+pluripotent+intermediate+under+Good+Manufacturing+Practice+protocols.">From skin biopsy to neurons through a pluripotent intermediate under Good Manufacturing Practice protocols.</a> Stem Cells Transl Med. 1, 36-43 (2012).</li><li>Mostoslavsky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+the+magic+act+of+generating+induced+pluripotent+stem+cells:+many+rabbits+in+the+hat.">Concise review: the magic act of generating induced pluripotent stem cells: many rabbits in the hat.</a> Stem Cells. 30, 28-32 (2012).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+generation+using+a+single+lentiviral+stem+cell+cassette.">Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette.</a> Stem Cells. 27, 543-549 (2009).</li><li>Somers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+transgene-free+lung+disease-specific+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+single+excisable+lentiviral+stem+cell+cassette.">Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette.</a> Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).</li><li>Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excision+of+reprogramming+transgenes+improves+the+differentiation+potential+of+iPS+cells+generated+with+a+single+excisable+vector.">Excision of reprogramming transgenes improves the differentiation potential of iPS cells generated with a single excisable vector.</a> Stem Cells. 28, 64-74 (2010).</li><li>Papapetrou, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+safe+harbors+permit+high+beta-globin+transgene+expression+in+thalassemia+induced+pluripotent+stem+cells.">Genomic safe harbors permit high beta-globin transgene expression in thalassemia induced pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29, 73-78 (2011).</li><li>Awe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+and+conversion+to+putative+clinical-grade+status.">Generation and characterization of transgene-free human induced pluripotent stem cells and conversion to putative clinical-grade status.</a> Stem Cell Res Ther. 4, (2013).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receives+FDA+Clearance+to+Begin+World's+First+Human+Clinical+Trial+of+Embryonic+Stem+Cell-Based+Therapy.">Receives FDA Clearance to Begin World's First Human Clinical Trial of Embryonic Stem Cell-Based Therapy.</a> Geron Corporation Press Release. , (2009).</li><li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. 64, 3810-383791 (2012).</li><li>Mitani, K., Kubo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+as+an+integrating+vector.">Adenovirus as an integrating vector.</a> Curr Gene Ther. 2, 135-144 (2002).</li><li>Patterson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+nature+of+human+pluripotent+stem+cell+progeny.">Defining the nature of human pluripotent stem cell progeny.</a> Cell Res. 22, 178-193 (2012).</li><li>Schroder, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+integration+in+the+human+genome+favors+active+genes+and+local+hotspots.">HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots.</a> Cell. 110, 521-529 (2002).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases.">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).</li></ol>

James A. Byrne (JAB) and Agustin Vega-Crespo receive research funding from Fibrocell Science, Inc. JAB is a scientific consultant for Fibrocell Science, Inc. No other authors have any competing interests to disclose.

Wir beschreiben eine Methode zur Ableitung Faktor freie hiPSCs und macht sie durch die Umwandlung dieser Zellen in GMP-grade Bedingungen für Downstream-Zelldifferenzierung in Zukunft Humantherapeutika klinisch relevant. Obwohl dieses Protokoll ist allgemein anwendbar auf eine Vielzahl von Zelltypen, wählten wir humane dermale Fibroblasten umprogrammieren, aufgrund der Einfachheit der Entnahme aus dem Patienten und ihre Anwendbarkeit auf personalisierten menschliche Therapeutika. Sobald Einschränkungen soweit vollstä...

