Diese Arbeit wurde von der Fondazione Istituto Italiano di Tecnologia unterstützt. Die Autoren bedanken sich bei Miltenyi Biotec GmbH (Bergisch Gladbach, Deutschland) für die Förderung der Handschrift erkennen, Dr. Paolo Petrucciani (Abteilung für Immunhämatologie und Transfusionsdienst, Krankenhaus Lotti Pontedera, Pisa, Italien) für die Bereitstellung von menschlichen Buffy Coats und Prof. Massimo Pasqualetti (Fachbereich Biologie - Einheit der Zell-und Entwicklungsbiologie, Universität Pisa, Pisa, Italien) für die Unterbringung der Maus Kolonie.

Ethikerklärung Menschliche und tierische Proben wurden nach den Richtlinien des italienischen Gesundheitsministerium verarbeitet werden, das Gesetz 116/92 und die Richtlinie 86/609/EWG des Rates Europäischen Gemeinschaften. 1. Monozyten-Zellkulturen <ol><li> Kultur humanen THP-1-Zellen in T-75-Kolben mit RPMI-1640-Medium mit 10% Humanserum, 50 U / ml Penicillin und 50 mg / ml Streptomycin, 0,05 mM β-Mercaptoethanol bei 37 ° C in 5% CO 2 ergänzt. </li><li> Split Kulturen, wenn konfluent (alle 3-5 Tage). </li></ol> 2. Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) aus Buffy Coats <ol><li> Vor dem Start des Isolierungsprotokolls, wird eine Lösung aus phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,2, 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,5% Rinderserumalbumin (BSA), Zugabe von 5 ml BSA-Stammlösung zu 95 ml Waschpuffer gewaschen (1: 20 Verdünnung). Entgasen Sie den Puffer und halten es kalt (2-8° C). WICHTIG: Wenn Entgasung der Puffer kann in weniger als optimale Ergebnisse führen, da Blasen können die Isolierung Spalte (siehe Schritt 3.2) zu blockieren. Hinweis: Antikoagulans Citrat-Dextrose-A Formel (ACD-A) oder Citrat-Phosphat-Dextrose (CPD) kann alternativ verwendet werden. Umgekehrt können andere Albuminproteine ​​oder Seren, die von anderen Arten BSA ersetzen. Verwenden Sie keine Puffer, die Ca 2 + oder Mg 2 +. </li><li> Erhalten Buffy Coats von gesunden Spendern (im Alter von 20-60 Jahren). </li><li> Vorbereitung 50 ml konische Röhrchen für Dichtegradientenzentrifugation. Bestimmen Sie die Anzahl der Rohre für die Bearbeitung des Blutes (jede Röhre kann 35 ml verdünntem Blut zu verarbeiten) und 15 ml Ficoll-Paque jedem Leerrohr erforderlich. </li><li> Verdünnen 8 ml Blut mit 24 ml PBS / BSA / EDTA-Lösung (1:4 Verdünnung). </li><li> Sorgfältig Schicht der verdünnten Lösung auf Ficoll-Paque (Dichte = 1,077 g / ml) in jedem der 50 ml konische Röhrchen. Mischen Sie nichtBlut und Ficoll-Paque. WICHTIG: Um eine Vermischung von Blut und Ficoll-Paque zu vermeiden, halten Sie die Röhre in einem 45 °-Winkel und die Schicht langsam das Blut-Gemisch. </li><li> Zentrifuge bei 400 × g für 30 min bei 4 ° C. Mononukleären Zellen (MNCs) wird an der Plasma-Ficoll-Paque-Schnittstelle wohin Granulozyten und Erythrozyten Sediment aufgrund höherer Dichte zu dem osmotischen Druck der Ficoll-Paque bleiben. </li><li> Übertragen die Interphasezellen (Periphere mononukleare Blutzellen, PBMCs) in eine neue 50-ml-Röhrchen mit PBS / BSA / EDTA und zentrifugieren für 10 min bei 300 xg gefüllt bei 4 ° C. </li><li> Zweimal Waschen des Pellets mit PBS / BSA / EDTA auf Thrombozyten zu entfernen. Spin bei 200 × g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Kultur die Zellen in RPMI-1640 mit 10% Humanserum und Antibiotika oder fahren Sie mit Monozyten Reinigung. </li></ol> 3. Reinigung von Primär Monozyten aus PBMCs <ol><li> Isolieren Monozyten aus PBMCs durch magnetische Trennung mit Wulst Humein Pan Monozyten Isolation Kit: <ol><li> Pass Zellen durch eine 30 um Nylon-Mesh (Vorabscheidefilter, 30 um), um mögliche Zellklumpen zu entfernen. </li><li> Bestimmen der Zellzahl mit einer Zählkammer. </li><li> Zentrifuge Zellsuspension bei 300 × g für 10 min bei Raumtemperatur (RT). Absaugen des Überstandes. </li><li> Resuspendieren Zellpellet in 30 ul PBS / EDTA / BSA-Puffer pro 10 7 Zellen insgesamt. </li><li> In 10 ul FcR Blocking-Reagenz pro 10 7 Zellen insgesamt. </li><li> In 10 ul Biotin-Antikörper-Cocktail pro 10 7 Zellen insgesamt. </li><li> Gut mischen und Inkubation für 5 min bei 2-8 ° C </li><li> In 30 ul Puffer pro 10 7 Zellen insgesamt. </li><li> In 20 ul Anti-Biotin MicroBeads pro 10 7 Zellen insgesamt. </li><li> Gut mischen und Inkubation für 10 min bei 2-8 ° C </li><li> Resuspendieren bis 10 8 Zellen in 500 ul PBS / EDTA / BSA-Puffer. </li></ol></li><li> Magnetische separation <ol><li> Entsprechend der Gesamtzellzahl, wählen Sie eine geeignete MACS Säulen-und MACS Separator (siehe Spalte MACS Datenblatt). </li><li> Die Säule im Magnetfeld des MACS Separator. </li><li> Vorbereitung Säule durch Spülen mit der entsprechenden Menge an PBS / EDTA / BSA-Puffer (MS Säulen: 500 ul; LS Säulen: 3 ml). Hinweis: Die Spalten sind &quot;Flow Stop&quot; und nicht trocken laufen. </li><li> Gelten Zellsuspension auf die Säule. Sammeln Durchfluss unmarkierten Zellen enthält, die die angereicherte Monozytenfraktion. </li><li> Mit PBS / EDTA / BSA-Puffer (500 ul für MS und 3 ml für LS pro Waschgang) waschen Spalte 3x. </li><li> Sammeln unmarkierte Zellen, die passieren, die die angereicherte Monozyten-Zellen und in den Durchfluss von Abschnitt 3.2.4. Hinweis: durch Zugabe von PBS / EDTA / BSA-Puffer Aliquots nur, wenn die Spalte Behälter leer Waschen Sie die Spalte. </li><li> (Optional) Säule entfernen von derAbscheider und legen Sie es auf einem geeigneten Sammelrohr. Pipettieren Sie den Puffer auf die Säule (MS Spalten: 1 ml; LS Spalten: 5 ml). Unmittelbar spülen die magnetisch markierten Zellen durch nonmonocyte fest drückt den Kolben in die Spalte. </li><li> Kultur gereinigt Monozyten in vollständigem RPMI-1640 mit 10% Humanserum und