Die mit dieser Technik generierten Daten fördern das Verständnis von autoimmunanfälligen Mausmodellen sowie humanisierten Mäusen, die für allgemeine Antikörper- oder Antikörper-Lebenstherapeutika verwendet werden können. Die Verfügbarkeit von Reagenzien mit einem ständig wachsenden Spektrum an Fluorophoren ermöglicht die gleichzeitige Analyse mehrerer Parameter an einzelnen Zellen und die Beurteilung der B-Zell-Heterogenität. Dieses Protokoll wurde mit dem Ziel entwickelt, gentechnisch veränderte Mäuse zu phänotypisieren.
um festzustellen, ob genetische Manipulation die B-Zell-Entwicklung verändern würde. Hallo, ich bin Faith Harris. Ich werde das Verfahren heute demonstrieren.
Beginnen Sie damit, eine Million jedes Zelltyps von jedem Tier in eine 96-Well-U-Bodenplatte zu aliquotieren. Stellen Sie sicher, dass für alle Proben und Kontrollen ausreichend Vertiefungen verfügbar sind, einschließlich vollständiger Färbung, Fluoreszenz-Minus-Eins-Proben und nicht gefärbter Proben für jeden Fluorophor. Für das Knochenmarkreifungspanel und das Milzreifungspanel aliquote Zellen in zwei Vertiefungen, 1 Million Zellen pro Vertiefung für jede vollständige Fleckenprobe.
Für die Single-Color-Compensation-Lebensfähigkeitskontrollen fügen Sie jeweils zwei Millionen Zellen jedes Zelltyps zu einzelnen Vertiefungen hinzu. Zentrifugieren Sie die Platte bei 845 x g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius. Dekantieren Sie den Überstand, indem Sie die Platte schnell umkehren und über eine Spüle streichen und darauf achten, dass die Vertiefungen nicht verunreinigt werden.
Waschen Sie die Zellen zweimal in 200 Mikroliter DPBS. Zentrifugieren und dekantieren Sie den Überstand nach jedem Waschen. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern Lebensfähigkeitsfarbstoff, der in DPBS im Verhältnis eins zu 1000 verdünnt ist, und vermeiden Sie die Zellen, die für die Einzelfarbkompensation verwendet werden.
Lassen Sie für jeden Fleckensatz mehrere nicht gebeizte Vertiefungen für eine vollständig ungefärbte Probe und andere Kontrollen, die Sie möglicherweise benötigen, sowie eine zusätzliche nicht gefärbte Vertiefung für die FMO-Kontrolle der Lebensfähigkeit. Fügen Sie PBS zu diesen Bohrlöchern hinzu. Resuspend die Zellen der Einfarbkompensation Lebensfähigkeit Kontrollen in 200 Mikroliter verdünnten Lebensfähigkeit Farbstoff.
Übertragen Sie 100 Mikroliter dieser Zellen in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr und erhitzen Sie es fünf Minuten bei 65 Grad Celsius, dann übertragen Sie die beheizten Zellen mit den verbleibenden lebenden Zellen zurück in den ursprünglichen Brunnen. Inkubieren Sie die Zellen bei vier Grad Celsius für 30 Minuten vor Licht geschützt. Nach der Inkubation die Zellen zentrifugieren und den Überstand dekantieren, indem Sie die Platte streichen oder invertieren, ohne die anderen Vertiefungen zu kreuzkontaminieren.
Waschen Sie die Zellen, indem Sie sie in 200 Mikrolitern DPBS wiederverwenden, dann zentrifugieren und dekantieren Sie den Überstand wie zuvor. Wiederholen Sie die DPBS-Wäsche erneut. Fügen Sie Mikroliter FC-Block, verdünnt mit Fleckenpuffer, in einem Verhältnis von eins zu 50 hinzu, um eine Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten.
Für Peritonealzellen fügen Sie fünf Mikroliter Monozytenblocker hinzu, um die unspezifische Färbung zu reduzieren. Dann inkubieren Sie die Zellen bei vier Grad Celsius für 15 Minuten, geschützt vor Licht. Bereiten Sie vollständige Fleckenstammmischungen und FMOs im Fleckenpuffer für ein endgültiges Volumen von 100 Mikrolitern pro Million Zellen unter Verwendung der Antikörpertabellen im Textmanuskript vor.
Ohne den FC-Block zu entfernen, fügen Sie 100 Mikroliter voller Fleckenmischungen und FMOs zu ausgewählten Vertiefungen hinzu. Bereiten Sie einzelne Farbkompensationskontrollen für jeden Antikörper und ein Fleckenset vor. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, wenn Sie Kompensationsperlen verwenden.
Inkubieren Sie die Zellen und die Kügelchen bei vier Grad Celsius für 30 Minuten, geschützt vor Licht. Dann zentrifugieren und dekantieren Sie den Überstand, indem Sie die Platte invertieren und streicheln. Waschen Sie die Zellen und Perlen dreimal in 200 Mikrolitern Fleckenpuffer, wobei Sie den Überstand jedes Mal zentrifugieren und dekantieren.
Resuspendieren Sie die Zellen und Kügelchen in 200 Mikrolitern 2% Paraformaldehyd in DPBS, um die Proben für die Analyse zu fixieren. Inkubieren Sie die Zelle und die Perlen bei vier Grad Celsius für 30 Minuten, geschützt vor Licht, dann zentrifugieren und dekantieren Sie den Überstand, indem Sie die Platte umkehren oder streicheln. Resuspendieren Sie die Zellen und Kügelchen in 200 Mikrolitern Fleckenpuffer.
Legen Sie eine Filterplatte über eine saubere 96-Well-U-Bodenplatte und übertragen Sie jede Probe mit einer Multipipette in eine Vertiefung der Filterplatte. Zentrifugieren Sie die Filterplatte und dekantieren Sie den Überstand. Für die Knochenmark- und Milzreifungsplatten resuspendieren Sie die vollständig gefärbten Zellen in 100 Mikrolitern Fleckenpuffer.
Kombinieren Sie die beiden Vertiefungen für jedes Tier zu einem Brunnen. Resuspendieren Sie die verbleibenden Panels, FMOs und Steuerungen in 200 Mikroliter Fleckenpuffer. Fixierte Zellen und Perlen über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren, vor Licht geschützt.
Zeichnen Sie die Kompensationskontrollen für jedes Fleckenpanel mit den vorbereiteten Einzelfleckenkompensationen auf und legen Sie positive und negative Gatter für jede Probe fest. Berechnen Sie die Vergütungsmatrix mit der Software. Beginnen Sie mit der Erfassung der ersten Probe und stellen Sie sicher, dass die Gates entsprechend eingestellt sind.
Stellen Sie die Maschine so ein, dass sie läuft, und zeichnen Sie die verschiedenen Zellereignisse für jede Probe auf, wie im Textmanuskript erwähnt. Fahren Sie mit der Datenanalyse mit einer Durchflusszytometrie-Analysesoftware fort und folgen Sie den Gating-Strategien im Textmanuskript. Die durchflusszytometrische Analyse zur Charakterisierung von peritonealen B-Zellen im Peritoneum zeigt die Häufigkeiten lebensfähiger Peritonealzellen, Gesamt-B-Zellen, B-1- und B-2-Untergruppen sowie B-1a- und B-1b-Zellen in Mäusen.
Wenn Knochenmark-B-Zellen analysiert wurden, wurden Frequenzen von lebensfähigen Zellen, Gesamt-B-Zellen, Fraktion A, Prä-Pro-B-Zellen, Fraktion B, Fraktion C, Fraktion C'Fraktion D, unreife Fraktion E, Übergangsfraktion E und Fraktion F B-Zellen in Mäusen bestimmt. Die Analyse von Milz-B-Zellen zeigt die Häufigkeiten von lebensfähigen Milzzellen, Gesamt-B-Zellen, Übergangs-B-Zellen, T1-, T2-, T3-Zellen, reifen B-Zellen, follikulären I-Zellen, follikulären II-Zellen, Vorläufer- und reifen Randzonenzellen und B-1-Zellen bei Mäusen. Die Häufigkeiten von Immunglobulin kappa- und Immunglobulin-Lambda-B-Zellen in Mäusen wurden mit einer durchflusszytometrischen Analyse der Milz bestimmt.
Wenn Sie dieses Protokoll ausführen, müssen Sie das Signal von einem Detektor, der ausblutet, mithilfe von Kompensationskontrollen in den nächsten auflösen. Diese Kontrollen könnten entweder einzeln gefärbt oder mit handelsüblichen Kompensationsperlen versehen sein. Zusätzliche Assays können in Verbindung mit der Durchflusszytometrie verwendet werden, wie die Immunhistochemie zur Visualisierung der Zelllokalisation in lymphatischen Organen sowie die Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Analyse von B-Zell-Antworten in realem Raum und Zeit.
Die durchflusszytometrische Analyse der B-Zellkompartimente ermöglicht die Charakterisierung von Phänotypen, die mit BCR und damit verbundenen Mängeln, Störungen von BCR-Signalmolekülen oder Störungen von Zytokinen, die das Überleben von B-Zellen modulieren, assoziiert sind.
