The present study was funded in part by a Research Initiation Grant (RIG) from the University of North Texas to Dr. McFarlin. The authors did not receive direct funding for the completion of this study and report no conflict of interest.

HINWEIS: Alle in dieser Methode beschriebenen Blutentnahmeverfahren wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt und von der UNT Institutional Review Board (IRB) für den Menschen zugelassen. Alle Probanden gaben schriftliche Zustimmung für die Blutentnahme, die in dem vorliegenden Verfahren verwendet wurde, um sicherzustellen, dass sie scheinbar gesunden, normalen Körpergewicht und frei von Krankheiten. 1. Reagenz Source &amp; Vorbereitung <ol><li> Verwendung CD66b-APC (Klon # G10F5; DF = 1: 50) und CD45-APCeFluor780 (Klon # 2D1, DF = 1: 50) für diesen Test. HINWEIS: Vor der Studie, CD45 und CD66b-Antikörper wurden titriert, um die optimale Verdünnung zu bestimmen, die klar aufgelöst Granulozyten (CD45 + / + 66b) von anderen Leukozyten (CD45 + / 66b-) 11. Nach Zugabe der verdünnten Antikörper zur Anfärbung der Endverdünnung im Rohr 875. </li><li> Kauf und auftauen Lager S. aureus Biopartikeln mit pHrodo roten Farbstoff markiert. Auszusetzen bei einer Konzentration von 1 mg Biopartikeln pro ml in sterilem PBS. Aliquoten verdünnten Biopartikeln und bei -20 ° C eingefroren, bis in dem Assay verwendet. </li><li> Löse Dihydroethidium (DHE), der Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid in Gegenwart von Sauerstoff-freien Radikalen (dh die oxidative burst) in einer Endkonzentration von 10 g / ml überführt wird, in DMSO. </li><li> Mischungs N-Ethylmaleimid (zur zusätzlichen Phagozytose folgenden angegebenen Assay Inkubationsdauer zu verhindern) mit steriler PBS in einer 2-Schritt-Verdünnung von 200 mg / ml und 17,5 mg / ml. In dem Assay verwendet eine Endkonzentration von 15 mM. Beim Auftauen N-Ethylmaleimid, mit einem 37 ° C-Heizblock, da die N-Ethylmaleimid nicht in Lösung bleiben. </li><li> Nach dem Schlussfixierungsschritt verwenden 7AAD zu Kern-DNA zu färben. Vor der Zugabe verdünnter Lager 7AAD 1:10 mit sterilem PBS. </li></ol> 2. Blutentnahme <ol><li> Fragen Sie Themen, die im Labor nach einer O / N schnell (&gt; 8 Std) und abstenti ankommenauf von der körperlichen Aktivität (&gt; 12 h). </li><li> Nach der Reinigung der Haut mit einem Alkoholtupfer, legen Sie eine sterile Blutentnahme Nadel in eine periphere Armvene. </li><li> Sammeln Blut in Vakuumröhren, die im Handel mit Heparin-Natrium gefüllt sind. </li><li> Nach der Sammlung, ein steriles Heftpflaster auf die Patienten Arm. </li><li> Invertieren Blutröhrchen zu 10 mal zu mischen und dann auf einem Schüttler, bis die Analyse zu platzieren. </li></ol> 3. Phagozytose Assay-Technik <ol><li> Auftau S.aureus Biopartikel (RT), DHE (RT) und N-Ethylmaleimid (37 ° C). </li><li> In 20 l S.aureus Biopartikeln zu 4 Einzel 1,2-ml-Röhrchen, während der Arbeit in der sterilen Haube. </li><li> In 40 l DHE in jedes Röhrchen, das die Biopartikeln. </li><li> Klopfen Sie leicht die Rohre auf der Tischfläche, die Reagenzien in den Boden des Röhrchens zu sammeln. </li><li> 100 L mischten Vollbluts in jedes Röhrchen, die mit Biopartikeln und DHE gefüllt worden ist. </li><li>Wischen Sie die Innenkante der Rohre mit einem Wattestäbchen, um jede verunreinigende Blut zu entfernen. </li><li> Mischen Sie das Blut und Reagenzien mit einer elektronischen Pipette eingestellt, um das Blut und Reagenzien für die drei Zyklen nach der Blut hinaus mischen. </li><li> Zeigen Teströhrchen in einem Eiskübel und decken den Inhalt vor Licht zu schützen. </li><li> Assayröhrchen für 10, 20 und 40 min inkubiert. Beginnen Sie mit dem 40-Minuten-Rohr, um sicherzustellen, alle Teströhrchen beenden zugleich. </li><li> Thaw N-Ethylmaleimid in 37ºC Perle Bad. </li><li> Pipette 15 l N-Ethylmaleimid (vorstehend in 1.4 beschrieben) in jedem Teströhrchen, inkubiere für 30 min. </li><li> Pipettieren Sie 10 l CD66b-APC und 10 l