Wir möchten alle Mitglieder der Stammzell und Regenerative Medizin Gruppe von der Universität Würzburg für Anregungen und Martina Gebhardt sowie Heike Arthen für hervorragende technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Deutschen Forschungsgemeinschaft DFG (ED79 / 1-2), des Bundesministeriums für Bildung und Forschung BMBF (01 GN 0813), der Bayerischen Forschungsverbund induzierten pluripotenten Stammzellen &quot;forIPS&quot; und die &quot;Stiftung Sibylle Assmus unterstützt &quot;. Abbildung 1 wurde unter Verwendung von Servier Medical Art, erhältlich von www.servier.com produziert.

Die menschlichen Fibroblasten in dieser Studie verwendet wurden aus einer Haut Stanzbiopsie nach dem Aufstehen von der Ethikkommission der Universität Würzburg, Deutschland informierte Zustimmung und ethischen Freiraum erhalten (ethische Bericht Nr: 96/11 vom 10.06.2011). 1. Stanzbiopsie <ol><li> Desinfizieren Sie die Haut des Patienten. Betäuben Haut Teil davon Biopsie aus (vorzugsweise weniger sonnenexponierten Bereich) entnommen werden mit 0,5 bis 1 ml Mepivacainhydrochlorid intrakutan und bereiten Hautbiopsie mit einer sterilen 3mm Biopsie Punsch, spülen Biopsie mit DPBS + 1 ul / 1 ml Gentamicin und entfernen Fett. Zweimal spülen Biopsie mit DPBS + Gentamicin, absaugen DPBS vollständig und Abdeckung Biopsie mit Dispase II (2,4 U / ml) und Inkubation von 16 bis 18 Stunden bei 4 ° C. </li><li> Saugen Sie Dispase vollständig, waschen zweimal mit DPBS und Epidermis mit einer Pinzette entfernen. Zweimal waschen Biopsie mit DPBS, 2 ml Collagenase Typ 2 (500 U / ml CDU), Transfer in 15-ml-Röhrchen und fügen Collagenase bis zu 5 ml Gesamtvolumen. Inkubieren für 45 min bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Zentrifuge 5 min bei 180 xg und Überstand verwerfen danach. Pellet in 10 ml DMEM-FCS-Gentamicin-Medium (10% FCS, 1 ul / ml Gentamicin) und zentrifugiert erneut 5 min bei 180 x g. Überstand verwerfen und Pellet in 1,5 ml DMEM-FCS-Gentamicin-Medien. Transfer zum adhärenten Zellkulturflasche T25 und bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Ändern Medien alle 3 Tage. </li><li> Nach etwa 2 Wochen, wenn die Zellen um Hautteile, Split-Zellen unter Verwendung von Trypsin / EDTA (0,05%) konfluent: Wasch Zellen einmal mit DPBS, inkubieren 5 min bei 37 ° C, 5% CO 2 nach Zugabe von 2 ml Trypsin / EDTA (0,05%), 2 ml DMEM-FCS-Gentamicin-Medien, Transfer zum 15-ml-Tube und Zentrifuge bei 180 xg für 5 min; Überstand verwerfen und Pellet in entsprechende Menge an DMEM-FCS-Gentamicin-Medien. </li><li> Weiter ausbauen, die Zellen, indem das Medium alle 3 rd Tag und Spaltung wie oben, wenn die Zellen konfluent beschrieben; Zugabe von Gentamycin können nach dem Durchgang 2 angehalten werden. </li><li> Vor der Verwendung der Zellen zur direkten Umwandlung Experimente, stellen Sie sicher, Mycoplasmenkontamination von Standardtests auszuschließen. </li><li> Wenn Zellen wurden erweitert, können Sie direkt die Konvertierung zu starten oder Gefrierzellen nach unten mit 10% DMSO und 90% FCS. Zellen sollten in -80 ° C für 2 Tage gelagert und dann in flüssigem Stickstoff zur Langzeitlagerung überführt. </li><li> Für die Herstellung der Umwandlung, waschen Sie die Zellen einmal mit DPBS, absaugen DPBS und fügen Sie 2,5 ml Trypsin / EDTA (0,05%). Halten für 5 Minuten bei 37 ° C, 5% CO 2. Tap Kolben sanft zu Zellen in 2,5 ml Fibroblastenmedium (DMEM incl. L-Glu + 10% FCS + 1% NEAA + 1% Natriumpyruvat) abzunehmen, resuspendieren und Transfer auf 15 ml-Röhrchen. Zentrifuge bei 180 × g für 5 min und saugt den Überstand. Die Zellen in 1 ml Fibroblasten Medien und Pipette auf und ab, um Einzelzellsuspension zu erzeugen. &lt;/ Li&gt; <li> Die Anzahl der Zellen unter Verwendung eines