We would like to thank Patrick C. Lee, Cyril Ramathal, and Saravanan Karumbayaram (SK) for their assistance in performing the iPSC derivation and characterization experiments; Aaron Cooper for performing the iPSC analysis experiments; Vittorio Sebastiano and Renee A. Reijo Pera for directing the initial reprogramming efforts; SK, William E. Lowry, Jerome A. Zack, and Donald B. Kohn for directing the establishment of the UCLA GMP facilities permitting the conversion and characterization of clinical-grade iPSCs; Gustavo Mostoslavsky for providing us with the STEMCCA polycistronic reprogramming vector. This work is based on a research collaboration with Fibrocell Science and the Clinical Investigations for Dermal Mesenchymally Obtained Derivatives (CIDMOD) Initiative to generate safe personalized cellular therapeutics. This work was supported by funding from the Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research at UCLA, The Phelps Family Foundation, Fibrocell Science, Inc., and the UCLA CTSI Scholar&#8217;s Award to JAB.

NOTA: Este método foi utilizado na pesquisa, publicada no incrédulo et al 10.. 1. Reprogramação Adulto Human dérmica fibroblastos com STEMCCA <ol><li> Fibroblastos dérmicos humanos (adultos Descongelar HUFS), passagem 4 ou inferior, num banho de água a 37 C ° durante 2 min, tomando cuidado para não mergulhar a parte superior do frasco com água. </li><li> Colocar a suspensão de 1 ml de fibroblastos humanos para um frasco cónico de 15 ml e colocar-se lentamente 4 ml de meio de florins padrão, pré-aquecido a 37 ° C, de uma forma gota a gota, para diluir a sulfóxido de dimetilo (DMSO) e suspender novamente as células. </li><li> Centrifuga-se o frasco a 200 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e re-suspender as células num volume adequado de meios para criar uma suspensão de 100.000 células / ml e, em seguida, adicionar 2 ml para um poço de uma placa de seis poços, pré-revestidos durante 20 min com 0,2% de gelatina. NOTA: A irmã bem com igual número de células por linha e condição precisa ser semeado for a contagem de células / multiplicidade de infecção de cálculo (MOI). </li><li> Rocha lado da placa para o lado e para trás e para distribuir uniformemente as células. Incubar durante a noite a 37 ° C, 5% de CO 2, num incubador humidificado. </li><li> No dia da transdução, obter a contagem de células (s) a partir da irmã poço (s) de aproximadamente 24 h após o plaqueamento inicial florins. </li><li> Descongelar 2 x 10 8 TU, ou, concentrado lentivírus equivalente (STEMCCA) e diluir a 1 x 10 8 TU / ml em meio HUF. </li><li> Transduzir células em uma relação de 10-MOI em meios de florins suplementado com 8 ug / ml de agente de transfecção. Misturar uniformemente poços transduzidos e incubar durante a noite a 37 ° C, 5% de CO 2, num incubador humidificado. </li><li> Cerca de 24 horas após a transdução de lentivírus, alterar a mídia HUF a célula-tronco pluripotentes humanas (PSC) médio padrão. </li><li> Nos dias 2 a 6, mudar media diária com meio PSC humano. </li><li> No dia 6, dois placa 0,2% placas revestidas com gelatina de 10 cm de1,5-1,75 x 10 6 MEFs derivadas de ratinhos CF1 em media 12 florins. </li><li> No dia 7, tendo o cuidado de não mais do que a centrifugação de 100 x g, temperatura ambiente utilização de tripsina para retirar os fibroblastos reprogramadas dia 7 de um poço da placa de seis poços e passagem a uma razão 1:16, por plaqueamento de todas as células uniformemente entre duas placas de 10 cm, com a mídia PSC humano fresco, que foram semeadas com MEFs no dia anterior. Distribuir os agregados de células num movimento em espiral no sentido horário e no lugar de uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO 2 humidificado incubadora durante a noite. </li><li> Cerca de 48 horas após a semeadura das células reprogramadas para MEFs e todos os dias a partir daí, mudar para fora da mídia PSC humanos gastos com meios frescos. </li><li> Após 3 a 4 semanas, escolher colónias individuais com morfologia típica CES como com uma agulha de calibre 21 e subclonar-se em um prato de 24 poços