Antibiotika. </li></ol></li></ol> 4. Reinigung von Primär Monozyten aus Vollblut <ol><li> Reinige Monozyten aus Vollblut mit Vollblut Monozyten-Isolation Kit nach Herstellerangaben. </li></ol> 5. Nanopartikel Internalisierung in Blood Leukozyten und Monozyten Gereinigtes <ol><li> Platte 5 x 10 5 Zellen / ml (1 ml / Vertiefung) der isolierten PBMCs oder gereinigten CD14-positive Monozyten in einer 12-Well-Platte. </li><li> Vortex FITC-SiO 2-Nanopartikel-Stammlösung und resuspendieren in Vollmedium auf eine Arbeitskonzentration von 100 nM. </li><li> In 10 ul Arbeits NanOpArtikel Suspension (100 nM) für behandelte Proben ein Nanopartikel Endkonzentration von 1 nM zu erreichen. Das gleiche Volumen von Komplettmedium für den unbehandelten Kontrollen zu jedem Well. </li><li> Nach 1 h Internalisierung Sammeln der Proben in einem 1,5 ml Polypropylen-Röhrchen und zentrifugieren für 3 min bei 6000 xg bei Raumtemperatur. </li><li> Mit 1 ml Laufpuffer 3 min bei 6.000 × g bei RT Waschen des Pellets. </li><li> Resuspendieren des Pellets in 200 ul Laufpuffer. Die Zellen sind nun bereit für das Lesen mittels Durchflusszytometrie. </li></ol> 6. Isolation of Primary Mixed Gliazellen Kulturen (Siehe Bertero et al. 7) 7. Replattierung eine Mixed Gliazellen Confluent Zellkultur <ol><li> Eine T-75-Kolben einmal (w / o Ca 2 + / Mg 2 +), wäscht mit 10 ml PBS gewaschen, dann mit 10 ml Versene und bei 37 ° C für 5-7 min. </li><li> Den Überstand abpipettieren und unten mehrere Male, um die Zellen von der T-75-Oberfläche zu lösen und zu lösenZellaggregate. </li><li> Übertragen der Zellsuspension in ein 15 ml Polypropylenröhrchen. Sammeln Sie eine kleine Menge der Zellsuspension, die Zellen mit einer Zählkammer zählen. </li><li> Zentrifugieren der Zellsuspension für 5 min bei 300 · g bei RT. </li><li> Entfernen des Überstandes und Resuspendieren des Pellets in einer Endkonzentration von 5 x 10 5 Zellen / ml in vollständigem Kulturmedium Gliazellen. </li><li> Platte 0,5 ml / Well in einer 24-Well-Platte und lassen die Zellen absetzen für 2-4 Stunden vor der Nanopartikel-Behandlung. </li></ol> 8. Internalisierung Nanopartikel in Mikrogliazellen <ol><li> Gib 500 ul vollständiges Gliazellen Kulturmedium (für unbehandelte Kontrolle) oder 500 ul einer 2x Rhodamin-SiO 2-Nanopartikel-Suspension in Gliazellen vollständige Kulturmedium (für behandelte Proben) zu jeder Vertiefung. </li><li> Pipettieren Sie die Zellen, um die Ablösung der nonrapid haftenden Zellen bei den gewählten Zeitpunkten zu ermöglichen und sammeln sie in 2 ml Polypropylen-Röhrchen. </li><li> In 500 ulVersene in jede Vertiefung und Inkubation der Platte bei 37 ° C für 5 min, dann trennen Sie die restlichen Zellfraktion und sammeln jede Probe mit den entsprechenden nicht-anhaftenden Zellen der vorherigen Schritt. </li><li> Sie die Proben für 3 min bei 300 · g bei RT. </li><li> Resuspendieren des Pellets in 100 ul AutoMACS Laufpuffer. </li></ol> 9. Die Färbung mit CD11b-VioBlue <ol><li> Werden 10 ul VioBlue-CD11b Mensch / Maus-Antikörper zu 100 &amp;mgr; l Zellsuspension (1.11 Verhältnis) in Laufpuffer und Inkubation 10 min bei 4 ° C. </li><li> 1 ml Laufpuffer und mischen die Zellsuspension. </li><li> Zentrifuge jede Probe für 3 Minuten bei 300 x g. </li><li> Überstand verwerfen und das Pellet in 100-150 ul Laufpuffer. </li><li> Lesen Sie die Proben an das Durchflusszytometer (lagern die Proben bei 4 ° C zwischen den beiden letzten Stufen). WICHTIG: Vor der Analyse der Proben, auf den Ersatz des überlappenden Signalen gehen in-Emissionsspektren von verschiedenen Fluorochromen (Fluorochrom-konjugierten Nanopartikel oder Antikörper) beobachtet. </li></ol> 10. Spectral Spill Over Compensation <ol><li> Öffnen Sie den &quot;Geräteeinstellungen&quot;-Box (in allen Instrument-Software-Programme vorhanden). Hinweis: Wenn Sie ein anderes Instrument aus dem in der Materialtabelle gemeldet Sie bitte der gerätespezifischen Handbuch für den Erwerb Details. </li><li> Erwerben unbehandelten Probe (ohne Nanopartikel) bei niedrigen Fluidgeschwindigkeit (wenn von dem Gerät erlaubt). Während der Erwerb, die manuell nach vorne durch die Regelung der Spannungskanäle einstellen und Seitenstreuung (FSC und SSC, beziehungsweise). Hinweis: Ändern Sie die Achsenskalen SSC und FSC, um die komplette Zellpopulation in der Handlung am besten visualisieren. Ein Instrument Einstellung Vorlage für jeden Zelltyp von Interesse können erstellt, gespeichert und für zukünftige Akquisitionen eingesetzt. </li><li> Öffnen Sie die spezifischen&quot;Region&quot;-Reiter in der Software. Zeichnen Sie eine geeignete große Region (&quot;Tor&quot;) um den gewünschten Bevölkerung. Hinweis: Internalisierung von Nanopartikel induziert eine SSC Verschiebung der Zellen. Wenn das Tor zu eng um die Zellpopulation von Interesse beschränkt ist, werden die erfassten Daten wahrscheinlich vermissen Teil der Zellen erkannt werden. </li><li> Verwenden Sie zwei ungefärbten Proben, eine für die Verwendung als Blindprobe und ein Ersatzanspruch gegen PI-Färbung (optional), ein Einzel-gefärbten Probe mit der entsprechenden Fluorochrom für jeden Fluoreszenzkanal ausgeglichen werden. Hinweis: Verwenden Sie einen anderen 1,5 ml Probenröhrchen für jedes Fluorochrom-konjugierte Antikörper im Experiment Kennzeichnung verwendet werden. </li><li> Öffnen Sie die &quot;Vergütung Registerkarte&quot; in der &quot;Geräteeinstellungen&quot; ein. Erhöhen oder verringern den Kompensationsfaktor bei der Akquisition bis die Fluoreszenzintensität in der Spillover-Kanal ist in etwa das gleiche für das Fluorochrom postive und negative Bevölkerung. </li><li> Erwerben Nanopartikel-behandelten Proben nach dem Ausgleich wurde angepasst. </li></ol>