CD45-Antikörper APCeFluor780 verdünnt (siehe oben unter 1.1 beschrieben), 60 min. </li><li> Pipettieren Sie 750 L der WBC fix / RBC Lyse-Lösung in jedem Teströhrchen, Inkubation 60 min. </li><li> Zentrifuge (10 min bei 400 · g) Teströhrchen, um das Zellpellet zu sammeln. </li><li> Vakuum absaugen WBC Lyse / RBC Fixier-Lösung, so dass ein Rest fluid Volumen (100 L) über dem Zellpellet. </li><li> Pipettieren Sie 10 l verdünnt 7AAD-Lösung (oben in 1.5 beschrieben) und 50 l PBS in jedem Teströhrchen. </li><li> Einen Tropfen Kalibrierung Perlen (~ 25 L) zu jedem Teströhrchen, Ort Kappen auf Teströhrchen, Wickelrohre in Folie und Platz im Kühlschrank. </li><li> Laden Sie das Probenröhrchen in die bildbasierte Durchflusszytometer und sammeln ein Minimum von 3.000 Granulozyten Ereignisse mit vordefinierten Parametern: Autosampler, Blau (488 nm, 60 mW), Rot (640 nm, 100 NW), SSC (785 nm; 8,5 mW) Laser (Abbildung 1). </li></ol><img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig1highres.jpg" /> Abbildung 1. Acquisition Method &amp; Template. Die Proben wurden auf einer bildbasierten Durchflusszytometer (A) erworben. Während der Akquisition wurden Dot-Plots von Hellfeld Seitenverhältnis gegen CD66b-APC getrennt Granulozyten aus Stachel Kalibrierung Perlen usin erzeugt100.2.292.0 Software (B) g INSPIRE v.. , Rot (640 nm, 100 NW), SSC (785 nm, 8,5 mW) Laser, ein Minimum von 5.000 Granulozyten wurden für jeweils Proben mit einem Autosampler, blau (60 mW 488 nm) erworben. Bitte beachten Sie, dass eine Reihe von Histogrammen bei der Erfassung der Lasereinstellungen und andere Aspekte der Datenerfassung überwachen vorhanden sind. Alle diese Histogramme sind optional und nur erforderlich, wenn die Laborstandardverfahren verlangt, dass sie die Qualitätskontrolle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> 4. Probenerfassung und -analyse <ol><li> Verwenden Sie die automatische Softwarekompensation Assistent des IDEAS-Software, um eine Kompensationsmatrix, um Raw-Bilddateien (RIF) anwenden und erstellen kompensieren abgebildeten Dateien (CIF). </li><li> Laden einzelnen CIF-Dateien in IDEAS-Software und die folgende Grundstücke, die Granulozyten-Untergruppen zu identifizieren: </li&gt; <li> Stellen Anfangs Tore, um die Zellen, die berücksichtigt wurden mit Hilfe eines Histogramms für Hellfeld Gradienten RMS (2A) im Fokus sein zu identifizieren. Machen Sie diese Bestimmung für jede Patientenprobe unter Verwendung der nicht-stimulierten Kontrolle als Referenzstandard. </li><li> Verwenden Sie sekundäre Grundstücke zu trennen Singulett-Zellen aus Schutt und Dubletten mit einem Punktediagramm der Hellfeld-Aspektverhältnis (Verhältnis von Zellenhöhe vs. Breite) vs. Hellfeldbereich (2B). Machen Sie diese Bestimmung für jede Patientenprobe unter Verwendung der nicht-stimulierten Kontrolle als Referenzstandard. </li><li> Sobald eine saubere Population von Zellen identifiziert worden waren, stellen Sie eine Dot-Plot von CD45 gegen CD66b (2C), um positiv zu identifizieren Granulozyten (CD45 + / 66b +). Erstellen Sie eine Tochter Plot (Abbildung 3) von hellen Detail Intensität für S. aureus (x-Achse) vs. hellen Detail Intensität für oxidativen Burst (DHE, y-Achse), um Untergruppen von aktivierten Granulozyten identifiziert. Sammeln bright Feldbilder in Kanal 1 und 9, Biopartikeln in Kanal 2, DHE in Channel 4, Channel 5 in 7AAD, CD66b in Kanal 11 und CD45 in Kanal 12. </li></ol><img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig2highres.jpg" /> Abbildung 2. Analysevorlage. Diese Zahl die Reihe der Grundstücke, die erzeugt wurden, um Zellen, die im Blickpunkt (A) wurden identifiziert, Einzelzellen (B), Granulozyten (C). Zusätzliche Flächen wurden verwendet, um die drei Teilmengen von aktivierten Granulozyten vs. inaktiven Granulozyten identifiziert. All die Zusammensetzung der erworbenen Bilddateien wurde mit IDEAS v.6 Software abgeschlossen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a>