colocando aproximadamente 8 a 10 partes individuais de colónias específicas em poços individuais de uma solução a 0,2% de gelatina-revestido placa de 24 poços de pré-lançamentoed com MEFs derivadas de ratinhos CF1 em meio PSC humano. NOTA: Após a expansão das colônias escolhidas, as colônias têm de ser caracterizado como pluripotentes por formação de corpo embryoid e análise de marcadores de pluripotência expressão ao nível da proteína. </li></ol> 2. Vector Integração Análise Site e STEMCCA Excisão <ol><li> Analisar o local de integração STEMCCA por amplificação linear não restritiva de PCR tal como descrito 10. </li><li> Depois de ensaiar a assegurar uma integração numa área desejada do genoma, consumo STEMCCA fora, aspirando o meio de ESC humano de idade. Em seguida, combinar 45 ul de concentrado de vírus adeno-Cre-PuroR com 8 ug / ml de agente de transfecção em 3 ml de meio de PSC padrão durante 24 horas. </li><li> Após o período de incubação de 24 horas, aspirar o sobrenadante virai misto e lavar as células duas vezes com meio de PSC humanos. Coloque frescos media PSC humanos, juntamente com 2 mg / ml ï¿½puromicina por um período de 5 dias, mudando a mídia sagacidade diáriah meios frescos e antibiótico. </li><li> Após 5 dias, subclone restantes colónias com uma agulha de calibre 21 para 0,2% de poços revestidos com gelatina, em uma placa de 12 poços pré-revestidos com MEFs derivados de CF1mice e expandir conforme detalhado acima. NOTA: Depois de expansão suficiente para se obter uma massa congelada, a conversão em condições isentas de alimentação é necessária. Espere pelo menos 95% de morte colônia de células-tronco, como a maioria das células não vai ser transduzidas com sucesso e vai sucumbir ao antibiótico durante o período de cinco dias de incubação. Embora adeno-Cre-PuroR integra a uma eficiência de 0,001-1% em cromossomas hospedeiros de células infectadas, reexposing uma amostra livre de colónias do factor-a puromicina para garantir 100% de morte celular não irá confirmar a integração ocorreu 13. </li><li> Descongelar uma ampola de matriz de membrana basal pré-aliquotado em gelo, ao longo de um período de aproximadamente 2 horas (as recomendações do fabricante), até que a matriz é um líquido e diluir para uma concentração final de 1:30 em meio basal frio. Cono número desejado de poços numa placa de seis poços com 1 ml por poço. Deixe descansar em temperatura ambiente por 1 hora. </li><li> -Cross hatch (utilizando uma agulha de calibre 18, ou um vidro ou plástico &quot;ponta&quot;), pelo menos, 20 a 30 colónias a partir de um poço revestido previamente com MEFs. Tenha o cuidado de reduzir MEF edificante e transferir de placa. <ol><li> Gerar o dispositivo de tracejado cruzado através de um número de diferentes abordagens, a partir do aquecimento mais complicados, que puxa, e acabamento de uma pipeta de Pasteur de vidro para uma chama, para o simples uso de uma ponta de pipeta de plástico estéril ou, como no nosso caso, 21- e / ou 18 de bitola agulhas. </li></ol></li><li> Aspirar a matriz do poço após incubação revestido. </li><li> Remover pedaços de colônias por raspagem suave da placa de idade, com uma pipeta de 200 mL e coloque cuidadosamente em 3 ml de mídia combinadas frescos 1 na placa revestida com matriz. Incubar durante a noite em uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2 humidificada. Troca de mídia 48 horas após passaging. </li><li> Extrai-se o ADN genómico a partir de pós-hiPSCs excisada e sem alimentação convertidos, em mais de 80% da confluência, utilizando kits de extracção de DNA comercial. </li><li> Analisar por excisão adequada com primers específicos para integrações exógenos do lentivírus STEMCCA: gDNA-Hendo-MycS-forward, 5&#39;-acgagcacaagctcacctct-3 &#39;; gDNA-hWPRE-reverse, 5&#39;-tcagcaaacacagtgcacacc-3 &#39;. Reconstituir primers liofilizados com água PCR-grade para uma solução estoque de 10 mM. </li><li> Executar uma RCP com o protocolo de cinco passos que se segue: desnaturação inicial a 95 ° C durante 3 min; 35 ciclos de cada um dos seguintes: desnaturação a 98 ° C durante 20 seg, emparelhamento