Fuchs-Rosenthal- oder Neubauer-Zellzählung Kammer und Platte 3 x 10 4 Zellen pro Vertiefung einer 24-Well-Platte. Inkubieren O / N bei 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> 2. Infektion von menschlichen Fibroblasten mit Sendai-Virus und Transdifferenzierung HINWEIS: Um die Sicherheit zu gewährleisten, werden die folgenden Schritte Umgang mit Virus in einer biologischen Sicherheitswerkbank und einer Steril und mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung, insbesondere einem OP-Maske, um Schleimhaut-Exposition zu verhindern durchgeführt werden. <ol><li> Schaltzellen zu 100 ul Medium Fibroblasten (Schritt 1.9). Auftauen Aliquots von Oct4-, Klf4-, Sox2- und c-myc-Sendai-Virus und Resuspendieren jedes Virus in 1 ml Fibroblastenmedium. Fügen Sie jede Virus mit einer MOI von 3 bis Zellen (Virustiter variiert von Charge zu Charge, aber man Aliquot jeder Virus kann in der Regel für die Infektion von 10 Wells einer 24-Well-Platten verwendet werden) und vorsichtig mischen. Inkubieren O / N bei 37 ° C, 5% CO 2 </sub&gt;. </li><li> Nach 24 Stunden absaugen das Medium und fügen Sie 500 ul neuroinduction Medien (1: 1 DMEM / F-12: Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 1% GlutaMAX, 10 ng / ml hLIF, 3 uM CHIR99021, 2 uM SB431542) und Kultur bei 39 ° C, 5% CO 2 von nun an. Ändern Sie jeden zweiten Tag die Medien. </li><li> Am Tag 6 nach der Infektion vorbereiten Laminin beschichteten 6-Well-Platten: Laminin verdünnt, um 1 ug / ml in DPBS, 1 ml der Lösung auf 6 Well-Platten und halten bei 4 ° C für 24 Stunden. </li><li> Am Tag 7 nach der Infektion der Zellen unter Verwendung aufgeteilt DPBS / EDTA: absaugen Medien und wasche die Zellen einmal mit DPBS, dann fügen 500 ul DPBS / EDTA und Inkubation für 10 min bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Fügen Sie 500 ul DMEM / F12 und Suspension zu entfernen von der Platte in einer 15-ml-Tube und Zentrifuge bei 180 xg für 5 min. </li><li> Saugen Sie den Überstand und das Pellet in 1,5 ml neuroinduction Medien, Teller auf Laminin beschichteten 6 Well-Platten und fügen ROCK-Inhibitor Y27632 in einem letzten concentration von 10 &amp; mgr; M zu den Zellen, der Kultur bei 39 ° C, 5% CO 2. </li><li> Ändern Sie jeden zweiten Tag die Medien. </li><li> Von Tag 14 nach der Infektion Kultur werden die Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2. Neuroepithelialen Kolonien werden nach der Infektion durch Phasenkontrastmikroskopie offensichtlich um Tag 17. Sie sollte groß genug sein, um 20 Tage nach der Infektion aufgenommen werden können. </li></ol> 3. Isolierung von mutmaßlichen INPC Kolonien <ol><li> Einen Tag vor Kommissionierung überfällt eine 48 Well-Platte mit Laminin: Laminin verdünnt, um 1 ug / ml in DPBS, fügen Sie 300 ul Lösung auf Teller und halten bei 4 ° C für 24 Stunden. Einen Tag später absaugen Laminin aus Platten und fügen Sie 200 ul neuroinduction Medien in die Vertiefungen. </li><li> Waschen Sie die 6-Loch-Platten, die die Kolonien auf einmal mit DPBS abgeholt und 2 ml DPBS pro Vertiefung 6 Well-Platte. Wählen Sie die Kolonien mechanisch: kratzen Sie an Kolonien mit einer dünnen Nadel in der umgebenden Zellen loszuwerden; stellen Sie die 2001; l Pipetman auf 50 &amp; mgr; und wählen Sie die Kolonien unter Verwendung der jeweiligen Pipettenspitzen. </li><li> Übertragen Sie jede eine Kolonie in eine Vertiefung einer Laminin beschichteten 48-Well-Platte und erzeugen eine Einzelzellsuspension mechanisch durch Auf- und Abpipettieren 10 mal. Hinzuzufügen ROCK Inhibitor Y27632 in einer Endkonzentration von 10 &amp; mgr; M zu den Zellen. </li><li> Wachsen die Zellen auf 48-Well-Platte bei 37 ° C, 5% CO 2 für 2 Tage. Ändern Sie die Medien jeden zweiten Tag, bis die Zellen 80 zu erreichen - 90% Konfluenz (ca. 3 -. 