Adult human cells have been shown to be capable of undergoing epigenetic remodeling and reprogramming, as a result of lentiviral-based expression of four key transcription factors4,5. An important advancement in the reprogramming field was the use of a single excisable lentiviral stem cell cassette (STEMCCA), which housed all four reprogramming transcription factors that allowed a precise stoichiometric ratio of protein expression6. Additionally, when transduced in specific multiplicity of infection ranges, STEMCCA can lead to predominantly single genomic integration events during the reprogramming process7. The introduction of an excisable version of STEMCCA, which utilizes Cre/loxP technology followed by excision of the reprogramming vector after derivation of the stem cell line, enabled factor-free human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines to be derived8. Additionally, in order to enhance therapeutic applications of hiPSCs, a novel, quick, and readily applicable methodology for good manufacturing practice (GMP)-grade cell line conversion, from xeno-containing to xeno-free conditions, needed to be implemented. Here, we discuss a relevant methodology that more precisely assesses integrated gene expression differences, specifically when integrated into an intron, and clinical-grade cell conversion into putative GMP conditions. 
Previous research has used only relatively insensitive microarray transcriptional analysis to analyze gene expression differences in integrated genes after STEMCCA transduction3,9. Here, we introduce the methodology of sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) analysis, to further examine integrated gene expression differences. Importantly, current safe-harbor criteria discard hiPSCs that have genes with viral integrations, thus limiting the applicability of these cells for downstream human cellular therapeutics9. We propose that the status quo may change with the use of fully characterized and transgene-free intronically reprogrammed hiPSCs. Additionally, we introduce a robust GMP-grade cell conversion protocol that can be readily applied to a variety of different cell types, which were originally derived under xeno-containing conditions10. This provides significant opportunities for the development of future cell reprogramming experiments, which require clinical-grade conditions to maintain human therapeutic relevance. 
These methodologies provide a foundation upon which current safe-harbor criteria may be expanded to include characterized STEMCCA reprogrammed hiPSC lines that maintain a normal gene expression profile after STEMCCA excision from the integrated intron. Also, full conversion into clinical-grade conditions, free from non-human animal antigens, will help to incorporate many more cell types, which have previously been reprogrammed and characterized only in xeno-containing conditions. These methodologies combined, are persuasive grounds for the US Food and Drug Administration (FDA) to consider expanding their limited approval from human embryonic stem cell (ESC)-based therapeutics to hiPSC-based therapeutics11. 
We recently detailed the derivation of a factor-free hiPSC line that was fully characterized and converted into putative clinical-grade conditions10. Here, we detail the protocol for hiPSC derivation by utilizing the STEMCCA lentivirus. These stem cells then undergo an excision process followed by gene expression characterization. Finally, the hiPSCs are converted over into GMP-grade conditions by a slow conversion methodology.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="521">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:140px;">Name</td>
			<td style="width:111px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:135px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:521px;">Media and reagents</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:140px;">DMEM/F12 (basal media)</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)</td>
			<td style="width:136px;">11330057</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:140px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">16000044</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:140px;">Minimum essential medium (MEM) non-essential amino acids (NEAA), 100x</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">11140050</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:140px;">Glutamax, 100x</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">35050-061</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:140px;">PenStrep, penicillin-streptomycin, 100x</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">15140-122</td>
			<td style="width:135px;">Thaw at 4 &#176;C, aliquot and store at &#8722;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:140px;">Knockout serum replacement</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">10828028</td>
			<td style="width:135px;">Thaw at 4 &#176;C, aliquot and store at &#8722;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:140px;">Trypsin/EDTA, 0.5%</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">15400-054</td>
			<td style="width:135px;">Dilute stock out to 0.05% in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:140px;">Basic fibroblast growth factor</td>
			<td style="width:111px;">GlobalStem (Rockville, MD, USA)</td>
			<td style="width:136px;">GSR-2001</td>
			<td style="width:135px;">Reconstitute to 10 &#181;g/ml stock in 0.1% bovine serum albumin dissolved in 1x PBS and store at &#8722;80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:140px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:111px;">Millipore (Billerica, MA, USA)</td>
			<td style="width:136px;">ES-007-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:140px;">Matrigel (basement membrane matrix)</td>
			<td style="width:111px;">BD Biosciences (San Jose, CA, USA)</td>
			<td style="width:136px;">356231</td>
			<td style="width:135px;">Dilute stock Matrigel vial with 10 ml of DMEM/F12 while on ice for a 1:2 dilution. Aliquot and store at &#8722;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:140px;">CELLstart (Synthetic Substrate)</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">A1014201</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:140px;">Stemmolecule Y27632</td>
			<td style="width:111px;">Stemgent (Cambridge, MA, USA)</td>
			<td style="width:136px;">04-0012-02</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:140px;">Puromycin</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">A1113802</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:140px;">LightCycler 480 Probes Master</td>
			<td style="width:111px;">Roche (Basel, Switzerland)</td>
			<td style="width:136px;">4707494001</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:140px;">ProFreeze-CDM Medium/freezing medium</td>
			<td style="width:111px;">Lonza (Basel, Switzerland)</td>
			<td style="width:136px;">12-769E</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:140px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td style="width:136px;">D8418</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:140px;">PBS</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">14190-250</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:140px;">100 BP DNA Ladder</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">15628019</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:140px;">SYBR Safe DNA Gel Stain 10000x</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">S33102</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="89">
			<td height="89" style="height:89px;width:140px;">Agarose</td>
			<td style="width:111px;">Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA)</td>
			<td style="width:136px;">161-3101</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:140px;">Gelatin, from porcine skin</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">G1890-100G</td>
			<td style="width:135px;">Make stock at 0.2% in PBS, autoclave and store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:140px;">mTeSR1</td>
			<td style="width:111px;">StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canada)</td>
			<td style="width:136px;">5850</td>
			<td style="width:135px;">Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at 4 &#176;C for up to 2 weeks.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:140px;">Stemedia NutriStem XF/FF Culture Medium</td>
			<td style="width:111px;">Stemgent</td>
			<td style="width:136px;">05-100-1A</td>
			<td style="width:135px;">Thaw at 4 &#176;C O/N, aliquot and store at 4 &#176;C for up to 2 weeks.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:140px;">Primocin</td>
			<td style="width:111px;">InvivoGen (San Diego, CA, USA)</td>
			<td style="width:136px;">ant-pm-1</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:140px;">Accutase (Dissociation Reagent)</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">A1110501</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:140px;">Donkey anti-Chicken IgG AlexaFluor 488</td>
			<td style="width:111px;">Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA)</td>
			<td style="width:136px;">703-546-155</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:140px;">Polybrene/transfection agent</td>
			<td style="width:111px;">Millipore</td>
			<td style="width:136px;">TR-1003-G</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:22px;width:521px;">Plasticware</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:140px;">12-well plates</td>
			<td style="width:111px;">VWR (West Chester, PA, USA)</td>
			<td style="width:136px;">29442-038</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:140px;">6-well plates</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:136px;">29442-042</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">10-cm plates</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">Z688819</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:140px;">18-gauge needle</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td>
			<td style="width:136px;">148265D</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:140px;">21-gauge needle</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">14-829-10D</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:22px;width:521px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:140px;">BD LSRII Flow Cytometer</td>
			<td style="width:111px;">KSystem by Nikon (Tokyo, Japan)</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:140px;">BD FACSDiva Version 6.1.3 Software</td>
			<td style="width:111px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:22px;width:521px;">Kits</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:140px;">PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">K182000</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:140px;">KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR Kit</td>
			<td style="width:111px;">KAPA Biosystems (Wilmington, MA, USA)</td>
			<td style="width:136px;">KK2601</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:140px;">High Pure RNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:111px;">Roche</td>
			<td style="width:136px;">11828665001</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:140px;">Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:111px;">Roche</td>
			<td style="width:136px;">4379012001</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:140px;">Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack Kit</td>
			<td style="width:111px;">Sialix (Newton, MA, USA)</td>
			<td style="width:136px;">Basic Pack</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:140px;">Media</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:140px;">Combined media 1</td>
			<td style="width:111px;">StemCell Technologies and Stemgent</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:135px;">Consists of equal parts mTeSR1 and Nutristem</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:140px;">Combined media 2</td>
			<td style="width:111px;">StemCell Technologies and Stemgent</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:135px;">Consists of equal parts TeSR2 and Nutristem</td>
		</tr>
		<tr height="190">
			<td height="190" style="height:190px;width:140px;">HUF Media</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:135px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium/F12 [DMEM/F12] supplemented with 10% fetal bovine serum, 1x non-essential amino acids, 1x Glutamax, and 1x Primocin</td>
		</tr>
		<tr height="253">
			<td height="253" style="height:253px;width:140px;">Human Pluripotent Stem Cell Media</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:135px;">DMEM/F12 supplemented with 20% knockout serum replacement, 1x Glutamax, 1x non-essential amino acids, 1x Primocin, 1x &#946;-mercaptoethanol, and 10 ng/ml basic fibroblast growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="2" height="22" style="height:22px;">DMEM/F12, Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium/F12; PBS, phosphate-buffered saline.</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation and characterization of a transgene-free human induced pluripotent stem cell line and conversion into defined clinical-grade conditions