de iniciador a 62 ° C durante 15 segundos, e extensão a 72 ° C durante 15 seg; seguido por um único ciclo de extensão final a 72 ° C durante 3 min. </li><li> Adicione um gel de agarose a 3% em peso a 1,5 gramas de agarose e colocando-o em 50 ml de tampão 1x Tris-acetato-EDTA. Micro-ondas até agarose é dissolvido e coloque em mancha gel DNA em pdiluição roper, misturar e dispensar volume adequado em cassete gel para solidificar durante 1 hora à temperatura ambiente. </li><li> Carga 12 uL de produto de PCR misturado com 3 ul de corante de carga em gel de agarose a 3%. Submeter o gel durante 30 min a 80 V. </li><li> Visualizar com luz ultravioleta para a ausência de uma banda que indica a excisão correcta. </li></ol> 3. A determinação quantitativa de Diferenças Gene expressão usando PCR quantitativo de Pré e Pós-hiPSCs excisadas <ol><li> Extrato de RNA total de hiPSCs pós-excisadas e livre-feeder convertidos por meio de kits de extração de RNA comerciais. </li><li> Reverse-transcrever-se a 1 ug de ARN total, utilizando-se kits comerciais, de acordo com as instruções do fabricante. Use ancorado-oligo (dT) 18 e os iniciadores de hexâmeros aleatórios. NOTA: Certifique-se de que o protocolo de PCR é adaptada para transcritos do gene de mais de ou menos de 4 kb. Primers específicos terá de ser feito para i qualquer gene STEMCCA originalmente integradonto. </li><li> Reconstituir o iniciador de PCR liofilizado com água de grau de uma solução estoque de 20? M. </li><li> Use de amostra de 5 ng por 20 ul de reacção que consiste de sonda UPL 10 uM, 2x LightCycler 480 Sondas mestre, e 20 uM iniciadores directos e inversos. </li></ol> 4. A conversão em condições GMP-grade <ol><li> No primeiro dia de transição os hiPSCs pós-extirpado durante a condições GMP grau, fazer uma mistura dos meios de comunicação que consiste em PSC humano combinado de mídia (media um combinado 1) e grau clínico boas práticas de fabrico (BPF) de mídia compatível (media combinados 2 ) a uma razão de 80:20. </li><li> Aspirar fora as velhas mídias combinadas 1 e colocar 3 ml de novos meios de comunicação combinados 1 e 2, pré-aquecido, na proporção 80:20. Mudar meios diariamente durante 3 dias com esta proporção específica. Coloque as células de volta para uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2. </li><li> No dia 4, fazer a mídia combinado 1 e 2 numa proporção de 50:50. Aspirar fora o velho médio e subste com a mídia pré-aquecido, com os meios de comunicação combinados 1 e 2, na proporção 50:50. Mudança de mídia durante 3 dias com essa relação específica. Coloque as células de volta para uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2. </li><li> No dia 7, fazer a media combinado 1 e 2 na proporção 20:80. Aspirar off do meio velho e substitua-o por meio de pré-aquecido, com os meios de comunicação combinados 1 e 2, na proporção 20:80. Mudança de mídia durante 3 dias com essa relação específica. Coloque as células de volta para uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2. </li><li> No dia 10, fazer os meios de comunicação combinados 1 e 2 em um 0: relação de 100. Aspirar off do meio velho e substitua-o por meio de pré-aquecido, com os meios de comunicação combinados 1 e 2 no 0: relação de 100. Mudança de mídia todos os dias na mesma proporção específica. As células estão agora em meio isento de xeno completamente definido. Coloque as células de volta para uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2. NOTA: Durante todo este processo de conversão, de passagens em rotina com uma agulha de calibre 18 que é necessário para manter o tamanho da colónia e densidade adequada. Plano de passaging células a cada 4 a 5 dias com base no tamanho da colónia, a confluência, e diferenciação. </li><li> Uma demão poço numa placa de seis poços com um substrato isento de xeno definido como recomendado pelo fabricante. </li><li> Passagem Mecanicamente confluente bem, já convertido em condições mídia xeno-livre, a partir de uma placa de seis bem com uma agulha de calibre 18. Importante, colocar novos media (mídia combinados 2) sobre as células com 1x inibidor