4 Tage). </li></ol> 4. Ausbau und Kryokonservierung von iNPCs <ol><li> Passagieren und Ausbau der iNPCs <ol><li> Saugen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit DPBS. Saugen Sie das DPBS und fügen Sie 200 ul DPBS / EDTA und Inkubation für 10 min bei 37 ° C, 5% CO 2, fügen Sie 200 ul DMEM / F12 und Suspension zu entfernen von der Platte in einer 15 ml Tube, Zentrifuge bei 180 xg für 5 min . </li><li> Saugt den Überstand und das Pellet in 0,5 ml Neuroinduction Medien (Schritt 2.2), Platte auf Laminin-beschichtete 12-Well-Platten und fügen ROCK Inhibitor Y27632 in einer Endkonzentration von 10 &amp; mgr; M zu den Zellen, der Kultur bei 37 ° C, 5% CO 2. Nachdem die Zellen 80 zu erreichen - 90% Konfluenz sie entweder weiter ausgebaut oder gefroren sich wie folgt sein. </li></ol></li><li> Einfrieren von iNPCs <ol><li> Saugen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit DPBS. Saugen Sie die DPBS und fügen Sie 300 ul DPBS / EDTA und Inkubation für 10 min bei 37 ° C, 5% CO 2, fügen Sie 300 ul DMEM / F12 und Suspension zu entfernen von der Platte in einer 15 ml Tube, Zentrifuge bei 180 xg für 5 min. </li><li> Saugt den Überstand und das Pellet in 0,5 ml handelsüblicher NSC Einfriermedium. Transfer Suspension auf das Einfrieren Fläschchen und in Zell-Gefrierbehälter setzen. Bei -80 ° C für 2 Tage, dann in flüssigen Stickstoff über für langfristige Lagerung. </li></ol></li></ol> 5. Differenzierung iNPCs <ol><li> Differenzierung gegenüber Neuronal-Linie <ol><li> Kultur Zellen auf Laminin-beschichteten Platten, wie oben beschrieben. Verändern Medien neuro diff-Medium (DMEM / F-12, 1x N2, 1x B27, 300 ng / ml cAMP, 200 uM Vitamin C, 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF), wenn die Zellen bei etwa 70% konfluent. Ändern Medien jeden zweiten Tag für drei Wochen. Nicht spalten Zellen während der Differenzierung. </li><li> Nach drei Wochen sollte die Zellen neuronalen Marker TuJ1 auszudrücken. Um reifer Neuronen gewinnen und neuronale Subtypen weiter Differenzierung bis zu 3 Monaten. </li></ol></li><li> Differenzierung gegenüber Gliazellen Abstammung <ol><li> Verändern Medien glial Induktionsmedium (1: 1 DMEM / F-12: Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 10 &amp; mgr; M β-Mercaptoethanol, 100 &amp; mgr; M nicht-essentiellen Aminosäuren, 1,5 mM L-Glutamin, 5 ug / ml Insulin, 40 ng / ml T3) mit 20 ng / ml EGF, um die Differenzierung in glialen Vorläuferzellen zu induzieren. Entfernen Sie die Hälfte der Medien und ersetzen durch frisches Medium jeden zweiten Tag für ca. 2 Wochen. Während dieser Zeit sollten die Zellen aufgeteilt werden1: 3 in Gegenwart von 10 uM ROCK Inhibitor Y27632 bei 100% Konfluenz erreicht wird. </li><li> Nach 2 Wochen differenzieren Zellen weiter in Astrozyten: Wenn Zellen nahezu konfluenten Wechselmedien zu kommerziellen verfügbar Astrozyten Medien, ändern Medien jeden zweiten Tag. Nach ca. 7 Tagen Zellen beginnen, Astrozyten Marker (zB GFAP) zum Ausdruck bringen. Wenn Zellen 100% konfluent während der Differenzierung Protokoll, teilen Sie sie in einem Verhältnis 1: 2 in Gegenwart von 10 &amp; mgr; M ROCK-Inhibitor Y27632. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Hier zeigen wir die Isolierung und direkte Umwandlung von menschlichen Fibroblasten in erweiterbaren Transfreien neuralen Vorläuferzellen und deren differenzierte Nachkommen als vermeintlichen Grundlage für Zell-Ersatz-Therapie oder eine Anwendung in Arzneimittel-Screening-Analysen. Direkte Linie Umwandlung von Körperzellen in NPCs wurde von Zwangs Ausdruck der linienspezifischen Transkriptionsfaktoren 26,33,34 erreicht. Dennoch wird in vielen Fällen fötalen Fibroblasten wurden zur Trans Experimente <sup...