<ol>
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R., Husfeld, L., Adam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+cytofluorometric+measurement+of+phagocytosis,+burst+production+and+killing+of+human+phagocytes+using+Candida+albicans+and+Staphylococcus+aureus+as+target+organisms.">Simultaneous cytofluorometric measurement of phagocytosis, burst production and killing of human phagocytes using Candida albicans and Staphylococcus aureus as target organisms.</a> Clin. Microbiol. 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C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst.">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (2013).</li><li>Ichii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+sucrose+impairs+phagocytic+function+and+promotes+apoptosis+in+polymorphonuclear+leukocytes.">Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes.</a> Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).</li><li>Ploppa, A., George, T. C., Unertl, K. E., Nohe, B., Durieux, M. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+blood+monocytes+and+adipose+tissue+macrophages+in+a+mouse+model+diet-induced+weight+gain.">Comparison of blood monocytes and adipose tissue macrophages in a mouse model diet-induced weight gain.</a> Comp. Med. 62, 462-465 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Das vorliegende Verfahren stellt eine Verfeinerung der bestehenden Methoden zur Bewertung der Granulozyten-Funktion mit Hilfe der Durchflusszytometrie 1,3,4,12-14. Die kritischen Schritte des Assays sind in der Regel auf das richtige Mischen der Blutprobe mit den Biopartikeln und DHE hängen. Unvollständige Mischung wird zu ungenauen Ergebnissen führen. Während eine vollständige Durchmischung kritisch ist, sollte die Mischmethode sanftes Natur sein. Es wird vorgeschlagen, dass das Mischen unter Verwendung einer elektronischen Pipette mit einer Mischfunktion, anstatt einem Wirbelmischer durchgeführt werden. Ein weiterer wichtiger Schritt im Assay ist, immer sicher, dass kein Blut Verunreinigung der oberen Hälfte der Teströhrchen. Das Restblut kann mit einem sterilen Wattestäbchen entfernt werden. Die vollständige Entfernung ist wichtig, weil dies versäumt, so kann die endgültige Testvorbereitung mit nicht lysierten roten Blutkörperchen verunreinigen. Vor der Verwendung dieser Methode eine angemessene Entschädigung Kontrollen sollten hinzugefügt, um sp steuernectral Überlappung zwischen den verwendet, um die verschiedenen Aspekte der Granulozytenfunktion identifizieren Reagenzien. Für diese Methode Entschädigung Kontrollen umfassen sammeln Blutproben, die die 40 min Inkubation Assay vorgeschlagen haben und die Kennzeichnung mit einem einzigen Marker (dh E. coli, DHE, etc.). Nach der Markierung werden einzelne positive Ereignisse gesammelt und einer Kompensationsmatrix wird mit Hilfe eines automatisierten Assistenten in der IDEEN-Analyse-Software generiert. Es ist kritisch, dass, wenn dieser Test verwendet wird, geeignete Kompensationssteuerungen abgeschlossen sind, um eine ordnungsgemäße Testleistung zu gewährleisten. Die Analyse wird mit Hilfe der Funktion Finder und Co-Lokalisation Assistenten zu erkennen, dass helle Detail Intensität ist die beste Variable, um die Bevölkerung