Mit lentiviralen basierte Umprogrammierung Methoden kann Menschen induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) erzeugt werden. Jedoch Spuren von potenziell onkogenen Gene in aktiv transkribierten Regionen des Genoms übrigen, die ihr Potenzial für den Einsatz in menschlichen therapeutischen Anwendungen ein. Darüber hinaus nicht-menschlichen Antigene aus Stammzellen Neuprogrammierung oder Differenzierung in therapeutisch relevanten Derivate abgeleitet ausschließen diese hiPSCs können, in den menschlichen klinischen Kontext 2 verwendet. In diesem Video stellen wir ein Verfahren zur Umprogrammierung und Analyse von Faktor freie hiPSCs frei von exogenen Transgenen. Diese hiPSCs kann dann für die Genexpression Abnormalitäten im spezifischen Introns enthaltend das Lentivirus analysiert werden. Diese Analyse kann mit empfindlichen quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die einen Vorteil gegenüber weniger empfindlich Techniken bisher verwendet, um die Genexpression Differenzen 3 zu erkennen ist durchgeführt werden. Vollständige Umwandlung inklinischem guten Herstellungspraxis (GMP) Bedingungen, können die menschliche klinische Relevanz. Unser Protokoll bietet eine weitere Methode, sofern die aktuellen Safe-Harbour-Kriterien zu erweitern und umfassen Faktor freie dadurch gekennzeichnet hiPSC basierten Derivaten für den menschlichen therapeutischen Anwendungen zur Ableitung-GMP-grade hiPSCs, die keine Immunogenität Risiko durch nicht-menschlichen Antigene zu eliminieren sollte. Dieses Protokoll ist breit anwendbar auf lentiviralen umgewandelten Zellen jeglicher Art und stellt eine reproduzierbare Methode zur Umwandlung umgewandelten Zellen in GMP-grade Bedingungen.