Im Jahr 2006 Yamanaka und Kollegen zum ersten Mal zeigen, könnte die Möglichkeit der Reprogrammierung von somatischen Zellen in einem pluripotenten Zustand 1. Diese Dedifferenzierung wurde durch Überexpression von vier Transkriptions Oct4, Sox2, Klf4 und c-Myc in murinen Fibroblasten erreicht Faktoren. Die erzeugten sogenannten induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) zeigen funktionale Äquivalenz zu embryonalen Stammzellen (ESC) und können so in alle Zelltypen des erwachsenen Organismus differenziert werden. Ein Jahr später Umprogrammierung zu iPSCs könnte auch für die menschliche Fibroblasten 2 erreicht werden. Experimente in Tiermodellen zeigen, dass iPSC abgeleiteten Zellen können allgemein zur Zellersatztherapie, beispielsweise bei der Parkinson-Krankheit (PD) 3-5 verwendet werden. Jedoch einige Einschränkungen bei der Verwendung von iPSCs assoziiert stellen Hindernisse für die volle Verwirklichung der ihr therapeutisches Potential. Zunächst Reprogrammierung von Zellen in einem pluripotenten Zustand und anschließendeQualitätskontrolle ist in der Regel ein zeitaufwendiger und ineffizienter Prozess was in umfangreichen und damit kostspielige Zellkulturverfahren. Zweitens müssen iPSCs in den gewünschten Zelltyp von Interesse, bevor die Biomedizin mit der Wahrscheinlichkeit des Rest pluripotenten Zellen in differenzierten Bevölkerung wieder unterscheiden birgt eine bedeutende tumorerzeugenden Potential und zeigt somit ein hohes Risiko nach Zelltransplantation 6. Drittens wird die Umprogrammierung in der Regel durch die Induktion der Umprogrammierung Faktoren Lenti- oder retroviralen Infektion erzielt. Die Integration dieser Viren in das Wirtsgenom vielleicht Insertionsmutagenese und / oder unkontrollierte Reaktivierung der Transgene 7,8 führen. Nicht-integrative Systeme entwickelt worden, um die Umprogrammierung Faktoren liefern an Zielzellen, die das Risiko einer Insertionsmutagenese und Transgen Reaktivierung zu minimieren. Beispiele für diese transgene freie Ansätze sind die Reprogrammierung von Zellen unter Verwendung von nicht-IntegrationAdeno oder Sendaivirus 9,10, auf DNA basierende Vektoren 11 oder die Anwendung von DNA-freien Verfahren, wie Transfektion von synthetischer mRNA 12 oder Transduktion von rekombinanten Proteinen 13,14. Ein weiteres vielversprechendes Verfahren für die Ableitung von Transgen freien iPSC ist die Verwendung von loxP-modifizierten lentiviralen Umprogrammierung Konstrukten und anschließendem Löschen von Transgenen unter Verwendung des Cre-loxP DNA Rekombinationssystem 15,16. Ein einfacher Ansatz für die Nervenzellen zu erzeugen, für Zellersatztherapie stellt direkte Umwandlung von Fibroblasten in post-mitotischen Neuronen 17-20. Vierbuchen et al. Berichteten, dass die Überexpression von Transkriptionsfaktoren ASCL1, BRN2 und Myt1l resultiert in der Erzeugung von 20% Neuronen aus Mäusefibroblasten 17. Im Jahr 2011 konnte gezeigt werden, dass die gleichen drei Transkriptionsfaktoren in Kombination mit Überexpression von NeuroD1 ermöglichen Transdifferenzierung von menschlichen Fibroblasten in neurons 19. Menschen verursachten Nervenzellen könnten auch durch Überexpression von ASCL1 und Ngn2 unter dual SMAD- und GSK3β- Hemmung 20 erzeugt werden. Bemerkenswert ist, erzeugt direkte Umwandlung von Fibroblasten in Neuronen eine nicht-proliferative, post-mitotischen Zellpopulation, die keine weitere Expansion und Biobanken zulässt. Vor kurzem wurde die direkte Umwandlung von Fibroblasten in einer proliferierenden neuronalen Stammzellen / Vorläuferzellpopulation 21-26 berichtet. Aus Gründen der Klarheit werden alle diese Zelltypen als induzierte neurale Vorläuferzellen (iNPCs) die in diesem Bericht genannt werden. Han et al. Überexprimiert Brn4, Sox2, c-Myc und Klf4 zu iNPCs generieren. Wie ihre neuronalen Stammzellen Amtskollegen aus entweder primäre Gewebe oder pluripotenten Zellen abgeleitet sind diese iNPCs tripotential und könnte in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten 21 unterschieden werden. Unsere Gruppe berichtete eine etwas andere Umwandlung Protokoll mit Überexpression von Sox2, Klf4Und c-Myc und induzierte Oct4-Expression für nur 5 Tage. Mit diesem Ansatz konnten wir stabil wuchernden iNPCs aus murinen embryonalen und adulten Fibroblasten, die komplette Silencing Exponat des Reprogrammierungsfaktoren 22 zu erzeugen. Im Gegensatz zu iPSCs, weiß iNPCs keine tumorigene Potential zeigen nach der Transplantation 27. Wir verwendeten erfolgreich in einem Tiermodell der Demyelinisierung, Myelin-defizienten Ratten Zellen umgewandelt, die belegen, dass iNPCs sind klinisch nützlich 22. Bis dahin könnte NPCs nur aus pluripotenten Stammzellen oder primären Nervengewebe 28-32 erzeugt werden. iNPCs stabil expandierbaren Zellen, kryokonserviert und sind in der Lage, sich in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten differenzieren können. Große Anstrengungen wurden unternommen, um die direkte Umwandlung Protokoll von Maus, menschliche Zellen 23,26,33,34 anzupassen. Im Jahr 2012 wurde veröffentlicht, dass die Überexpression des einzigen Faktor Sox2 in Fibroblasten ist ausreichend, um Maus und des Menschen iNPCs erzeugen <sup&gt; 33. Die Autoren berichteten Generation der Menschen iNPCs aus fötalen Vorhautfibroblasten und charakterisiert sie durch Färbung gegen Sox2 und Nestin. Jedoch sind die Zielzellen für die Umprogrammierung verwendet einen sehr speziellen Zelltyp, der nicht zur Verfügung stehen wird in der klinischen Praxis, und es gab keine funktionelle Charakterisierung von umgerechnet Zellen durch Transplantation in einem Tiermodell durchgeführt. Eine neuere Publikation beschreibt die Erzeugung von neuronalen Vorläuferzellen beschränkt aus humanen fötalen Fibroblasten durch Überexpression von Sox2, c-Myc und entweder BRN2 oder Brn4 34. Die erzeugten Zellinien zeigten Selbsterneuerungskapazität und könnte in verschiedene Arten von Anschluß Neuronen differenzieren. Jedoch ist die Verwendung von fötalen Fibroblasten ungünstig, da diese Zellen aus heterogenen Ursprungs und man kann die Anwesenheit von restlichem zB Neuralleiste Stammzellen in den