ROCHA, durante 1 hora, antes de passaging a pré-condição da mídia. </li><li> Aspirar a solução de substrato sintético para fora da nova placa que as células estão a ser transferido para. Remova todas as mídias contendo os aglomerados de células-tronco a partir da placa de idade e transferir para a nova placa. </li><li> Coloque as células de volta para uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2 durante 2 dias, com um mínimo de perturbação física (de preferência placas, uma vez dentro da incubadora, não são directamente atingidas de qualquer forma) para permitir a ligação máxima. NOTA: As células exigirá mudanças mídia diárias. Passagin Continuadag cada 4 dias, será importante. Usando uma agulha de calibre 21, de passagem apenas as partes de colônias com morfologia ESC-como ótima (relação núcleo alto). Isso irá garantir seleção para colônias hiPSC adequadas que vai crescer bem e, eventualmente, produzir colônias homogêneas. Tempo total de derivação da ESC como colônias é entre 15-20 dias após a mudança de mídia combinado inicial. </li><li> Congelar para baixo as hiPSCs post extirpado GMP grau pelo primeiro cross-hatch todas as colônias, utilizando uma agulha de calibre 18. Remover todas as partes fora usando uma pipeta de 200 uL e transferir todos os meios contendo as células para um frasco cónico de 15 ml e centrifugar a 200 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Enquanto as células são centrifugação, fazer um meio de congelamento que consiste em volumes iguais de meio frio combinadas 2 e meio de congelação, com uma concentração final de DMSO de 7,5%. </li><li> Depois de células são sedimentadas, aspirar off meio de idade e gota a gota, re-suspender o pellet com a mídia de congelamento. Imediatamente transfer para frascos de congelamento e colocar em um freezer -80 ° C. </li></ol> 5. hiPSCs Caracterizar GMP-grade Post-excisadas <ol><li> Para assegurar a expressão apropriada de marcadores de pluripotência pós-conversão, uso de QPCR para quantificar a expressão de marcadores de pluripotência chave (SOX2, OCT4, e NANOG) utilizando os iniciadores listados na Tabela 1 com os mesmos passos como mencionado no passo 3. QPCR metodologias a seguir mesmos passos listados na etapa 3. </li><li> Use a citometria de fluxo para detectar o ácido não-humano siálico Neu5Gc (ácido -glycolylneuraminic N), de acordo com as condições padrão listados no kit como publicado anteriormente 10. </li><li> Lavar suavemente as placas de cultura celular com células, utilizando solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS). </li><li> Dissociar colónias usando reagente de dissociação 1x durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Durante o tempo de incubação de 5 min do passo 5.4, preparar a solução de bloqueio (fornecida emkit), fazendo um 0,5% Agente de bloqueio em PBS gelado. </li><li> Rotular o seguinte conjunto de tubos para análise de citometria de fluxo: Unstained; 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) DAPI; Anticorpo de controlo 1: 200; Anticorpo primário 1: 200; Anticorpo secundário 1: 200 de burro anti-IgG de galinha (H + L); MEFs amostra; Células pós-extirpado amostra na matriz; e células em substrato sintético Sample pós-extirpado. </li><li> Gentilmente desalojar agregados celulares a partir da etapa 5.4, adicionando 2 ml de bloquear conteúdos de solução e de transferência para um tubo cônico de 15 ml. Centrifugar a 80 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Lavar as células duas vezes com solução de bloqueio e centrifugar tal como indicado no passo 5.7. </li><li> Gentilmente re-suspender aproximadamente 1 x 10 6 células em 100 ul de solução de diluição com o volume correspondente de cada anticorpo bloqueador. Incubar, com agitação suave a 4 ° C durante 1 h. </li><li> Repetir lavagens três vezes como no passo 5.8. </li><li> Re-suspender o pellet celular em 400 mL de diluente Buffer (do kit) com 1: 100 de DAPI para tubos de 2, 6, 7 e 8, conforme listado na etapa 5.6. </li><li> Células tensão através de uma peneira de 40 mM e executado através de citometria de fluxo. </li></ol>