Wir präsentieren ein Protokoll zur Ableitung klinischem Faktor freie hiPSCs mit der STEMCCA lentiviralen basierte Umprogrammierung. 1A zeigt ein repräsentatives Bild der drei vorgeschnitten hiPSC Linien nach Neuprogrammierung mit dem STEMCCA Ansatz auf einer Schicht aus MEFs. Der Hauptvorteil der STEMCCA Umprogrammierung Ansatzes liegt in der konsequenten Neuprogrammierung Erfolg von mehreren Wissenschaftlern erreicht, in verschiedenen Forschungsgruppen und Standorte. 1B stellt die Po...

Watch this Scientific Journal Video about Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions at JoVE.com

Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

We describe a protocol for deriving lentiviral-based reprogrammed and characterized factor-free human induced pluripotent stem cells and conversion into putative clinical-grade conditions.

Ableitung und Charakterisierung eines Transgens freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzelllinie und Umwandlung in Definierte Clinical-Grade Bedingungen

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic ...

derivation-characterization-transgene-free-human-induced-pluripotent

Research

JoVE Journal

Biology

7.8K Aufrufe.  University of California, Los Angeles (UCLA). We describe a protocol for deriving lentiviral-based reprogrammed and characterized factor-free human induced pluripotent stem cells and conversion into putative clinical-grade conditions. 

Serie: Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Gewinnung menschlicher embryonaler Stammzellen durch Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Forschung

Biologie

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

Isolation und Ableitung von embryonalen Maus-Keimzellen

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

Transfektion und Nucleofecting menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Effiziente Ableitung von Human Cardiac Vorstufen und Kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) in the presence of sodium butyrate 1-3. We used this method to reprogram late passage (&gt;p10) human adult fibroblasts derived from Friedreich's ataxia patient (GM03665, Coriell Repository). The reprogramming approach includes highly efficient transduction protocol using repetitive centrifugation of fibroblasts in the presence of virus-containing media. The reprogrammed hiPSC colonies were identified using live immunostaining for Tra-1-81, a surface marker of pluripotent cells, separated from non-reprogrammed fibroblasts and manually passaged 4,5. These hiPSC were then transferred to Matrigel plates and grown in feeder-free conditions, directly from the reprogramming plate. Starting from the first passage, hiPSC colonies demonstrate characteristic hES-like morphology. Using this protocol more than 70% of selected colonies can be successfully expanded and established into cell lines. The established hiPSC lines displayed characteristic pluripotency markers including surface markers TRA-1-60 and SSEA-4, as well as nuclear markers Oct3/4, Sox2 and Nanog. 
The protocol presented here has been established and tested using adult fibroblasts obtained from Friedreich's ataxia patients and control individuals 6, human newborn fibroblasts, as well as human keratinocytes.