Zubereitungen nicht ausschließen. Im Jahr 2014, Zhu et al. Berichteten über die direkte Umwandlung von erwachsenen Menschen und neoNatal Fibroblasten in tripotential neuralen Vorläuferzellen durch die Überexpression von Sox2 mit Oct4 oder Oct4 allein und Zugabe kleiner Moleküle an die Zellkulturmedien. Bemerkenswert ist, auf der Grundlage ihrer Studien Sox2 allein war nicht ausreichend, um direkte Umwandlung 26 induzieren. In jüngerer Zeit, Lu et al. Berichteten, dass die Überexpression des Yamanaka Faktoren Oct4-, Sox2-, Klf4-, c-Myc durch Sendai-Virus für 24 h und anschließende Inaktivierung des Virus durch die erhöhte Temperatur resultiert in der Erzeugung von expandierbaren tripotential neuronalen Vorläuferzellen 23. Hieraus folgt, dass die für den menschlichen Zellen veröffentlichten Umrechnungs Protokolle bisher gemeinsam haben, die Überexpression von mindestens einem oder mehreren der Yamanaka Faktoren, oft in einer fristgerechten Art und Weise beschränkt, gibt es keine klare Angabe der minimal molekularen Faktoren notwendig, um zu fahren Direkt Umwandlung in iNPCs. Die rechtzeitige beschränkt die Überexpression von Oct4 entweder durch genetische Mittel, Transfektion mit synthetischer mRNA, oder cell-permeierenden Protein zusammen mit konstitutive Expression Sox2, Klf-4 und c-Myc nicht in stabilen humanen INPC Leitungen führen vor. Somit ist die Anwendung von Sendai-Virus, um alle Yamanaka Faktoren überexprimiert und rechtzeitig zu beschränken ihre Tätigkeit durch Hitze-Inaktivierung des Virus 23 zusammen mit optimierten neuronalen Medien Induktionsbedingungen 22,31 stellt die bevorzugte Strategie so weit. Mehrere Studien zeigen, die zelluläre Funktion von NSCs oder deren Gegenstücken unterschieden in verschiedenen Tierkrankheitsmodellen. Neuralen Vorläuferzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen wurden in Maus-Modellen der neuroinflammatorischen Erkrankung Multiple Sklerose 35,36 verpflanzt worden. Die Anwendbarkeit hES-abgeleiteten neuralen Vorläuferzellen in EAE (experimentelle Autoimmun-Enzephalomyelitis) -mice wurde zuerst im Jahr 2008 35 gezeigt. Multipotenten neuralen Vorläuferzellen wurden in den Ventrikeln des Gehirns der Maus injiziert, und die Transplantationsergebnisbei der Verringerung der klinischen Anzeichen von EAE ed. Kim et al. Erzeugten oligodendroglial Vorstufen von HES-Zellen und in EAE-Mäuse transplantiert diejenigen intracerebroventricularly. Obwohl Transplantate nicht für mehr als 10 Tage überleben, Mäuse zeigten eine signifikante Verbesserung der neurologischen Funktion und Reduktion proinflammatorischer Immunzellen in der weißen Substanz 36. Stammzelltherapie wurde auch für vorklinische Targeting der Parkinson-Krankheit als NSC erfolgreich für die jeweiligen Tiermodellen eingesetzt werden angewendet. Hierzu wurden Vorläuferzellen entweder aus fötalem Hirngewebe 37 aus pluripotenten Stammzellen 38-40 oder mesenchymalen Stammzellen 41 verwendet wurden, unterschieden, abgeleitet. Im Jahr 2012 haben wir gezeigt, dass der Maus iNPCs können Proteolipidprotein, das Hauptmyelinprotein-Komponente, nach der Transplantation in das Gehirn von Myelin-defizienten (md) Ratten 22 zu produzieren. Zu dieser Proof-of-principle experiment das therapeutische applicabilkeit von iNPCs wurde zunächst bewährte und bald von einer anderen Studie 32 bestätigt. , Das volle Potential der Verwendung menschlicher iNPCs bleibt, erkundet zu werden. Hier zeigen wir eine robuste und integrierten Verfahren (i) Gewinnung menschlicher Primärzellen von erwachsenen Patienten mittels Hautbiopsie, (ii) die direkte Umwandlung von menschlichen Fibroblasten in einer neuralen Vorläuferzustand und (iii) die Fähigkeit der iNPCs in neuronalen unterschieden und Glia-Linien. Die Verwendung dieses Protokoll wird dazu beitragen, für therapeutische Anwendungen beschleunigen Generation von autologen menschlichen Zellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Astrocyte media</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td align="right">1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch</td>
			<td>pfm medical</td>
			<td align="right">48301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Axon medchem</td>
			<td align="right">1386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type2</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>PAN&#160;</td>
			<td>P10-032100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Roth</td>
			<td align="right">4720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHG0313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td align="right">50115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP-antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hLIF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Seralab</td>
			<td>GEM-700-112-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67-antibody</td>
			<td>NeoMarkers</td>
			<td>RM-9106-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin-antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSC freezing media</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oct4-antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc9081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax6-antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>PRB-278P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>inh-sb43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sendai virus: CytoTune Sendai Reprogramming Kit</td>
			<td>&#160;LifeTechnologies</td>
			<td>A1378001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumpyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox1-antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox2-antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB2018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-205725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUJ1-antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>CAS 146986-50-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td align="right">21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation of adult human fibroblasts and their direct conversion into expandable neural progenitor cells

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) aus adulten Hautfibroblasten und nachfolgende Differenzierung in somatische Zellen bietet faszinierende Perspektiven für die Ableitung von autologen Transplantaten, die Histocompatibility Barrieren zu umgehen. , Die Progression durch einem pluripotenten Zustand und anschließende vollständige Differenzierung in die gewünschten Linien bleibt jedoch ein Hindernis für die klinische Umsetzung von iPS-Technologie wegen der damit verbundenen neoplastischen Potential und genomische Instabilität. Vor kurzem haben wir und andere zeigten, dass Körperzellen kann nicht nur in iPSCs sondern auch in verschiedene Arten von multi somatischen Stammzellen mit definierten Faktoren, wodurch Umgehung Progression durch den pluripotenten Zustand umgewandelt werden. Insbesondere die direkte Umwandlung von menschlichen Fibroblasten zu induzierten neuronalen Progenitorzellen (iNPCs) kündigt die Möglichkeit eines neuen autologen Zellquelle für verschiedene Anwendungen, wie beispielsweise Zell-Ersatz, Krankheitsmodelleund Wirkstoff-Screening. Hier beschreiben wir die Isolierung von adulten humanen primären Fibroblasten durch Hautbiopsie und deren effiziente direkte Umwandlung in iNPCs durch rechtzeitige beschränkte Expression von Oct4, Sox2, Klf4, sowie c-Myc. Sox2-positive neuroepithelialen Kolonien erscheinen nach 17 Tagen der Induktion und INPC Linien effizient durch monoklonale Isolation und Expansion geschaffen werden. Genaue Einstellung der virale Multiplizität der Infektion und Ergänzung Leukämiehemmfaktor während der Induktionsphase stellen kritische Faktoren Umwandlungswirkungsgrade von bis zu 0,2% zu erreichen. Bisher konnte patientenspezifischen INPC Linien für mehr als 12 Durchgänge expandiert werden und zeigen morphologische und molekulare Merkmale von neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen, wie die Expression von Nestin und Sox2 gleichmäßig. Die INPC Linien können in Neuronen und Astrozyten differenziert werden, wie durch Färbung gegen TuJ1 und GFAP bzw. beurteilt. Zusammenfassend haben wir ein robustes Protokoll für die Ableitung und dire meldenct Umwandlung von menschlichen Fibroblasten in stabiler Weise erweiterbar neuralen Vorläuferzellen, die eine Zellquelle für biomedizinische Anwendungen, wie beispielsweise autologe neuronalen Zell-Ersatz und Krankheitsmodelle liefern könnten.

Hier stellen wir Beschreibung eines integrierten Verfahrens, das die Erzeugung von induzierten neuronalen Progenitorzellen (iNPCs) aus humanen Fibroblasten, die durch eine Stanzbiopsie von der Haut innerhalb von weniger als 8 Wochen (Figur 1) erhalten worden sind, ermöglicht. Patient-specifc iNPCs kann weiter in neuronalen und glialen Linien unterschieden werden und bergen ein enormes Potenzial für Zellersatztherapie und Krankheit Modellierung. Infektion der Fibroblasten m...

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Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen bietet faszinierende Perspektiven für die Ableitung von autologen Transplantaten. Allerdings Progression durch einem pluripotenten Zustand und mühsame Wieder Differenzierung noch behindert klinischen Übersetzung. Hier beschreiben wir die Ableitung der erwachsenen menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umsetzung in induzierten neuronalen Vorläuferzellen und die nachfolgende Differenzierung in neuronale Abstammungen.

Ableitung von Adult menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umwandlung in Erweiterbar neuronalen Vorläuferzellen

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.3K Aufrufe.  University of Würzburg.  Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen bietet faszinierende Perspektiven für die Ableitung von autologen Transplantaten. Allerdings Progression durch einem pluripotenten Zustand und mühsame Wieder Differenzierung noch behindert klinischen Übersetzung. Hier beschreiben wir die Ableitung der erwachsenen menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umsetzung in induzierten neuronalen Vorläuferzellen und die nachfolgende Differenzierung in neuronale Abstammun...