<ol>
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Die Autoren erklären, dass Miltenyi Biotech GmbH hat die Einreichung dieser Arbeit gefördert. HiQ-Nano Company ( <a href="http://www.hiq-nano.com/index.html">http://www.hiq-nano.com/index.html</a> ) ist ein Spin-off-Unternehmen der Nanotechnologie aus IIT entstanden.

Das experimentelle Protokoll zeigt sehr wichtige Punkte berücksichtigt werden. Es ist wirklich wichtig, bei 4 ° C (auf Eis) und möglicherweise in der Dunkelheit in all den Färbeschritte arbeiten, weil höhere Temperaturen und Licht kann sich negativ auf die Färbung Ausbeute. Nanopartikel könnten beschallt werden, um kurz vor der Verwendung besser resuspendiert werden. Eine korrekte Durchflusszytometrie Analyse erfordert eine korrekte Kalibrierung in den verschiedenen Kanälen. Die Kalibrierung des Gerätes sollte vor jeder experimentellen Sitzung durchgeführt werden. Neben den technischen Problemen mit der Instrumentierung, kann es auch Probleme mit der Antikörpermarkierung sein. Es ist zwingend erforderlich, um den Antikörper in einer geeigneten Konzentration zu verwenden. Ist die Konzentration zu hoch oder zu niedrig ist, kann unbefriedigend Signalintensitäten die Folge sein. Die Nachteile dieses Verfahrens betreffen die Notwendigkeit des Arbeitens mit monodispersen Proben, die Unfähigkeit zu lokalisierenUrsprungsort des Signals (dh verschiedene zelluläre Kompartimente). Es gibt auch einige Grenzen bei der Auswahl von Fluorochromen, die in Kombination verwendet werden: die Wellenlänge der Anregungs-und Emissionsbanden ausreichend getrennt sein, um ihre entsprechende Mess ermöglichen. Wenn die verwendete Antikörper Spektren überlappen, wird eine korrekte Kompensation erforderlich. Durchflusszytometrie ist ein leistungsfähiges Verfahren zur Zellanalyse in Gegenwart oder Abwesenheit von Nanopartikeln. Diese Technik erlaubt eine multi Untersuchung einer Zelle, eine hohe Anzahl von Ereignissen untersucht, Schnelligkeit der Analyse (mehr als 1.000 Zellen / sec), Reproduzierbarkeit und statistische Messwerte. Proben können, ohne die Lebensfähigkeit der Zellen verarbeitet werden. Durch die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Nanoteilchen ist es möglich, in Zellpopulationen, die durch spezifische Marker auf der Zellmembran exponiert identifiziert qualifizieren und zu quantifizieren, die Internalisierung. Zellparameter können in Anwesenheit von s ändern<html> pecific Nanopartikel. Je nach Ziel der Forschung können diese Variationen verwendet, um ein spezifisches Phänomen zu identifizieren, wie Seitenstreuung der Zellen, die proportional mit der Erhöhung der Nanopartikel Internalisierung Rate erhöht werden. Nanopartikel-induzierte Modifikationen der Zelloberfläche kann auch einen Einschränkung der Technik. Aus diesem Grund müssen Zellmembranrezeptoren Umsatz immer in Betracht gezogen werden und möglicherweise im Voraus bekannt ist, genau zu charakterisieren die Zellpopulation von Interesse. Extreme Beeinträchtigungen der Membranosmose in Nanopartikel überlastet Proben können zum Zelltod führen. Nanomaterial dosisabhängigen Toxizität sollte empirisch für jede Zellpopulation getestet werden. Klar definierte toten Zellen müssen aus dem Fluoreszenz Quantifizierung ausgeschlossen werden. Beispielsweise ist Annexin V / PI-Färbung eines der mehreren Verfahren in der Regel verwendet, um sowohl nekrotische und apoptotische Zellen zu detektieren. &quot;&gt; GFP-exprimierenden Primärzellen sind auch ein leistungsfähiges Werkzeug, um eine bestimmte Zellpopulation wählen und Daten sammeln, ohne prelabeling. Die Kombination mit komplementären fluoreszierende Nanopartikel ermöglicht eine sehr schnelle und präzise Quantifizierung der Nanopartikel-Zell-Interaktion. Drug oder Gentransfer wird gedacht, um in der Zukunft durch die Anwendung von Nanopartikeln in der Lage, eine bestimmte Arzneimittelmenge in ausgewählten Geweben frei verbessert werden. Beschäftigung von Nanopartikeln als spezifische Liefer Trägern und / oder Immunmodulatoren für Pharmazie erfordert die Kenntnis der biologischen Umgebung (zB durch Durchflusszytometrie) Zell-Nanopartikel-Interaktionen zu untersuchen.