<ol>
	<li>Sommer, C. A., Mostoslavsky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+field+of+induced+pluripotency:+Recent+progress+and+future+challenges.">The evolving field of induced pluripotency: Recent progress and future challenges.</a> J Cell Physiol. 228, 267-275 (2013).</li><li>Lu, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defined+xeno-free+and+feeder-free+culture+system+for+the+derivation,+expansion+and+direct+differentiation+of+transgene-free+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 35, 2816-2826 (2014).</li><li>Karumbayaram, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+skin+biopsy+to+neurons+through+a+pluripotent+intermediate+under+Good+Manufacturing+Practice+protocols.">From skin biopsy to neurons through a pluripotent intermediate under Good Manufacturing Practice protocols.</a> Stem Cells Transl Med. 1, 36-43 (2012).</li><li>Mostoslavsky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+the+magic+act+of+generating+induced+pluripotent+stem+cells:+many+rabbits+in+the+hat.">Concise review: the magic act of generating induced pluripotent stem cells: many rabbits in the hat.</a> Stem Cells. 30, 28-32 (2012).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+generation+using+a+single+lentiviral+stem+cell+cassette.">Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette.</a> Stem Cells. 27, 543-549 (2009).</li><li>Somers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+transgene-free+lung+disease-specific+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+single+excisable+lentiviral+stem+cell+cassette.">Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette.</a> Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).</li><li>Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excision+of+reprogramming+transgenes+improves+the+differentiation+potential+of+iPS+cells+generated+with+a+single+excisable+vector.">Excision of reprogramming transgenes improves the differentiation potential of iPS cells generated with a single excisable vector.</a> Stem Cells. 28, 64-74 (2010).</li><li>Papapetrou, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+safe+harbors+permit+high+beta-globin+transgene+expression+in+thalassemia+induced+pluripotent+stem+cells.">Genomic safe harbors permit high beta-globin transgene expression in thalassemia induced pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29, 73-78 (2011).</li><li>Awe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+and+conversion+to+putative+clinical-grade+status.">Generation and characterization of transgene-free human induced pluripotent stem cells and conversion to putative clinical-grade status.</a> Stem Cell Res Ther. 4, (2013).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receives+FDA+Clearance+to+Begin+World's+First+Human+Clinical+Trial+of+Embryonic+Stem+Cell-Based+Therapy.">Receives FDA Clearance to Begin World's First Human Clinical Trial of Embryonic Stem Cell-Based Therapy.</a> Geron Corporation Press Release. , (2009).</li><li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. 64, 3810-383791 (2012).</li><li>Mitani, K., Kubo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+as+an+integrating+vector.">Adenovirus as an integrating vector.</a> Curr Gene Ther. 2, 135-144 (2002).</li><li>Patterson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+nature+of+human+pluripotent+stem+cell+progeny.">Defining the nature of human pluripotent stem cell progeny.</a> Cell Res. 22, 178-193 (2012).</li><li>Schroder, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+integration+in+the+human+genome+favors+active+genes+and+local+hotspots.">HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots.</a> Cell. 110, 521-529 (2002).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases.">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).</li></ol>