Serie: Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Zeitraffer-Live-Imaging von klonal verbundenen neuronalen Vorläuferzellen in der Entwicklung von Zebrafisch Vorderhirnneuronen

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Forschung

Neurowissenschaften

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

Neural-Colony Forming Zell-Assay: Ein Test zur Bona Fide neuralen Stammzellen aus neuralen Vorläuferzellen Discriminate

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-Cell-Imaging von Sinnesorgan Vorläuferzellen im Intact Drosophila Puppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis and enable new strategies for in vitro modeling or repairing the diseased brain. Identifying brain-resident non-neuronal cell types amenable to direct conversion into iNs might allow for launching such an approach in situ, i.e. within the damaged brain tissue. Here we describe a protocol developed in the attempt of identifying cells derived from the adult human brain that fulfill this premise. This protocol involves: (1) the culturing of human cells from the cerebral cortex obtained from adult human brain biopsies; (2) the in vitro expansion (approximately requiring 2-4 weeks) and characterization of the culture by immunocytochemistry and flow cytometry; (3) the enrichment by fluorescence-activated cell sorting (FACS) using anti-PDGF receptor-&#946; and anti-CD146 antibodies; (4) the retrovirus-mediated transduction with the neurogenic transcription factors sox2 and ascl1; (5) and finally the characterization of the resultant pericyte-derived induced neurons (PdiNs) by immunocytochemistry (14 days to 8 weeks following retroviral transduction). At this stage, iNs can be probed for their electrical properties by patch-clamp recording. This protocol provides a highly reproducible procedure for the in vitro lineage conversion of brain-resident pericytes into functional human iNs.

Targeting brain-resident cells for direct lineage-reprogramming offers new perspectives for brain repair. Here we describe a protocol of how to prepare cultures enriched for brain-resident pericytes from the adult human cerebral cortex and convert these into induced neurons by retrovirus-mediated expression of the transcription factors Sox2 and Ascl1.

Lineage-Umprogrammierung der Perizyten-abgeleiteten Zellen des erwachsenen menschlichen Gehirn in Neuronen induziert

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

Feeder freie Ableitung von Neural Crest Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Zellsortierung von Neural Stamm- und Vorläuferzellen aus dem erwachsenen Maus Subventrikularzone und Live-Bildgebung ihrer Zellzyklus Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

Entwicklung eines raffinierten Protokolls für Trans-skleralen subretinalen Transplantation von menschlichen retinalen Pigment Epithelzellen in Ratte Augen

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the roles of intrinsic vs. extrinsic mechanisms that regulate this differentiation process is a conundrum for all developmental neurobiologists. This issue is magnified for GABAergic interneurons, an incredibly heterogeneous cell population that is born from transient embryonic structures and undergo a protracted migratory phase to disperse throughout the telencephalon. To explore how different brain environments affect interneuron fate and maturation, we developed a protocol for harvesting fluorescently labeled immature interneuron precursors from specific brain regions in newborn mice (P0-P2). At this age, interneuron migration is nearly complete and these cells are residing in their final resting environments with relatively little synaptic integration. Following collection of single cell solutions via flow cytometry, these interneuron precursors are transplanted into P0-P2 wildtype postnatal pups. By performing both homotopic (e.g., cortex-to-cortex) or heterotopic (e.g., cortex-to-hippocampus) transplantations, one can assess how challenging immature interneurons in new brain environments affects their fate, maturation, and circuit integration. Brains can be harvested in adult mice and assayed with a wide variety of posthoc analysis on grafted cells, including immunohistochemical, electrophysiological and transcriptional profiling. This general approach provides investigators with a strategy to assay how distinct brain environments can influence numerous aspects of neuron development and identify if specific neuronal characteristics are primarily driven by hardwired genetic programs or environmental cues.

Challenging young neurons in new brain regions can reveal important insights into how the environment sculpts neuronal fate and maturation. This protocol describes a procedure to harvest interneuron precursors from specific brain regions and transplant them either homotopically or heterotopically into the brain of postnatal pups.

Homochronic Transplantation von Interneuron Vorstufen in frühen postnatalen Mäusegehirnen

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

Identifizieren von Zelloberflächenmarkern von primären neuralen Stamm- und Vorläuferzellen durch metabolische Kennzeichnung von Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

Umwandlung von vom Menschen induktiven Pluripotent-Stammzellen (iPSCs) in funktionale Wirbelsäulen-und Krankheitsanleitungsneuronen mit PiggyBac-Vektoren

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...