zu trennen und zu identifizieren, wie viel Überschneidung zwischen oxidativen Burst und Phagozytose Signale vorhanden erreicht. Insbesondere die Verwendung von bildbasierten Zytometrie vorgesehen die Fähigkeit aktivierten Granulozyten in drei Teilmengen zu trennen. Tseine Teilmenge Aufteilung wurde mit hellen Detail Intensität der Phagozytose gegen oxidativen Burst bestimmt. Neben der Untersuchung dieser singulären Zellfunktionen wurden die Zellen, die sowohl Veranstaltungen zur gleichen Zeit in der gleichen anatomischen Lage (Co-Lokalisation) zeigten identifiziert. Granulozyten, die in die &quot;high-aktiv&quot; Untergruppe fiel das einzige Phänotyp, die im Einklang Kolokalisation zwischen Phagozytose und oxidativen Burst demonstriert. Diese Identifizierung aktivierter Granulozyten-Untergruppen ist der größte Bereich, in dem Problembehandlung erforderlich ist. Es ist sehr wichtig für ein neuer Benutzer sich Zeit zu nehmen, um die Probe Prozess-Workflow in IDEAS zu verstehen und die Mechanik der Anschnitt die Zellpopulationen mit dem bildgebenden Komponente zu verstehen. Andere Änderungen, die ein Benutzer kann versuchen, zu machen sind die Auswahl der anderen oder einen zusätzlichen Test Inkubationszeiten. Das gegenwärtige Verfahren schlägt die Verwendung von Zeitdauern von 10-40 min; jedoch in Abhängigkeit von dem experimentellen Modell, wenn dieses Verfahrenverwendet werden soll, kann es notwendig mehr Assay Dauern auszuwählen. Eine solche Veränderung würde müssen individuell bewertet werden. Ferner wurde bestimmt, daß die Dauer der Inkubation werden eine signifikante Wirkung auf das Aussehen der drei Untergruppen aktiviert. Die in diesem Bericht beschriebenen Ansatz stellt eine Erweiterung, welche Informationen bereits erhalten werden konnten bezüglich Granulozytenfunktion 3,4,13,15. Andere Labors haben die Bedeutung der Beurteilung von Veränderungen in Granulozytenfunktion als Teil einer umfassenden Bewertung der Immunität und Krankheit 15 bis 17 gezeigt. Trotz des Potentials dieses Assays ist es nicht ohne Einschränkungen. Eine der Haupteinschränkungen mit hohem Probendurchsatz assoziiert Kosten und Zeitbedarf. Wenn ein Studiendesign erfordert eine große Anzahl von Proben in einem gegebenen Tag, können diese schwierig zu verarbeiten sein. Die Verarbeitung wird durch den Einsatz von elektronischen Pipetten und Dispenser gestrafft,aber diese neigen dazu, teuer zu sein und sind nicht notwendigerweise in jedem Labor. Unsere Forschungsbereich konzentriert sich auf eine Studie, wie Bewegung und Ernährungsgewohnheiten beeinflussen die Gesundheit des Immunsystems und Funktion 6,8-10,18-20. Diese Ziele haben signifikante praktische Bedeutung für eine Vielzahl von Bereichen der menschlichen Gesundheit. Über die Untersuchung der Bewegung und Futterverwertung der Phagozytose Verfahren in diesem Manuskript konnte gezeigt werden, die in anderen Bereichen der klinischen Immunologie, wo die Überwachung der Phagozytose Funktion ist entscheidend für die Behandlungsergebnisse. Die vorliegende Test ist der erste von vielen, dass immunologische Tests mit dem Potenzial, indem sie Vorteile der einzigartigen Bildinformationen, die von einer bildbasierten Durchflusszytometer werden können, können neu erfunden werden.