We present a protocol for efficient reprogramming of human somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) and identification of correctly reprogrammed hiPSC by live staining with Tra-1-81 antibody.

Selektieren und Isolieren Colonies of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus adulten Fibroblasten Umprogrammierte

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

Reprogrammierung menschlichen Körperzellen in induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) mit retroviralen Vektoren mit GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

Generation of Human Cardiomyocytes: Eine Differenzierung Protokoll von Feeder-freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the heart, and improving strategies to accurately model heart disease. The potential of exploiting human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology to generate cardiac muscle &#8220;in a dish&#8221; for these applications continues to generate high enthusiasm. In recent years, the ability to efficiently generate cardiomyogenic cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) has greatly improved, offering us new opportunities to model very early stages of human cardiac development not otherwise accessible. In contrast to many previous methods, the cardiomyocyte differentiation protocol described here does not require cell aggregation or the addition of Activin A or BMP4 and robustly generates cultures of cells that are highly positive for cardiac troponin I and T (TNNI3, TNNT2), iroquois-class homeodomain protein IRX-4 (IRX4), myosin regulatory light chain 2, ventricular/cardiac muscle isoform (MLC2v) and myosin regulatory light chain 2, atrial isoform (MLC2a) by day 10 across all human embryonic stem cell (hESC) and hiPSC lines tested to date. Cells can be passaged and maintained for more than 90 days in culture. The strategy is technically simple to implement and cost-effective. Characterization of cardiomyocytes derived from pluripotent cells often includes the analysis of reference markers, both at the mRNA and protein level. For protein analysis, flow cytometry is a powerful analytical tool for assessing quality of cells in culture and determining subpopulation homogeneity. However, technical variation in sample preparation can significantly affect quality of flow cytometry data. Thus, standardization of staining protocols should facilitate comparisons among various differentiation strategies. Accordingly, optimized staining protocols for the analysis of IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, and TNNT2 by flow cytometry are described.

The article describes the detailed methodology to efficiently differentiate human pluripotent stem cells into cardiomyocytes by selectively modulating the Wnt pathway, followed by flow cytometry analysis of reference markers to assess homogeneity and identity of the population.

High Efficiency Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen zu Kardiomyozyten und Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Extraction, Labeling, and Purification of Lineage-Specific Cells from Human Antral Follicles

The activation, growth, development, and maturation of oocytes is a complex process that is coordinated not just between multiple cell types of the ovary but also across multiple points of control within the hypothalamic/pituitary/ovarian circuit. Within the ovary, multiple specialized cell types grow in close association with the oocyte within the ovarian follicles. The biology of these cells has been well described at the later stages, when they are easily recovered as byproducts of assisted reproductive treatments. However, the in-depth analysis of small antral follicles isolated directly from the ovary is not commonly carried out due to the scarcity of human ovarian tissue and the limited access to the ovary in patients undergoing assisted reproductive treatments. 
These methods for processing whole ovaries for the cryopreservation of cortical strips with the concurrent identification/isolation of ovary resident cells enable the high-resolution analysis of the early stages of antral follicle development. We demonstrate protocols for isolating discrete cell types by treating antral follicles enzymatically and separating the granulosa, theca, endothelial, hematopoietic, and stromal cells. The isolation of cells from the antral follicles at various sizes and developmental stages enables the comprehensive analysis of the cellular and molecular mechanisms that drive follicle growth and ovarian physiology and provides a source of viable cells that can be cultured in vitro to recapitulate the follicle microenvironment.

Here, we present protocols for the identification and purification of ovarian cells from antral follicles. We elaborate on methods for processing whole ovaries for the cryopreservation of cortical strips while also harvesting intact antral follicles that are treated enzymatically to liberate multiple follicle resident cell types, including granulosa, theca, endothelial, hematopoietic, and stromal cells.

Extraktion, Markierung und Reinigung von linienspezifischen Zellen aus humanen Antralfollikeln

The activation, growth, development, and maturation of oocytes is a complex process that is coordinated not just between multiple cell types of the ovary ...