James A. Byrne (JAB) and Agustin Vega-Crespo receive research funding from Fibrocell Science, Inc. JAB is a scientific consultant for Fibrocell Science, Inc. No other authors have any competing interests to disclose.

Nós descrevemos uma metodologia de derivar hiPSCs livre de fatores e de fazê-los clinicamente relevante, convertendo essas células em condições GMP grau de diferenciação celular downstream em futuras terapêuticas humanas. Embora este protocolo é amplamente aplicável a uma variedade de tipos de células, optou-se por reprogramar fibroblastos dérmicos humanos, devido à facilidade de extracção a partir do paciente e a sua aplicabilidade terapêutica humana personalizados. Uma vez que as limitações forem cor...

Adult human cells have been shown to be capable of undergoing epigenetic remodeling and reprogramming, as a result of lentiviral-based expression of four key transcription factors4,5. An important advancement in the reprogramming field was the use of a single excisable lentiviral stem cell cassette (STEMCCA), which housed all four reprogramming transcription factors that allowed a precise stoichiometric ratio of protein expression6. Additionally, when transduced in specific multiplicity of infection ranges, STEMCCA can lead to predominantly single genomic integration events during the reprogramming process7. The introduction of an excisable version of STEMCCA, which utilizes Cre/loxP technology followed by excision of the reprogramming vector after derivation of the stem cell line, enabled factor-free human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines to be derived8. Additionally, in order to enhance therapeutic applications of hiPSCs, a novel, quick, and readily applicable methodology for good manufacturing practice (GMP)-grade cell line conversion, from xeno-containing to xeno-free conditions, needed to be implemented. Here, we discuss a relevant methodology that more precisely assesses integrated gene expression differences, specifically when integrated into an intron, and clinical-grade cell conversion into putative GMP conditions. 
Previous research has used only relatively insensitive microarray transcriptional analysis to analyze gene expression differences in integrated genes after STEMCCA transduction3,9. Here, we introduce the methodology of sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) analysis, to further examine integrated gene expression differences. Importantly, current safe-harbor criteria discard hiPSCs that have genes with viral integrations, thus limiting the applicability of these cells for downstream human cellular therapeutics9. We propose that the status quo may change with the use of fully characterized and transgene-free intronically reprogrammed hiPSCs. Additionally, we introduce a robust GMP-grade cell conversion protocol that can be readily applied to a variety of different cell types, which were originally derived under xeno-containing conditions10. This provides significant opportunities for the development of future cell reprogramming experiments, which require clinical-grade conditions to maintain human therapeutic relevance. 
These methodologies provide a foundation upon which current safe-harbor criteria may be expanded to include characterized STEMCCA reprogrammed hiPSC lines that maintain a normal gene expression profile after STEMCCA excision from the integrated intron. Also, full conversion into clinical-grade conditions, free from non-human animal antigens, will help to incorporate many more cell types, which have previously been reprogrammed and characterized only in xeno-containing conditions. These methodologies combined, are persuasive grounds for the US Food and Drug Administration (FDA) to consider expanding their limited approval from human embryonic stem cell (ESC)-based therapeutics to hiPSC-based therapeutics11. 
We recently detailed the derivation of a factor-free hiPSC line that was fully characterized and converted into putative clinical-grade conditions10. Here, we detail the protocol for hiPSC derivation by utilizing the STEMCCA lentivirus. These stem cells then undergo an excision process followed by gene expression characterization. Finally, the hiPSCs are converted over into GMP-grade conditions by a slow conversion methodology.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="521">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:140px;">Name</td>
			<td style="width:111px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:135px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:521px;">Media and reagents</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:140px;">DMEM/F12 (basal media)</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)</td>
			<td style="width:136px;">11330057</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:140px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">16000044</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:140px;">Minimum essential medium (MEM) non-essential amino acids (NEAA), 100x</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">11140050</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:140px;">Glutamax, 100x</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">35050-061</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:140px;">PenStrep, penicillin-streptomycin, 100x</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">15140-122</td>
			<td style="width:135px;">Thaw at 4 &#176;C, aliquot and store at &#8722;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:140px;">Knockout serum replacement</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">10828028</td>
			<td style="width:135px;">Thaw at 4 &#176;C, aliquot and store at &#8722;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:140px;">Trypsin/EDTA, 0.5%</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">15400-054</td>
			<td style="width:135px;">Dilute stock out to 0.05% in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:140px;">Basic fibroblast growth factor</td>
			<td style="width:111px;">GlobalStem (Rockville, MD, USA)</td>
			<td style="width:136px;">GSR-2001</td>
			<td style="width:135px;">Reconstitute to 10 &#181;g/ml stock in 0.1% bovine serum albumin dissolved in 1x PBS and store at &#8722;80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:140px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:111px;">Millipore (Billerica, MA, USA)</td>
			<td style="width:136px;">ES-007-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:140px;">Matrigel (basement membrane matrix)</td>
			<td style="width:111px;">BD Biosciences (San Jose, CA, USA)</td>
			<td style="width:136px;">356231</td>
			<td style="width:135px;">Dilute stock Matrigel vial with 10 ml of DMEM/F12 while on ice for a 1:2 dilution. Aliquot and store at &#8722;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:140px;">CELLstart (Synthetic Substrate)</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">A1014201</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:140px;">Stemmolecule Y27632</td>