Nanomaterialien werden heute inspiriert das Interesse der Lebenswissenschaftler für potentielle Anwendungen der Biomedizin ein. Eine Vielzahl von anorganischen und organischen Materialien verwendet werden, um Nanostrukturen mit unterschiedlichen Formen, physikalische und chemische Eigenschaften zu erzeugen. Unter diesen Strukturen, Nanopartikel von Kugelform gezeigt, ein großes Potenzial für diagnostische und translationale Medizin 2. Ihre Kern-und Oberflächengestaltung sind durch eine mögliche Anwendung angetrieben und impliziert eine tiefgreifende Untersuchung der Zielzelle Reaktionen nach Nanopartikel Kontakt und Interaktion. Nanopartikel, die vermutlich absichtlich an Menschen verabreicht wird, in direktem Kontakt mit mehreren Typen von Immunzellen sind. Ihre Verantwortung, um den Körper Integrität zu erhalten macht sie zu einem entscheidenden Thema der Untersuchung in der Nanomedizin 3. Die zelluläre Teil des angeborenen Immunsystems ist vor allem durch phago vertretenzyten. Unter ihnen der Monozyten / Makrophagen-Linie abgeleiteten Zellen, einschließlich der zentralen Nervensystems ansässig Mikroglia, eine wichtige Rolle in der Immunabwehr 4,5. Sie sind in der Lage, Schutz Antworten innerhalb weniger Stunden nach der Begegnung mit Fremdkörpern auslösen. Darüber hinaus sind die Monozyten zu koordinieren und beauftragen die adaptive Immunantwort durch die Freisetzung von Zytokinen. Alle diese Ereignisse auftreten, auch in Gegenwart von synthetischen Materialien, die im Wesentlichen als &quot;Nicht-Selbst&quot; durch das Immunsystem 6 wahrgenommen werden. Unter den historisch in der Immunologie für die Zellanalyse verwendeten Methoden, Durchflusszytometrie ist eine der mächtigsten Werkzeuge. Darüber hinaus ist die Verfügbarkeit von Technologien zur Identifizierung oder Reinigung einer spezifischen Immun Subpopulation (oft die Nutzung der Ausschluss oder die Anwesenheit einer einzigen Membran-Protein) ermöglicht eine genaue Untersuchung der Auswirkungen eines bestimmten Nanopartikel auf, dass insbesondere Primär cell Typ 7. Jedoch können Zellen physiologische und morphologische Veränderungen nach der Exposition mit Nanopartikeln zu präsentieren. Wie gut, kann Nanopartikeln mit spezifischen optischen Parameter wie Absorption oder Emission von Licht bei definierten Wellenlängen stören, die Beeinflussung der Ergebnisse 8. Also, sollten Grenzen der Nutzung und eventuellen Anpassungen der klassischen immunologischen Tests auf die Untersuchung von neuen Materialien berücksichtigt werden. Diese Arbeit bezieht sich auf die Erfassung von Nanopartikel-Interaktionen mit primären Immunzellen mittels Durchflusszytometrie. Um dieses Problem zu lösen, 50 nm FITC-SiO 2-Nanopartikel wurden als Modell Nanomaterialien, um die Methode zu beschreiben beschäftigt. Silicapartikel können in einer sehr präzisen Art und Weise im Nanometerbereich erzeugt werden. Größe, Form und Oberflächeneigenschaften wie Ladung oder Hydrophobie, fein abgestimmt werden, um ihre Biokompatibilität 9 erhöhen. Viele Funktionen von SiO 2-Nanopartikel es ihnen ermöglichen, als verwendet werdenModell für die Arzneimittelabgabe Partikel 10. Darüber hinaus können Fluoreszenzfarbstoffen oder Quantenpunkte eingeschlossen oder an diese Partikel bietet nützliche Werkzeuge für Nano-Bildgebung 11 verknüpft werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="753">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">HBSS</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">14170-088</td>
			<td style="width:256px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640 (ATCC Modified)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10491-01</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, High Glucose, phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horse Serum (lot n&#176; 1131917)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beta-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin 2.5%</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Pooled Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>34005100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Versene</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td>15040-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNAse I</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D5025-150KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD11b-VioBlue human &#38; mouse</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MACS BSA Stock Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">autoMACS Rinsing Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Running buffer</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-092-747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">autoMACS Running Buffer</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Human Pan monocyte isolation kit&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Whole Blood Column Kit</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Whole Blood CD14 MicroBeads, human</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MS Column</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">LS Column</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MidiMACS Separator</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MiniMACS Separator</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Red Blood Cell Lysis Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-094-183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Pre-Separation Filters 30 &#181;m</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MACSQuant Analyzer flow cytometer</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-092-197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MACSQuant Calibration Beads</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ficoll-Paque Premium</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">GEH17544202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:272px;">FITC-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV)</td>
			<td style="width:107px;">HiQ-Nano Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:272px;">Rhodamine-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV)</td>
			<td style="width:107px;">HiQ-Nano Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">12-well plate Falcon</td>
			<td style="width:107px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">353043</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of fluorescent nanoparticle interactions with primary immune cell subpopulations by flow cytometry

Nanopartikel sind mit sehr viel versprechende Eigenschaften für therapeutische und diagnostische Zwecke dotiert. Diese Arbeit beschreibt eine schnelle und zuverlässige Methode der Analyse mittels Durchflusszytometrie, um Nanopartikel Interaktion mit Immunzellen zu studieren. Primäre Immunzellen können leicht von Mensch oder Maus-Geweben durch Antikörper-vermittelte magnetische Isolierung gereinigt werden. Im ersten Fall können die unterschiedlichen Zellpopulationen in einem Durchflußzytometer ausgeführt von der Vorwärtsstreulicht (FSC), die proportional zur Zellgröße und der Seitenstreulicht (SSC), bezogen auf internen Komplexität der Zelle unterscheiden. Weiterhin fluoreszenzmarkierten Antikörper gegen spezifische Zelloberflächenrezeptoren ermöglichen die Identifizierung mehrerer Subpopulationen innerhalb der gleichen Probe. Oft, alle diese Funktionen variieren, wenn die Zellen durch äußere Reize, die ihre physiologischen und morphologischen Zustand ändern gesteigert werden. Hier, 50 nm FITC-SiO 2-Nanopartikel als Modell verwendet werden, um th zu identifizierenE Internalisierung von nanostrukturierten Materialien im menschlichen Blut Immunzellen. Die Zellfluoreszenz-und Seitenstreulichtzunahme nach Inkubation mit Nanopartikeln uns erlaubt, Zeit-und Konzentrationsabhängigkeit der Nanopartikel-Zell-Interaktion zu definieren. Darüber hinaus können solche Protokoll erweitert werden, Rhodamin-SiO 2-Nanopartikel Wechselwirkung mit primären Mikroglia, die das zentrale Nervensystem resident Immunzellen, isoliert aus mutanten Mäusen, die speziell in den Monozyten / Makrophagen-Linie zu drücken das Green Fluorescent Protein (GFP) untersucht. Schließlich Durchflusszytometrie Daten Nanopartikel Internalisierung in die Zellen beziehen, die durch konfokale Mikroskopie bestätigt.

Durchflusszytometrie ist ein nützliches Werkzeug zur Identifizierung und Charakterisierung verschiedener Zellen, und es ist die Technik der Wahl, um spezifische Immunzellen, wie Monozyten, Granulozyten, T-Zellen, B-Zellen, natürliche Killerzellen (NK)-Zellen, dendritische Zellen (DCs) zu identifizieren, und andere Subpopulationen von Leukozyten. Bei den Bemühungen um eine bessere Charakterisierung weißen Blutkörperchen Verhalten in Reaktion auf Nanopartikeln, führten wir Internalisierung Assays mit primären Leukozyten aus dem Blut von gesunden Spendern (1 und 2) und mit menschlichen Monocyten-Zelllinie isoliert (THP-1-Zellen, Fig. 3) . Wie in 1A berichtet, die drei großen Blut Leukozyten-Subpopulationen wurden eindeutig durch Vorwärts-und Seitenstreuung nach PBMCs Isolierung identifiziert. Darüber hinaus wurde nach FITC-SiO 2-Behandlung, Lymphozyten (grau), Monozyten (blau) und Granulozyten (rot) haben eine andere nanoparticle Internalisierung Rate von grünen Fluoreszenzintensität (Abbildung 1B) gezeigt. Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Reinigung von CD14-positiven primären Monozyten aus PBMCs. 2A berichtet die Durchflusszytometrie Punktdiagramm von CD14 + Monocyten in Gegenwart von FITC-SiO 2. 2B zeigt FITC-SiO 2-Internalisierung in dieselben Zellen quantifiziert und ausgedrückt logarithmischen Skala Histogramm. Ähnliche Experimente wurden an Internalisierung THP-1 Monozyten mit steigenden Konzentrationen von FITC-SiO 2-Nanopartikeln behandelt geführt. Unbehandelte Zellen wurden als negative Kontrolle verwendet. 3A zeigt eine Dosis-abhängige Zunahme der Seitenstreuung bei unveränderter Vorwärtsstreuung in THP-1-Zelllinie. In 3B zusammen mit den Histogrammen der SSC und FSC an jedem FITC-SiO 2-Nanopartikel-Konzentration getestet, mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) Quantifizierung wird vorgestellt. Diese Daten legen nahe, dass die Behandlung mit FITC-SiO 2-Nanopartikel induziert eine dosisabhängige Internalisierung in Monozyten durch die Erhöhung der intrazellulären Granularität (Seitenstreuung) und Fluoreszenz (Grün-Kanal) markiert. Um weitere Einblicke in die Art der Interaktion zwischen Immunzellen und Nanopartikeln zu gewinnen, wurden primären gemischten Glia-Kulturen isoliert und Mikroglia, die das zentrale Nervensystem Wohnsitz Immunzellen, wurde gereinigt. Die Verwendung eines transgenen Mausmodells grün fluoreszierenden Mikroglia exprimiert ermöglicht die Visualisierung der verschiedenen Neuroentzündungsmechanismen. Transgene Maus B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J in dieser Arbeit verwendeten drückt das grün fluoreszierende Protein (GFP) unter der Kontrolle des Promotors 12 CX3CR1. Nach 7 Tagen in vitro (DIV), der Fluoreszenzmikroskopie zeigt eine gemischte primäre Gliazellen Kultur mit einer großen Anzahl von Astrozyten (GFP negativen adhärenten Zells) und einige grüne Zellen (GFP positiv, 5A). GFP - - (Astrozyten und andere Gliazellen), eine zweite bestimmte Gruppe von Mikroglia-CD11b + GFP +-Zellen, und eine der ersten CD11b: In diesem Mausmodell, drei Glia-Subpopulationen mittels Durchflusszytometrie mit einem einzigen CD11b-Antikörper-Färbung unterschieden werden dritte CD11b +-GFP - Subpopulation (Fig. 4A). Die beiden letztgenannten Subpopulationen sind beide in der Lage, Nanopartikel mit einem leichten erhöhten Effizienz verinnerlichen durch die GFP + Bevölkerung (die den patrouillieren unreifen Mikroglia durch die Transkription von CX3CR1 Promotor), wie Durchflusszytometrie (4B) gezeigt. Die aufgetreten Internalisierung kann durch konfokale Mikroskopie mit der gleichen Endkonzentration von Rhodamin-SiO 2-Nanopartikel, wie in 5B gezeigt, überprüft werden. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= &quot;Always&quot;&gt; <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. FITC-SiO 2-Nanopartikel-Internalisierung in isolierten Blut Leukozyten. A) Repräsentative Vorwärtsstreuung (FSC) gegen die Seitenstreuung (SSC) Durchflusszytometrie Dot-Plot von Ficoll-Paque isoliert Blut Leukozyten. B) Grün-Fluoreszenz-Histogramm-Overlay Plot der drei großen Blut-Leukozyten Zell-Subpopulationen in Anwesenheit von 1 nM FITC-SiO 2-Nanopartikeln (45 mV) für 1 Stunde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig2.jpg" /> <strong&gt; Abbildung 2. FITC-SiO 2-Nanopartikel-Internalisierung in CD14 + Monozyten gereinigt. A) Repräsentative Vorwärtsstreuung (FSC) gegen die Seitenstreuung (SSC) Durchflusszytometrie Dot-Plot von gereinigten CD14 positive Monozyten. B) Grün-Fluoreszenz-Histogramm Plot des gereinigten Monozyten-Subpopulation in Anwesenheit von 1 nM FITC-SiO 2-Nanopartikeln (45 mV) für 1 Stunde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig3.jpg" /> 3. Auswirkungen von FITC-SiO 2-Nanopartikel Internalisierung auf THP-1-Zellen. A) Repräsentative Vorwärtsstreuung (FSC) gegen die Seiten scattering (SSC) Durchflusszytometrie Dot-Plot von THP-1-Monozyten-Zelllinie, nach 1 h Exposition von FITC-SiO 2-Nanopartikel zunehmende Konzentration. B) Konzentrationsabhängige Variation der Seitenstreuung (SSC), Vorwärtsstreuung (FSC) und Grün Fluoreszenz in Gegenwart von FITC-SiO 2-Nanopartikeln (45 mV) für 1 Stunde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig4.jpg" /> 4. Rhodamin-SiO 2-Nanopartikel-Internalisierung in primären Mikroglia aus B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J-Mäusen isoliert. A) Green Fluorescent Protein (GFP) gegen CD11b-VioBlue Durchflusszytometrie Dot-Plot von primary gemischten Glia aus B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J-Mäusen isoliert. CD11b + GFP + und CD11b + GFP -. Populationen sind in der oberen rechten und unteren rechten Quadranten, bzw. B) Rot-Fluoreszenz-Histogramm-Overlay Grundstück von Mikroglia-Subpopulationen in Anwesenheit von 1 nM Rhodamin-SiO 2-Nanopartikeln (45 mV) für 30 gezeigt min (rote Histogramm) gegenüber der Kontrolle (grau Histogramm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig5.jpg" /> 5. Visualisierung von GFP +-Mikrogliazellen. (A) Fluoreszenzmikroskopie bei 7 DIV und (B) konfokale MikroskopieRhodamin-SiO 2-Nanopartikel-Internalisierung (rote Pfeile) in GFP +-Mikrogliazellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig5highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Analyse der Nanopartikel Wechselwirkung mit definierten Untergruppen der Immunzellen durch Durchflusszytometrie.

Detektion von fluoreszierenden Nanopartikel Wechselwirkungen mit primären Immun-Zell-Subpopulationen durch Durchflusszytometrie

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

detection-fluorescent-nanoparticle-interactions-with-primary-immune

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.4K Aufrufe.  Istituto Italiano di Tecnologia.  Analyse der Nanopartikel Wechselwirkung mit definierten Untergruppen der Immunzellen durch Durchflusszytometrie. 

Serie: Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

Mess-Calpain Aktivität in fixierten und lebenden Zellen mittels Durchflusszytometrie

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true quantitative analysis of cellular inflammation. Flow cytometry is a quick alternative method to quantify immune cells in the injured brain or spinal cord tissue. Historically, flow cytometry has been used to quantify immune cells collected from blood or dissociated spleen or thymus, and only a few studies have attempted to quantify immune cells in the injured spinal cord by flow cytometry using fresh dissociated cord tissue. However, the dissociated spinal cord tissue is concentrated with myelin debris that can be mistaken for cells and reduce cell count reliability obtained by the flow cytometer. We have advanced a cell preparation method using the OptiPrep gradient system to effectively separate lipid/myelin debris from cells, providing sensitive and reliable quantifications of cellular inflammation in the injured spinal cord by flow cytometry. As described in our recent study (Beck &amp; Nguyen et al., Brain. 2010 Feb; 133 (Pt 2): 433-47), the OptiPrep cell preparation had increased sensitivity to detect cellular inflammation in the injured spinal cord, with counts of specific cell types correlating with injury severity. Critically, novel usage of this method provided the first characterization of acute and chronic cellular inflammation after SCI to include a complete time course for polymorphonuclear leukocytes (PMNs, neutrophils), macrophages/microglia, and T-cells over a period ranging from 2 hours to 180 days post-injury (dpi), identifying a surprising novel second phase of cellular inflammation. Thorough characterization of cellular inflammation using this method may provide a better understanding of neuroinflammation in the injured CNS, and reveal an important multiphasic component of neuroinflammation that may be critical for the design and implementation of rational therapeutic treatment strategies, including both cell-based and pharmacological interventions for SCI.

Quantification of cellular inflammation in the injured/pathological CNS by flow cytometry is complicated by lipid/myelin debris that can have similar size and granulation to cells, decreasing sensitivity/accuracy. We have advanced a cell preparation method to remove myelin debris and improve cell detection by flow cytometry in the injured spinal cord.

Quantitative Beurteilung der Immunzellen in das verletzte Rückenmark Tissue mittels Durchflusszytometrie: eine neue Verwendung für eine Zelle Reinigungsverfahren

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, in particular, are known to migrate to the lung draining lymph nodes (LDLNs) where they present inhaled antigens to T cells initiating an 
appropriate immune response to a variety of immunogens1,2. To model interactions between the lungs and airborne antigens in mice, antigens can be 
administered intranasally1,3,4, intratracheally5 or as aerosols6. Delivery by each route involves distinct technical skills and limitations that need to be 
considered before designing an experiment. For example, intranasal and aerosolized exposure delivers antigens to both the lungs and the upper respiratory 
tract. Hence antigens can access the nasal associated lymphoid tissue (NALT)7, potentially complicating interpretation of the results. In addition, swallowing, 
sneezing and the breathing rate of the mouse may also lead to inconsistencies in the doses delivered. Although the involvement of the upper respiratory tract may 
be preferred for some studies, it can complicate experiments focusing on events specifically initiated in the lungs. In this setting, the intratracheal (i.t) 
route is preferable as it delivers test materials directly into the lungs and bypasses the NALT. Many i.t injection protocols involve either blind intubation of the 
trachea through the oral cavity or surgical exposure of the trachea to access the lungs. Herein, we describe a simple, consistent, non-surgical method for i.t 
instillation. The opening of the trachea is visualized using a laryngoscope and a bent gavage needle is then inserted directly into the trachea to deliver the 
innoculum. We also describe procedures for harvesting and processing of LDLNs and lungs for analysis of antigen trafficking by flow cytometry.

We illustrate non-surgical delivery of test materials into the lungs of anesthetized mice via the trachea. This method permits lung exposure to bacterial and viral pathogens, cytokines, antibodies, beads, chemicals, or dyes. We further describe harvesting and processing of lungs and lung draining lymph nodes (LDLNs) for flow cytometry.

Nicht-chirurgische Intratrachealbiopersistenztest von Mäusen mit Analyse der Lungen-und Lungenforschung Lymphknoten mittels Durchflusszytometrie

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Durchflusszytometrie-Analyse von Immunzellen innerhalb Murine Aorten

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Mensch In Vitro Suppression als Screening-Tool für die Anerkennung von Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Studieren Wechselwirkungen von<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Mit Neutrophilen durch Durchflusszytometrie und Mikroskopie Zeitraffer

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Reinigung von Plasmazytoide dendritischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

Nachweis von<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Variante Oberflächen-Glykoprotein Switching von Magnetic Activated Cell Sorting und Durchflusszytometrie

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolation und In-vitro- Kultur von murinen und menschlichen alveoläre Makrophagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. Setup of a classic multicolor panel requires high-end instruments, custom labeled antibodies, and careful study design to minimize spectral overlap. We developed a multiparametric analysis to identify major human immune populations (CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes) in peripheral blood by combining seven lineage markers using only two fluorochromes. Our strategy is based on the observation that lineage markers are constantly expressed in a unique combination by each cell population. Combining this information with a careful titration of the antibodies allows investigators to record five additional markers, expanding the optical limit of most flow cytometers. Head-to-head comparison demonstrated that the vast majority of immune cell populations in peripheral blood can be characterized with comparable accuracy between our method and the classic &#34;one fluorochrome-one marker approach&#34;, although the latter is still more precise for identifying populations such as NKT cells and &#947;&#948; T cells. Combining seven markers using two fluorochromes allows for the analysis of complex immune cell populations and clinical samples on affordable 6-10 fluorochrome flow cytometers, and even on 2-3 fluorochrome field instruments in areas with limited resources. High-end instruments can also benefit from this approach by using extra fluorochromes to accomplish deeper flow cytometry analysis. This approach is also very well suited for screening several cell populations in the case of clinical samples with limited number of cells.

Here, we present a flow cytometric protocol to identify CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes in human peripheral blood by using only two fluorochromes instead of seven. With this approach, five additional markers can be recorded on most flow cytometers.

Diskriminierung von sieben Immunzelle Teilmengen von zwei-Fluorochrom Flow Cytometry

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...