Granulozyten stellen einen Bestandteil des körpereigenen angeborenen Immunsystems, die die erste Verteidigungslinie gegen eindringende Antigene zur Verfügung stellt. Frühere Verfahren zur Beurteilung Granulozytenfunktion fokussiert auf die Phagozytose Kapazität oder oxidativen Burst mit separaten Methoden, so dass es schwierig ist, festzustellen, wie kollektiv Granulozyten 1-4 verändert. Fortschritte auf dem Gebiet der Durchflußzytometrie in der Herstellung von Tischgeräten in der Lage, hochauflösende, Mehrfarbenbilder von Zellen in einem Hochdurch Weise 5 geführt. Die Fähigkeit zur Bildgebung mit traditionellen Flow kombinieren Zytometrie stellt eine Weiterentwicklung, die die technologische Plattform benötigt, um im Rahmen der bestehenden Flusszytometrie Methoden innovativ und extrahieren Sie neue Informationen über das Immunsystem bietet. In den letzten zehn Jahren hat unser Labor unter anderem stark von der Wirkung von verschiedenen Ernährungs- und Bewegungs Behandlungen Patte fokussiertrns auf angeborene Immunfunktion 6-9. Die in dieser Handschrift zeigte Methode hat praktische Auswirkungen im Bereich der klinischen Immunologie. Das vorliegende Verfahren nutzt die Leistung von bildbasierten Durchflusszytometrie, um gleichzeitig die Phagozytose von Bakterien und Partikeln oxidativen Burst. Mit dieser Vorgehensweise ist man in der Lage aktivierten Granulozyten mit Variablen durch die bildbasierte Teil der Analyse bereitgestellt trennen. Diese Teilmengen nur erkennbar, nachdem die Beurteilung der Zellbilder auf den einzelnen Granulozyten. Weitere Assays Inkubationszeit betroffen den Übergang zwischen den drei Untergruppen Aktivierungs 10. Somit ist es plausibel, dass die Verwendung von mehreren Inkubationszeiten erlauben ein Verfahren, um die Änderung in Granulozytenfunktion nach einem spezifischen experimentellen Behandlung zu testen. Der Zweck dieses Manuskripts wurde die Bereitstellung eines Verfahrens zur Beurteilung Granulozytenfunktion mithilfe bildbasierten Durchflusszytometrie, um gleichzeitig die Phagozytose mit oxidat demonstrierenive platzen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="627">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:125px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vacutainers</td>
			<td style="width:125px;">BD Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for blood collection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">WBC Fixative / RBC Lysis solution</td>
			<td style="width:125px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">00-5333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD66b-APC</td>
			<td style="width:125px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">clone G10F5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD45-APCeFluor780</td>
			<td style="width:125px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">clone 2D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">s.aureus bioparticles</td>
			<td style="width:125px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A10010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dihydroethidium</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D7008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-ethylmalemide</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">4259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">7AAD</td>
			<td style="width:125px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hematology Analyzer</td>
			<td style="width:125px;">Mindray</td>
			<td style="width:119px;">BC-3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-channel pipet</td>
			<td style="width:125px;">Integra Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">ViaFlo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bead Bath Incubator</td>
			<td style="width:125px;">LabArmour</td>
			<td style="width:119px;">BeadBath</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Imaging Flow Cytometer</td>
			<td style="width:125px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">Amnis FlowSight</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">INSPIRE Software</td>
			<td style="width:125px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">Amnis INSPIRE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IDEAS Software</td>
			<td style="width:125px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">Amnis IDEAS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">X-Pierce Piercable Plate Sealer</td>
			<td style="width:125px;">Excel Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">X-Pierce</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dell Precision Workstation</td>
			<td style="width:125px;">Dell Computers</td>
			<td style="width:119px;">Various</td>
			<td>Used for IDEAS analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).

Verwendung bildbasierten Durchflusszytometrie uns erlaubt, eine homogene Population von aktivierten Granulozyten in drei verschiedene Untergruppen der Aktivierung (Figur 3) zu trennen. Bei diesem Verfahren wird der wirksamste Weg, um die drei Aktivierungsmengen zu lösen, ist durch Auftragen hellen Detail Intensität für Phagozytose (S. aureus) gegen oxidativen Burst (DHE) (Figur 3; Figur 4). Auch wird die Verwendung des Co-Lokalisation Assistenten in IDEAS-Software für die Quantifizierung der Anwesenheit von gleichzeitigen Phagozytose und oxidativen Burst, die ein Markenzeichen Zeichen der hoch aktivierten Granulozyten ist erlaubt. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig3highres.jpg" /> Abbildung 3. Bezeichnung des Aktiv Granulozyten-Subsets. Nach der Identifizierung von Granulozyten mit Zelloberflächenmarker (CD45 + / 66b +), eine Tochter Grundstück wurde mit hellen ausführlich inten erzeugtVielfalt für die Phagozytose vs. hell Detail Intensität für oxidativen Burst. Mit diesem Ansatz Anteil der inaktiven (lila), low-aktiv (rot, A), mittel-aktiv (blau, B) und high-aktiv (gelb, C) Granulozyten bestimmt. Dieses Gating-Technik wurde auch verwendet, um die Wirkung der Test Inkubationszeit auf die relative Menge der verschiedenen aktivierten Granulocyten Untergruppen auszuwerten. Der höchste Prozentsatz von &quot;high-aktiv&quot; Granulozyten vorhanden war, nach der 40-minütigen Inkubation. All die Zusammensetzung der erworbenen Bilddateien wurde mit IDEAS v.6 Software abgeschlossen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> Neben dem Nachweis der Anwesenheit von drei unterschiedlichen Teilmengen von aktivierten Granulozyten, wurde demonstriert, dass das Assay Inkubationszeit beeinflusst die relative Häufigkeit jeder aktivierten Granulozyten Subset. Insbesondere wird das 40 min incubation führte zur größten Anteil der &quot;high-aktiv&quot; Granulozyten. Von denen mindestens drei Assay Inkubation Dauern kann es möglich sein, zu bestimmen, wie ein bestimmter klinischer Behandlung ändert die zeitliche Aktivierungsstatus von Granulozyten. Dies ist der erste veröffentlichte Verfahren unter Verwendung der bildbasierten Durchflusszytometrie an verschiedene aktivierte Granulozyten Teilmengen in Abhängigkeit von gleichzeitigen Messungen der Phagozytose und die oxidative Burst identifizieren. <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig4highres.jpg" /> Abbildung 4. Repräsentative Bilder von Cellular Markers. Eine Fotogalerie von Zellen als high-aktiv (A) klassifiziert, moderate aktiven (B) und low-aktiv (C) ist in dieser Figur dargestellt. S.aureus Biopartikeln sind in CH03 ist oxidativen Burst in Ch04, 7AAD für den Kern in CH05, Seitenstreuung ist in Ch06, CD66b ist inCh11 und CD45 ist in Ch12. Es wird auch ein co-lokalisiert merge Bild der Phagozytose (CH03) gegen oxidativen Burst (Ch04) angezeigt. Gebiete gelb in der Zusammenführung Bild anzuzeigen, dass die Phagozytose und oxidativen Burst in der gleichen anatomischen Raum zur gleichen Zeit auftreten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a>

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Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

Bildbasierte Durchflusszytometrie Technik zur Veränderung der Granulozyten-Funktion auswerten<em&gt; In-vitro-</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

12.3K Aufrufe.  University of North Texas. This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

Serie: Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

Mess-Calpain Aktivität in fixierten und lebenden Zellen mittels Durchflusszytometrie

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Mensch In Vitro Suppression als Screening-Tool für die Anerkennung von Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

In vitro-Test, um die Auswirkungen von immun Pathways auf die HIV-spezifischen CD4 T-Zell-Effektor-Funktion auswerten

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

Die Verwendung von Durchflusszytometrie, um den Zustand von Chromatin in T-Zellen bewerten

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

Die Beurteilung Retinal Microglial Phagozytische Funktion<em&gt; In Vivo</em&gt; Mit einem Durchfluss-Zytometrie basierten Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to stimulate cell migration. Importantly, cell migration is a rate-limiting event during the wound-healing process to re-establish the integrity and normal function of tissue layers after injury. The advantage of this method over the classical assay, which is based on a manually made scratch in a cell monolayer, is the usage of special silicone culture inserts providing two compartments to create a cell-free pseudo-wound field with a well-defined width (500 &#956;m). In addition, due to an automated image analysis platform, it is possible to rapidly obtain quantitative data on the speed of wound closure and cell migration. More precisely, the effect of two frog-skin AMPs on the migration of bronchial epithelial cells will be shown. Furthermore, pretreatment of these cells with specific inhibitors will provide information on the molecular mechanisms underlying such events.

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Here, we present a protocol to evaluate the effect of peptides on the migration of bronchial epithelial cells. This method allows for the rapid and highly reproducible obtainment of quantitative data on the speed of cell migration and wound closure.

Eine neuartige In-vitro- Wunde heilende Assay Zellwanderung bewerten

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolation und In-vitro- Kultur von murinen und menschlichen alveoläre Makrophagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity of antibodies or serum to enhance infection in impermissible cell lines have relied on using viral output in the media followed by plaque assays to quantify infection. More recently, these assays have examined Dengue virus (DENV) infection in the cell lines using fluorescently labeled antibodies. Both these approaches have limitations that restrict the widespread use of these techniques. Here, we describe a simple in vitro assay using Dengue virus reporter viral particles (RVPs) that express green fluorescent protein and K562 cells to examine antibody dependent enhancement (ADE) of DENV infection using serum that was obtained from rhesus macaques 16 weeks after infection with Zika virus (ZIKV). This technique is reliable, involves minimal manipulation of cells, does not involve the use of live replication competent virus, and can be performed in a high throughput format to get a quantitative readout using flow cytometry. Additionally, this assay can be easily adapted to examine antibody dependent enhancement (ADE) of other flavivirus infections such as Yellow Fever virus (YFV), Japanese Equine Encephalitis virus (JEEV), West Nile virus (WNV) etc. where RVPs are available. The ease of setting up the assay, analyzing the data, and interpreting results makes it highly amenable to most laboratory settings.

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

We describe a simple and easy protocol for measuring antibody dependent enhancement of infection by Zika virus convalescent serum using Dengue virus Reporter Viral Particles.

Eine einfache Durchflusszytometrie basierten Test um festzustellen, In-vitro- Antikörper abhängige Verbesserung des Dengue-Virus mit Zika-Virus genesenden Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single cell level and statistical image analysis at a populational level. To overcome this difficulty, we used imaging flow cytometry and transcriptomic profiling (RNA-seq) to determine altered subcellular localization of the cluster of differentiation 1d protein (CD1d) associated with impaired endocytic gene expression in human dendritic cells (DCs), which were exposed to the common lipophilic air pollutant benzo[a]pyrene. The colocalization of CD1d and endocytic marker Lamp1 proteins from thousands of cell images captured with imaging flow cytometry was analyzed using IDEAS and ImageJ-Fiji programs. Numerous cellular images with co-stained CD1d and Lamp1 proteins were visualized after gating on CD1d+Lamp1+ DCs using IDEAS. The enhanced CD1d and Lamp1 colocalization upon BaP exposure was further demonstrated using thresholded scatterplots, tested with Mander&#39;s coefficients for co-localized intensity, and plotted based on the percentage of co-localized areas using ImageJ-Fiji. Our data provide an advantageous instrumental and bioinformatic approach to measure protein colocalization at both single and populational cellular levels, supporting an impaired functional outcome of transcriptomic alteration in pollutant-exposed human DCs.

Imaging flow cytometry provides an ideal approach to detect the morphological and functional alteration of cells at individual and populational levels. Disrupted endocytic function for lipid antigen presentation in pollutant-exposed human dendritic cells was demonstrated with a combined transcriptomic profiling of gene expression and morphological demonstration of protein trafficking.

Integration von Imaging Durchflusszytometrie und transkriptomischen Profilierung zu veränderten Endocytic CD1d Handel bewerten

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

In Vitro ELISA-Test zur Bewertung der Wirksamkeit von Tollwut-Impfstoffen

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...