			<td style="width:111px;">Stemgent (Cambridge, MA, USA)</td>
			<td style="width:136px;">04-0012-02</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:140px;">Puromycin</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">A1113802</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:140px;">LightCycler 480 Probes Master</td>
			<td style="width:111px;">Roche (Basel, Switzerland)</td>
			<td style="width:136px;">4707494001</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:140px;">ProFreeze-CDM Medium/freezing medium</td>
			<td style="width:111px;">Lonza (Basel, Switzerland)</td>
			<td style="width:136px;">12-769E</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:140px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td style="width:136px;">D8418</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:140px;">PBS</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">14190-250</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:140px;">100 BP DNA Ladder</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">15628019</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:140px;">SYBR Safe DNA Gel Stain 10000x</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">S33102</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="89">
			<td height="89" style="height:89px;width:140px;">Agarose</td>
			<td style="width:111px;">Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA)</td>
			<td style="width:136px;">161-3101</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:140px;">Gelatin, from porcine skin</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">G1890-100G</td>
			<td style="width:135px;">Make stock at 0.2% in PBS, autoclave and store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:140px;">mTeSR1</td>
			<td style="width:111px;">StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canada)</td>
			<td style="width:136px;">5850</td>
			<td style="width:135px;">Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at 4 &#176;C for up to 2 weeks.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:140px;">Stemedia NutriStem XF/FF Culture Medium</td>
			<td style="width:111px;">Stemgent</td>
			<td style="width:136px;">05-100-1A</td>
			<td style="width:135px;">Thaw at 4 &#176;C O/N, aliquot and store at 4 &#176;C for up to 2 weeks.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:140px;">Primocin</td>
			<td style="width:111px;">InvivoGen (San Diego, CA, USA)</td>
			<td style="width:136px;">ant-pm-1</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:140px;">Accutase (Dissociation Reagent)</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">A1110501</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:140px;">Donkey anti-Chicken IgG AlexaFluor 488</td>
			<td style="width:111px;">Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA)</td>
			<td style="width:136px;">703-546-155</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:140px;">Polybrene/transfection agent</td>
			<td style="width:111px;">Millipore</td>
			<td style="width:136px;">TR-1003-G</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:22px;width:521px;">Plasticware</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:140px;">12-well plates</td>
			<td style="width:111px;">VWR (West Chester, PA, USA)</td>
			<td style="width:136px;">29442-038</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:140px;">6-well plates</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:136px;">29442-042</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">10-cm plates</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">Z688819</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:140px;">18-gauge needle</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td>
			<td style="width:136px;">148265D</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:140px;">21-gauge needle</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">14-829-10D</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:22px;width:521px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:140px;">BD LSRII Flow Cytometer</td>
			<td style="width:111px;">KSystem by Nikon (Tokyo, Japan)</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:140px;">BD FACSDiva Version 6.1.3 Software</td>
			<td style="width:111px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:22px;width:521px;">Kits</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:140px;">PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">K182000</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:140px;">KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR Kit</td>
			<td style="width:111px;">KAPA Biosystems (Wilmington, MA, USA)</td>
			<td style="width:136px;">KK2601</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:140px;">High Pure RNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:111px;">Roche</td>
			<td style="width:136px;">11828665001</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:140px;">Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:111px;">Roche</td>
			<td style="width:136px;">4379012001</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:140px;">Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack Kit</td>
			<td style="width:111px;">Sialix (Newton, MA, USA)</td>
			<td style="width:136px;">Basic Pack</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:140px;">Media</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:140px;">Combined media 1</td>
			<td style="width:111px;">StemCell Technologies and Stemgent</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:135px;">Consists of equal parts mTeSR1 and Nutristem</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:140px;">Combined media 2</td>
			<td style="width:111px;">StemCell Technologies and Stemgent</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:135px;">Consists of equal parts TeSR2 and Nutristem</td>
		</tr>
		<tr height="190">
			<td height="190" style="height:190px;width:140px;">HUF Media</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:135px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium/F12 [DMEM/F12] supplemented with 10% fetal bovine serum, 1x non-essential amino acids, 1x Glutamax, and 1x Primocin</td>
		</tr>
		<tr height="253">
			<td height="253" style="height:253px;width:140px;">Human Pluripotent Stem Cell Media</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:135px;">DMEM/F12 supplemented with 20% knockout serum replacement, 1x Glutamax, 1x non-essential amino acids, 1x Primocin, 1x &#946;-mercaptoethanol, and 10 ng/ml basic fibroblast growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="2" height="22" style="height:22px;">DMEM/F12, Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium/F12; PBS, phosphate-buffered saline.</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation and characterization of a transgene-free human induced pluripotent stem cell line and conversion into defined clinical-grade conditions

Humanos induzida células estaminais pluripotentes (hiPSCs) pode ser gerado com metodologias de reprogramação à base de lentivírus. No entanto, os traços de genes potencialmente oncogénicos restantes em regiões activamente transcritas do genoma, limitar o seu potencial para a utilização em aplicações terapêuticas humanas 1. Além disso, os antigénios não-humanos derivados de reprogramação ou a diferenciação de células estaminais em derivados terapeuticamente relevantes impede as referidas hiPSCs de ser usado num contexto clínico humano 2. Neste vídeo, apresentamos um procedimento para a reprogramação e analisar hiPSCs livre de fator livres de transgenes exógenos. Estes hiPSCs então pode ser analisado para anormalidades da expressão do gene específico do intrão contendo a lentivírus. Esta análise pode ser realizada utilizando reacção em cadeia da polimerase sensível quantitativa (PCR), que tem uma vantagem sobre as técnicas menos sensíveis anteriormente utilizada para detectar diferenças de expressão do gene 3. Conversão completa emboas práticas de fabrico clínico-grade (BPF) condições, permite relevância clínica humana. Nosso protocolo oferece um outro que os critérios de admissibilidade atuais irão se expandir e incluir caracterizados derivados baseados em hiPSC livre de fatores para aplicações terapêuticas para-humanos decorrentes hiPSCs GMP-grade, o que deverá eliminar qualquer risco de imunogenicidade devido aos antígenos não-humanos-forneceu metodologia. Este protocolo é amplamente aplicável a lentivirais reprogramado células de qualquer tipo e não fornece um método reprodutível para a conversão de células reprogramadas em condições GMP-grau.

Apresenta-se um protocolo para derivar hiPSCs livre de factor de grau clínico usando a abordagem baseada reprogramação por lentivírus STEMCCA. A Figura 1A mostra uma imagem representativa de três linhas de pré-excisada hiPSC diferentes, depois de reprogramação com a abordagem STEMCCA sobre uma camada de MEFs. A principal vantagem da abordagem de reprogramação STEMCCA reside no sucesso reprogramação consistente conseguida por vários cientistas, em diferentes grupos de pesquisa e locais. <str...

Watch this Scientific Journal Video about Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions at JoVE.com

Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

We describe a protocol for deriving lentiviral-based reprogrammed and characterized factor-free human induced pluripotent stem cells and conversion into putative clinical-grade conditions.

Derivação e Caracterização de um free-Transgene Human Induced Pluripotent Stem Cell Line e Conversão em Definidas condições clínicas de grau

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic ...

derivation-characterization-transgene-free-human-induced-pluripotent

Research

JoVE Journal

Biology

7.8K visualizações.  University of California, Los Angeles (UCLA). We describe a protocol for deriving lentiviral-based reprogrammed and characterized factor-free human induced pluripotent stem cells and conversion into putative clinical-grade conditions. 

Vídeo: Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions