Name: protocol for studying extinction of conditioned fear in naturally cycling female rats
Uploaded: 2015-02-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Studying Extinction of Conditioned Fear in Naturally Cycling Female Rats at JoVE.com

Mohammed R. Milad is supported by NIMH grant R01 MH097880 and institutional funds from the Department of Psychiatry at MGH.

HINWEIS: Alle Verfahren in diesem Protokoll wurden von der Unterausschuss für Forschung Tierpflege, die als Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) für das Massachusetts General Hospital dient zugelassen und sind in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Richtlinien. 1. Tierhaltung und Handhabung Vorgehens <ol><li> Bei der Ankunft Haus erwachsenen Sprague-Dawley weiblichen Ratten etwa 8-10 Wochen alt (mit einem Gewicht von 200 bis 225 g) in Gruppen von 3-4 Zoll-Kunststoff-Behälter mit Rauhfaser Bettwäsche. Halten sie auf einer Ernährung ad libitum Zugang zu Futter und Wasser und einem 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus. Verlassen Ratten an die Haltungsbedingungen und Tiereinrichtung für mindestens 1 Woche akklimatisiert. HINWEIS: Alle Verfahren in diesem Manuskript während des Lichtzyklus durchgeführt. </li><li> Nach dieser Eingewöhnungszeit, behandeln alle Tiere für 5 Minuten jeweils für 2-3 Tage. Richtig holen die Ratten ein zu einer Zeit (von der Oberkörper und nicht am Schwanz unterstützt),halten sie sicher und streicheln während dieser Zeit. Behandeln Tiere, die mehr gestresst, nervös, ängstlich oder für längere Zeit angezeigt. Tun Sie dies, um zu minimieren Umgang mit Stress, die die folgenden Schritte in diesem Protokoll beeinträchtigen könnten. HINWEIS: Die Anzahl der Tage, und die Menge an Zeit der Handhabung der Tiere können zwischen verschiedenen Labors zu variieren; Allerdings sollten diese im Einklang zwischen den Experimenten im selben Labor sein. </li></ol> 2. Überwachung des Zyklus: Vaginal Swab Verschmieren und Färbeverfahren <ol><li> Machen 0,9% Kochsalzlösung (in destilliertem Wasser gelöst, Natriumchlorid). Befeuchten Sie ein Wattestäbchen in dieser Lösung. Tupfen Sie die Spitze mit einem Papiertuch, um Übersättigung, was zu einer unzureichenden Probennahme oder den Verlust von Zellen führen können. Halten Sie das Heck nach oben weg von der Vagina, führen Sie den Wattestäbchen in den Vaginalkanal und rollen an den Wänden, um lose Vaginalzellen erfassen. </li><li> Wenn das Tier uriniert auf dem FeldbettTonnen-Spitze, zu ersetzen durch eine neue, wie Urin Kontamination wird es für die Phasenanalyse erschweren. Seien Sie besonders vorsichtig, um Qualen des Tieres bei diesem Verfahren nicht dazu führen, weil die Belastung durch Stress den Sexualzyklus zu unterbrechen. Wenn Abtupfen, zielen darauf ab, einen schnellen Einsetzen und Herausziehen, die nicht zu tief, dass zusätzliche Stimulation des Gebärmutterhalses, die Scheinträchtigkeit induzieren kann minimieren erzielen. HINWEIS: Pseudogravidität kann als azyklische Sexualzyklus, die in der Regel dauert etwa 12 Tage, dh aufeinander folgenden Tagen der Diöstrus 25 identifiziert werden. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Applikatorspitze und rollen sie auf eine vorge markierten Objektträger. Drücken Sie nicht zu hart als zu viel Flüssigkeit auf dem Objektträger kann Phasenidentifikation schwer, wenn trockene machen. HINWEIS: Eine Folie kann mehrere Tage für jedes Tier enthalten, obwohl dies kann den individuellen Wünschen entsprechend durchgeführt werden. </li><li> Sicherstellen, dass die Probentransfers auf die Folie. Die Proben werden für several aufeinander folgenden Tagen auf einer Folie, um eine bessere Übersicht und identifizieren täglich Östrus-Phasen ändert. HINWEIS: Wenn möglich, ist es ideal, wenn die Menschen, Sammeln von Proben gleich bleiben für alle Tiere. </li><li> Sobald die Schiene trocken ist, beginnen die Färbeprotokoll für Phase Identifikation. Mit dem Färbekit (siehe Tabelle der Materialien), tauchen Folien 10 Mal in der Fixiermittel (hellblau), 10 Mal in Färbelösung (pink) und 5 mal in Gegenfärbelösung (lila). Rinse gleitet sanft unter fließendem Wasser. Lassen Sie Folien vollständig an der Luft trocknen, bevor Betrachtung unter dem Mikroskop. HINWEIS: Die in der Regel 4-5 Tage lang Sexualzyklus besteht aus (in dieser Reihenfolge): Brunst (E), Metöstrus (M), Diöstrus (D), und Proöstrus (P) 26. Östrus durch blaue, verhornten Zellen Metöstrus von Leukozyten und einer Kombination von verhornten und kernhaltige Zellen gekennzeichnet ist Diöstrus ähnlich in Gegenwart von Zelltypen Metöstrus außer daß sie sehr schwach sind und Proöstrus von lila-gefärbten Zuschlagkernhaltiger Zellen (Abbildung 1). Es gibt verschiedene Färbeverfahren, zusätzlich zu den oben beschriebenen, die gleichermaßen wirksam Vaginalabstrich Zytologie sind. </li><li> Die Proben werden für mindestens zwei vollständige Zyklen (~ 8-10 Tage), um die Phasen genau vor dem Experiment zu überwachen. Im Einklang mit der Tageszeit die Proben entnommen werden. Sammeln Vaginalabstrich Proben täglich während und bis zum Ende des Experiments. </li></ol> 3. Pre-Exposition <ol><li> Vor dem Beginn des Experiments wurden die Tiere vorge aussetzen Konditionierungskammern, um den Tieren zu Rahmen (Konditionierkammern) vor jedem Verhaltenstests akklimatisieren. <ol><li> Pre-setzen die Frauen zu den Klimakammern (in schalldämpfenden Boxen befindet) mit den Haus Lichter an für 20-30 Minuten pro Tag für 3 Tage vor jedem Experiment. Weisen Sie das Feld sie vorbelichteten als ihre Kammer für das Studium sind. Gründlich reinigen ter Boxen (Wände und Böden) zwischen den Sitzungen und Tiere, um Gerüche zu entfernen, da sie das Verhalten und Sexualzyklus beeinflussen. </li></ol></li></ol> 4. Tag 1: Habituation / Angstkonditionierung <ol><li> Sobald die Tiere wurden überprüft, um in der Brunst Phase ihrer Ovarialzyklen sein, beginnen die Gewöhnung / Anlage Phase des 3-Tage-Experiment. <ol><li> Nehmen Sie vor dem Ton Basis Maßnahmen des Einfrierens vor dem ersten Ton bedingten Reiz (CS) Präsentationen an jedem Tag des Experiments. Tun Sie dies durch den Kauf Prozent Einfrieren Scores während der Stimulus-abwesend Zeitintervall zu Beginn der ersten CS-alone Prozess vor dem Beginn CS (durch Division der Sekunden bewegungslos verbracht um die Dauer der Studie, multipliziert mit 100 berechnet). HINWEIS: Diese Maßnahmen können verwendet werden, um zu beurteilen und zu vergleichen Baseline Gefrierpunkt Ebenen mit denen während der Gewöhnung, Anlage, Aussterben und Rückruf werden. </li><li> Zum Aussterben Ausbildung während der Metöstrus Phase durchzuführen,bedingen die Ratten in ihren letzten Tag des Östrus. Swab und identifizieren Östrus-Phase (Schritt 2) jeden Tag vor Beginn der Versuchsprotokoll (Anlage / Untergang / Recall). Wie der Brunst Phase kann länger als einen Tag dauern, Einsatzzyklus Geschichte Länge Phasen vorherzusagen, um festzustellen, wenn die Tiere sind bereit, Training zu beginnen. </li></ol></li><li> In den Klimakammern, schließen Sie das Fuß-Schock-Gitterboden mit einer elektrischen Stimulationsgenerator. Verwenden Sie einen Reizpegel von 0,5 bis 0,6 mA als unbedingten Reiz (USA). Verwenden Sie ein 4 kHz, 80 dB Ton als konditionierter Stimulus (CS). ANMERKUNG: Diese Parameter können in Laboratorien variieren und kann für eine optimale Anlage verändert werden. <ol><li> Wenn das Einfrieren-Analyseprogramm erfordert visuellen Hinweisen (im Gegensatz zu temporal), Co-Aktivierung eines LED-Licht mit dem Ton. Lichtposition auf der Außenseite der operKammer innerhalb des Videoframes. Zu Beginn jeder Studie, aktivieren Sie die LED-Licht und bewahren Sie es bis zum Ende des th beleuchtetE-Studie. HINWEIS: Dieses Licht ist nicht durch das Tier zu sehen und nur als Marker für die Einleitung und Ende des Prozesses innerhalb der aufgenommenen Videodateien dient (zu verwenden, um Gefrierverhalten zu messen). </li></ol></li><li> Legen Sie die Tiere in den Klimakammern für 5 CS-alone-Studien der Gewöhnung. Unmittelbar nach der Gewöhnungssitzung durchführen 7 gepaart CS-US-Studien der Angstkonditionierung. Stellen Sie sicher, dass die CS-Ton dauert 30 Sekunden und coterminates mit 0,5 s US Schock. Führen Sie Prüfungen in allen Sitzungen (Gewöhnung Anlage, Aussterben und Rückruf) mit einer variablen intertrial Abschnitt mit durchschnittlich 3 Minuten. </li><li> Am Ende des Konditionierungssitzung zurück, die Tiere in ihre Heimatkäfige und auf die Tierhaltung bis zum nächsten Tag. </li></ol> 5. Tag 2: Estradiol Vorbereitung <ol><li> Swab und Identifizierung der Östrus-Phase für alle Tiere, die Tag 1 unterzog dieses Protokolls. Bereiten Estradiol (auch als E2, 17ß-Östradiol oder bekanntebeta-Estradiol) für eine 15 &amp; mgr; g / kg Dosis subkutan mit Sesamöl oder 0,9% Kochsalzlösung als Vehikel. </li><li> Um die Menge von Estradiol zu berechnen, um für Injektionszwecke zubereiten, verwenden Sie die Körpergewichte der Tiere, die gemessen und aufgezeichnet wurden, als sie am Tag 1 des Protokolls konditioniert wurden. </li><li> Machen Sie Berechnungen, um die verabreichte Volumen von Estradiol (dh 0,2 ml) pro Ratte zu standardisieren. Da Estradiol schwer zu lösen ist aufgrund seiner Wasserunlöslichkeit und erfordert ein großes Volumen an Lösungsmittel für die geringe Dosis, wird eine Stammlösung durch Mischen von Estradiol in Sesamöl über Hitze bis gelöst. Die Lösung kann dann durch ein 0,22 um-Filter geleitet werden, um Verunreinigungen zu entfernen. Fügen Sie beispielsweise ein berechnetes Volumen einer 3,000 ug Estradiol / 1 ml Sesamöl Stammlösung auf die gesamte benötigte Menge Sesamöl, um eine 15 &amp; mgr; g / kg Dosis in einem 0,2 ml Injektionsvolumen pro Tier zu erzielen. Hinweis: Alternativ können Sie auch andere Formen der Östrogen tha<html> t wasserlöslich sind und leichter zu lösen. </li></ol> 6. Tag 2: Estradiol Verwaltung / Extinction Ausbildung <ol><li> Verwalten des Estradiol subkutan. Heben Sie die lose Haut zwischen den Schulterblattes durch den Hals in einer leichten Prise und legen Sie die Spritzennadel in das Dreieck, das von den Hautfalten gebildet wird. </li><li> 30 Minuten nach der subkutanen Injektion von Estradiol, legen Sie die Tiere in den Klimakammern wieder und beginnen Aussterben Ausbildung. In dieser Extinktion Sitzung auszuführen 20 CS-alone-Studien mit jedem Versuch, die aus einem 30 sec, 4 kHz, 80 dB-Ton, mit einer variablen intertrial Abschnitt mit durchschnittlich 3 min dargestellt. HINWEIS: Die Wirkung von Östradiol auf Rückruf erfolgt, wenn Östradiol vor der Ausrottung Training oder unmittelbar nach dem Aussterben verabreicht. Der Effekt wird nicht beobachtet, 4 Stunden nach der Auslöschung, so empfiehlt es sich, zu injizieren zeitnah zu Beginn oder am Ende der Trainingseinheit 15. </li></ol>. le &quot;&gt; 7 Tag 3: Extinction Recall <ol><li> 24 Stunden nach dem Aussterben Ausbildung, Tupfer, die Tiere, die Tag 1 und 2 dieses Protokolls abgeschlossen. </li><li> Legen Sie die Tiere in ihren zugewiesenen Klimakammern (identisch mit Day 1 und 2). Beginnen Sie mit dem Aussterben Rückruf-Sitzung durch die Vorlage 3 CS-alone-Studien (drei Studien des Aussterbens Rückruf), die wie in Schritt 6.2 beschrieben von nur 3,80 dB CS-alone Versuche mit intertrial Abständen ähnlich zu den 20 Studien für Aussterben Training verabreicht besteht. </li><li> Nach Abschluss der Rückruf Sitzung zurück, die Tiere in ihre Heimatkäfige. </li></ol> 8. Datenanalyse <ol><li> Erwerben Verhaltensdaten durch Video und mit Computer-Software analysieren. HINWEIS: Einfrieren Partituren können auch manuell durch einen Experimentator, die blind für die medikamentöse Behandlung von Zeit Einfrieren Anfälle während der CS Präsentation der einzelnen Studie ist angerechnet werden, ausgedrückt als Prozentsatz der Zeit verbrachte Einfrieren während der Ton. Das Einfrieren istdurch vollständige Mangel an Bewegung, mit Ausnahme der Atmung während der 30 Sekunden CS-US-Studien definiert. Berechnen Prozent Einfrieren, indem man die Sekunden verbrachte Einfrieren (immobile) um 30 Sekunden (Dauer der Studie), multipliziert mit 100. </li></ol>

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Die Autoren des Manuskripts haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte offenlegen.

Angst Aussterben wurde ausgiebig bei männlichen Ratten mit den neuronalen Mechanismen der Vermittlung konditionierter Furcht Aussterben identifiziert und unter verschiedenen Manipulationen bewertet sucht. Relativ wenige Studien haben weiblichen Ratten oder die Rolle der Geschlechtshormone in Angst Aussterben sucht. Um die Wirkung von Östrogen auf Furchtextinktion speziell zu untersuchen, werden natürlich Radfahren weiblichen Ratten zu einem dreitägigen Verhaltensparadigma unterzogen. Dieses Verfahren besteht aus Gewöhnung / Anlage, Aussterben, und vom Aussterben Rückruf Phasen. Mit diesem Protokoll wurde gezeigt, dass weibliche Ratten während der Low-Östrogen Metöstrus Phase zeigen eine höhere Gefrierpunkt (oder wertgemindert Aussterben Rückruf) im Vergleich zu Frauen, die in High-Östrogen Proöstrus 15 ausgelöscht sind vom Aussterben geschult. Die Verabreichung von Estradiol während der Metöstrus Phase vor dem Aussterben Ausbildung moduliert die Konsolidierung des Aussterbens Speicher 16. Dies wird durch eine Abnahme der freezin nachgewieseng während Aussterben Rückruf. Gemeinsam unterstreichen diese Ergebnisse die Bedeutung der Durchführung von weiblichen Studien mit Augenmerk auf den Einfluss der Eierstockhormone und des Zyklus auf das Verhalten. Obwohl Kontrollversuche wurden hier nicht beschrieben wurde, ist es notwendig, die entsprechenden Kontrollen sind, dh ohne Aussterben Gruppen, um den Einfluss von Östrogen auf Prozesse im Aussterben Gedächtniskonsolidierung einbezogen weiter zu evaluieren. Der Zweck dieses Protokolls ist zweifach: 1), um die Effekte von Östrogen auf Anlage Furchtextinktion während bestimmter Phasen des Zyklus in intakten Tieren zu untersuchen, und 2) zu prüfen, wie akute Estradiol Ersatzlieferung während der weibliche ist in der Regel niedrige Östrogen Staat modulieren sein Verhalten. Durch die hier beschriebenen vaginalen Abstrichverfahren können die vier Phasen des Zyklus identifiziert werden: Brunst, Metöstrus, Diöstrus und Proöstrus. Dies erlaubt uns, das Verhalten zu bewerten, wenn Eierstockhormone such als Östrogen sind von Natur aus bei niedrigen und hohen Konzentrationen. Zum Beispiel der Östrogenspiegel niedrig sind während der Brunst (20-40 pg / ml), Metöstrus (15-20 pg / ml), und Diöstrus (25-40 pg / ml) Phasen, aber hoch im Proöstrus (~ 75 pg / ml) Phase des Zyklus 27,28. Diese Phasen unterscheiden sich nicht nur in hormonelle Milieu, sondern auch in der Dauer. Obwohl variable hat Proöstrus wurde beobachtet, dass in der Regel für 12 bis 14 Stunden dauern; Brunst für 25 bis 27 h; Metöstrus für 6 bis 8 h; und Diöstrus für 55 bis 57 h. Die Dauer jeder Phase kann länger oder kürzer als ein Tag (je nach dem Tier) sein, was zu einer 5-Tage-Zyklen, die 2 Tage entweder Diöstrus oder Östrus umfassen. Wie bereits erwähnt, Proöstrus und Metöstrus kürzere Phasen (14.12 und 08.06 h zuge) und darf fehlen. In diesem Protokoll ist es deshalb wichtig, bei der Verwendung von natürlich Radfahren Hormone des Tieres zu Interphasen-Unterschiede in der Fähigkeit zum Aussterben Training wieder zu prüfen, sorgfältig überwachen den Sexualzyklusvom Vortag. Der Sexualzyklus bei weiblichen Ratten, ähnlich wie das menschliche Menstruationszyklus, ist auch empfindlich auf zahlreiche externe Faktoren, wie Alter, Stress, Tageszeit, Wohnverhältnisse, Temperatur, etc., und sollte bei der Planung Experimente werden. Ein Tier kann azyklisch (extended Östrus / Diöstrus) geworden oder zeigen eine unregelmäßige Zyklus (kürzer als 4 Tage oder länger als 5 Tage) vor oder während der Studie. In diesem Fall würden die Tiere aus den experimentellen Analysen ausgeschlossen werden, wobei die während bestimmter Phasen des Zyklus streng Tests. Wichtig zu beachten sind Übergangsphasen, in denen die Proben mit Schleim gemischt, so dass es etwas schwierig, klar die spezifischen Zelltypen, die in jeder Phase zu charakterisieren identifizieren. Dies kann auch aufgrund der Zeit, des Tages, der Tupfer entnommen werden. Wenn es eine übermäßige Menge an Schleim-Ausfluss während Abstrich Sammlung als Folge der täglichen swabbing, so dass mehrere Handling Tagen ohne Abstrich gebenkann dieses Problem zu beheben. Zusätzlich zu den hier beschriebenen Östrus Phasenerkennungsverfahren können auch andere methodische Instrumente eingesetzt werden, um Maßnahmen der zirkulierenden Serum Eierstockhormonkonzentrationen zu erhalten. Beispielsweise kann Östrogenkonzentration in Blutproben unter Verwendung eines Enzym-gekoppelten Immunassay (ELISA) quantifiziert werden. In diesem Verfahren, Östrogene im Serum / Plasma-Proben zu einem spezifischen Anti-Östrogen-Antikörper, der an ein Enzym gebunden ist, zu binden. Das Substrat des Enzyms erzeugt eine Reaktion, die in einem sichtbaren Signal führt, wie einer Farbänderung, die mit einem Spektralphotometer gemessen werden kann. Dieses Werkzeug berechnet Absorption und eine Quantifizierung von Östrogenspiegel in der Probe. Dieses Verfahren kann bei der Beurteilung natürlich schwank Estradiolspiegel auf der Östruszyklus, und noch wichtiger, zu bestimmten Zeitpunkten während des Experiments. Es kann auch verwendet werden, um festzustellen, wie exogene Verabreichung von Östrogen kann Norm verändernal physiologischen Konzentrationen. Die Messung der Östrogenkonzentrationen von Blut kann Schwierigkeiten mit Phasenidentifikation beim Übergang Stadien zu verhindern, oder wenn Abstriche sind schwer zu lesen durch Schleim in den Proben. Leider kann dieses Verfahren sehr teuer geworden und Angebote verzögert Ergebnisse im Vergleich zu Vaginalabstrich Sammlung. Verfahren, um eine ausreichende Blutproben zu erhalten, z. B., über die Schwanzvene, orbitalen Sinus, Schwanz Snip und Vena saphena 29 kann unnötigen Stress für das Tier zu verursachen. Dies kann Hormonspiegel in kritischen Zeiten im Experiment auswirken, was zu ungenauen Messungen oder verzerrt. Mit Koffer Blut Estradiolspiegel zu messen ist Klemme und somit eine sehr begrenzte Informationen über hormonelle Schwankungen innerhalb der Phasen. Die Beurteilung vaginalen Zell Zytologie scheint eine bessere Alternative bieten. Obwohl diese Methode kann nur eine grobe Schätzung der Eierstockhormonprofile über Östrus Phasen, kann esminimieren Stress und anschließend weniger störend auf die Verhaltensexperiment. Es gibt verschiedene Formen von östrogenen Steroiden, die natürlicherweise im Umlauf sind bei Menschen und nicht-menschliche Tiere, wie Estriol, Estradiol und Estron. In diesem Protokoll wird Estradiol akut subkutane Injektionen verabreicht. Estradiol (Synonym E2, 17ß-Östradiol oder beta-Estradiol) in diesem Protokoll verwendet, weil es das stärkste Form der natürlich vorkommenden Östrogen bei nicht schwangeren Frauen 30. Im Gegensatz zu akuten Injektionen von Estradiol, haben andere Laboratorien Methoden der chronischen Östrogen Verwaltung beschäftigt. Zum Beispiel, subkutane Implantate von Slow-Release-Pellets oder Silastic Kapseln ermöglichen eine stetige, kontinuierliche Lieferung von Östrogen oder Trägerlösung 19. Dieses Verfahren wird typischerweise in Verbindung mit Ovar-, die normalen Reproduktionszustand des Tieres zu eliminieren. Der Manipu-schriften hier besprochenen konzentrieren sich auf natürliche hormonelle Zustände bis zur klinischen Anwendung der Laborbefunde zu erleichtern. Menschen mit posttraumatischen Belastungsstörung (PTSD) sind häufig in ihrer Fähigkeit, die Angst vor einer Konjunktur ihrer traumatischen Erfahrung im Zusammenhang löschen und diese vom Aussterben erinnern beeinträchtigt. Dieser Zustand besteht oft noch lange nach der Veranstaltung übergeben. Längere Exposition Therapie ist eine häufige Behandlungsoption für PTSD, die auf vom Aussterben basierte Prozesse in Tiermodellen untersucht, wie die hier beschriebenen beruht. Interessanterweise sind Frauen etwa doppelt so häufig wie Männer, um Stress und Angst im Zusammenhang mit psychiatrischen Störungen 31 zu entwickeln. Dieser Geschlechtsunterschied in der Prävalenz kann auf Geschlechtsunterschiede in der Angst Aussterben Prozessen verknüpft werden und die Voraussetzung für die mögliche klinische Bedeutung dieser Laborbefunde. Trotz der höheren Prävalenz von PTSD bei Frauen relativ wenige fürchten Aussterben Studien an Nagern haben bei Frauen durchgeführt. Weiblich Studien konzentrieren siching über die Rolle der Geschlechtshormone nicht bei der Prüfung der Geschlechtsunterschiede im Verhalten zu übersehen. Charakterisierung der Auswirkungen auf das Verhalten von natürlich schwankenden Hormonspiegel über den Sexualzyklus bietet wertvolle Einblicke in die grundlegenden Unterschiede im Verhalten zwischen Männern und Frauen. Dieses Protokoll liefert ein Basismodell zur zukünftigen Studien von Eierstockhormone und deren Einfluss auf die, aber nicht beschränkt auf, kognitiven und Verhaltensprozessen begrenzt wie Furchtextinktion erleichtern. Dieses Protokoll konzentriert sich auf eine spezifische gonadale Hormon, Östrogen, aber die Wirkung anderer Hormone wie Progesteron und Testosteron kann ebenfalls ausgewertet werden. Mit dem Verhaltensparadigma in Verbindung mit anderen pharmakologischen, zelluläre und molekulare Techniken hier vorgestellten (dh lokale Arzneimittelinfusionen, Immunhistochemie, Western Blot), die zukünftige Forschung kann bestimmte Websites / Ziele von Östrogen Wirkung im Gehirn, die Verhaltenstherapie ergänzen könnten.

Inherent Geschlechtsunterschiede sind in verschiedenen kognitiven Verhalten und Lernparadigmen bei Mensch und Nager beobachtet. Zum Beispiel wurde berichtet, dass Frauen im Allgemeinen stärker verbalen und detailorientierten Fähigkeiten, während Männer haben eine bessere räumliche Fähigkeiten 1-3. Diese Geschlechtsunterschiede kann zum Teil auf den Einfluss der Geschlechtshormone sein. Hohe Estradiolspiegel verbessern die Leistung auf Aufgaben, in denen Frauen sind besser, aber verschlechtern Leistung auf Aufgaben, die Menschen in der Regel gut zu tun 4-6. Obwohl dieser Beweis ist überzeugend, macht die begrenzte Fähigkeit, Testumgebungen vollständige Kontrolle in Studien am Menschen es schwierig, festzustellen, ob diese Auswirkungen auf das Verhalten gezielt auf Hormone zurückzuführen. Tierexperimentelle Studien im Gegensatz dazu ermöglichen die vollständig kontrollierten Bedingungen. Obwohl die grundlegenden neuronalen Mechanismen der Angst Aussterben sind identifiziert worden und sind bei Männern untersucht, ist unklar, ob esDiese Systeme sind die gleichen bei Frauen und wie sie über die Sexualzyklus ändern. Furchtkonditionierung und das Aussterben sind weit verbreitet Verhaltensparadigmen bei Nagern und Menschen, um Studien zu Angststörungen im Zusammenhang durchzuführen. Da für Frauen haben ein höheres Risiko für Angststörungen sowie höhere Symptomdauer und Schwere 7-13, ist es kritisch, Weibchen in diesen Studien beinhalten. Die Unterrepräsentation von Frauen in dieser Studie kann auf die Herausforderungen der Östrus-Phasen-Überwachung und Bilanzierung der Auswirkungen auf das Verhalten von Sexualhormonen zurückzuführen. Labors, die untersuchen Frauen in dieser Hinsicht Begegnung Fragen, die oft nicht gemeldet oder nicht in den Verfahren zu ihrer Studien beschrieben tun. Anzeichen dafür, bei Nagern lässt vermuten, dass Geschlechtsunterschiede in der Angst Aussterben durch Gonadenhormone 14-18 moduliert. In Furchtkonditionierung werden Tiere darauf trainiert, einen bestimmten Reiz zu fürchten. Nach einer Anzahl von unverstärktem Präsentationender Reiz, die Tiere lernen, nicht das Stichwort, einen Prozess namens Aussterben fürchten. Wie gut das Tier lernt und konsolidiert die Erinnerung an das Lernen diese Aufgabe während einer Extinktion Recall Test gegeben einige Zeit nach dem Aussterben Training beobachten. Weniger Angst Expression während Aussterben Rückruf weist eine gute Auslöschung Gedächtniskonsolidierung. Neue Ergebnisse aus unserem Labor zeigen, dass Östrogen kann die Konsolidierung der Angst Aussterben Speicher zu modulieren und zu verbessern Aussterben Rückruf. Insbesondere weiblichen Ratten, die in Proöstrus erlöschen, wird die Phase des Zyklus, in dem die zirkulierenden Östrogenspiegel Spitze, zeigen eine verbesserte Beibehaltung der vom Aussterben Speicher. Im Gegensatz dazu, Frauen, die in der Nieder Östrogen Metöstrus Phasenanzeige relativ schlechte Aussterben Rückruf gelöscht werden, die mit exogenen Estradiol Verwaltung vor oder unmittelbar nach dem Erlöschen Ausbildung 15,16 verbessert werden kann. Die neuronalen Mechanismen des Aussterbens Gedächtniskonsolidierung (inkluding die Rolle der Geschlechtshormone) bei Frauen sind nicht klar. Bei Labortieren kann die Rolle der Hormone mit invasive chirurgische Entfernung Verfahren wie die Kastration und Ovariektomie untersucht werden. Nach Erholung von der Operation, Gonadenhormone oft exogen während der Durchführung einer Verhaltensaufgabe 19 manipuliert. Dieser Ansatz hat wichtige Informationen über Geschlechtshormone zur Verfügung gestellt und ist nützlich, da es für die gut kontrollierte Manipulationen der Geschlechtshormone (in Bezug auf Timing und Dosis) 20-23. Dieser Ansatz ist jedoch nicht beurteilen, den Einfluss der natürlich auftretenden Schwankungen, die für die Östrus-Zyklus auftritt, noch stellen sie &quot;normal&quot; Tieren, wodurch die Translations Potential Humanstudien einschränkend. Es ist gut dokumentiert, dass weibliche Sexualhormon Ebenen Höhepunkt und Niedergang in bestimmten Phasen des Zyklus, und Östrogen-Rezeptor-Expression Änderungen innerhalb des Zyklus,und nach Entfernung der Eierstöcke 24. Daher besteht die Notwendigkeit, Studien über Frauen mit intakten Keimdrüsen zu führen und zu verfeinern, experimentelle Designs, um die Auswirkungen der hohen und niedrigen Östrogen-Staaten können auf Frauen während ihrer gesamten Lebensdauer haben sicher zu studieren. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Wirkung von Östrogen auf die neurobiologische Systeme in Angst Aussterben beteiligt. Es wird beschrieben, wie: 1) sorgfältig den Sexualzyklus zu überwachen, 2) vorzubereiten wirksamen Dosen von Estradiol zur systemischen Verabreichung, und 3) folgen einem Verhaltens Paradigma, das Furchtkonditionierung, Aussterben umfasst, und erinnern in natürlich Radfahren weiblichen Ratten. Dieses Protokoll kann mit anderen pharmakologischen Manipulationen und zellulären und molekularen Werkzeugen geändert werden, um Studien zu unterstützen, um geschlechtsspezifische Unterschiede, die in Klima beobachtet fürchten Löschverhalten besser zu verstehen. Man beachte, dass die nachstehend beschriebenen Verfahren sind auch in unserem Labor verwendet werden, und es gibt eine Anzahl von Variationen dieser Verfahren in in der Literatur.

<table><tbody><tr><td>Fear conditioning chamber</td><td>Coulbourn Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graphic State</td><td>Coulbourn Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sound-attenuating box</td><td>Med Associates, Inc.</td><td>NIR-022MD</td><td></td></tr><tr><td>Estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1024</td><td>In sesame oil for subcutaneous injection</td></tr><tr><td>Sesame oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3547-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Freezescan</td><td>Cleversys, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dip quick stain</td><td>Jorgensen Laboratories, Inc.</td><td>J0322A1, J0322A2, J0322A3</td><td></td></tr><tr><td>Cotton-tipped applicators</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-114</td><td>6-inch, sterile</td></tr><tr><td>0.9% saline</td><td>LabChem, Inc.</td><td>LC23460-2</td><td>Sodium chloride w/v</td></tr><tr><td>Selectfrost microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-003</td><td></td></tr><tr><td>Virex II 256</td><td>Diversey, Inc.</td><td>5019317</td><td>Dilute 1:256 with water</td></tr><tr><td>Luer-Lok Tip 1ml Syringes</td><td>Becton Dickinson</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Hypodermic disposable needles</td><td>Exelint International, Co.</td><td>26402</td><td>26-gauge</td></tr></tbody></table>

protocol for studying extinction of conditioned fear in naturally cycling female rats

Extinction konditionierter Furcht wurde ausgiebig bei männlichen Nagetieren untersucht. Kürzlich gab es eine zunehmende Anzahl von Studien, die zeigen, dass neuronale Mechanismen einiger Verhaltens Aufgaben und Antwortverhalten bei Frauen und Männern unterschiedlich sind. Mit Frauen in Forschungsstudien kann eine Herausforderung wegen der Veränderung der Geschlechtshormone während ihres Sexualzyklus darstellen. Dieses Protokoll beschreibt gut etablierten Verfahren, die nützlich bei der Untersuchung der Rolle von Östrogen in Angst Aussterben Gedächtniskonsolidierung bei weiblichen Ratten sind. Phase des Zyklus und exogenen Östrogengabe vor dem Aussterben Training kann Aussterben Abruf 24 Stunden später zu beeinflussen. Die vaginale Abstrichtechnik zur Östrus hier beschriebenen Phasenidentifikation unterstützt die Untersuchung und Behandlung der natürlich Radfahren Gonadenhormone. Die Verwendung dieses Grundnagetiermodell kann weiter abzugrenzen, die Mechanismen, durch die Östrogen kann Angst Aussterben Speicher zu modulierenFrauen.

In diesem Furchtextinktion Rückruf-Protokoll wurde Prozent Einfrieren als Indikator für die Furcht gemessen. Tiere, die gut ausgelöscht und behielt die Erinnerung an die Auslöschung Ausbildung ausgestellt geringe Angst am letzten Tag des Verhaltenstests während Aussterben Rückruf. Männlichen und weiblichen Ratten nicht signifikant in konditionierter Furcht Ausdruck in der Anlage, vom Aussterben unterscheiden, und erinnern Phasen (Abbildung 2). Allerdings wird ein Geschlechtsunterschied deutlich, wenn die Tiere werden getrennt als Hoch- und Nieder Östrogen Östrus Phasengruppen analysiert. Weibliche Ratten, die vom Aussterben Ausbildung während der Low-Östrogen Metöstrus Phase des Zyklus durchlaufen nicht das Aussterben Speicher am Tag 3 als auch solche in Proöstrus ausgebildet (Bild 3) wieder zu verwenden. Diese Metöstrus Frauen zeigen auch deutlich größere Angst vor Rückgewinnung beim Aussterben Rückruf (schlechte Aussterben Speicher) im Vergleich zu Männern. Allerdings, wenn Metöstrus Weibchen sind subkutan Spritzten mit einer 15 ug / kg Dosis von Östradiol vor dem Aussterben Lernen, erscheint Konsolidierung der Angst Aussterben Speicher zu mehr als von niedrigen Gefrierpunkt während Aussterben Rückruf (Abbildung 4) nachgewiesen werden. Daher zeigen diese Daten, dass Geschlechtshormone kann Furchtextinktion Rückruf modulieren und auch vermitteln, geschlechtsspezifische Unterschiede in konditionierter Furcht Aussterben Verhaltensweisen. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52202/52202fig1highres.jpg" /> Abbildung 1: Repräsentative Bilder von Zelltypen über Sexualzyklus Phasen (Vergrößerung 20X) Proöstrus durch Massen von rund, lila gefärbten kernhaltige Epithelzellen gekennzeichnet.. Brunst durch Aggregate von blau gefärbten, Plattenepithelkarzinom verhornten Zellen identifiziert werden. Metöstrus und Diöstrus Ausdruck eine Kombination von Zelltypen (Leukozyten, kernhaltigen und verhornten Zellen), zeigen aber weniger Zellen. Östrogenspiegel in den Östrus Phasen schwankenUnd erreichte während Proöstrus. (Met = Metöstrus;.. Diest = Diöstrus;. Proest = Proöstrus). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52202/52202fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52202/52202fig2highres.jpg" /> Abb. 2: Vergleich zwischen Männern und Frauen auf die drei Phasen des Experiments gibt es keine in der Gewöhnung (. Hab) beobachtete signifikante Geschlechtsunterschiede, Anlage (. Cond), Extinktion, oder erinnern Phasen des Experiments 15. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52202/52202fig3highres.jpg" /> Abbildung 3: Verhaltensunterschiede zwischen Proöstrus (hohe Östrogen) und Metöstrus (niedrige Östrogen) Frauen Frauen im Hoch Östrogen Proöstrus Phase o.f der Sexualzyklus zeigen weniger Angst als die in Low-Östrogen Metöstrus. Diese Daten legen nahe, dass der Östrogenspiegel in natürlich Radfahren Weibchen können die Konsolidierung der Angst Aussterben Speicher zu beeinflussen, modulieren Rückruf 24 Stunden später 15. <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52202/52202fig4highres.jpg" /> Abbildung 4: Östrogen-Behandlung in Metöstrus Frauen. Die Verabreichung von Östradiol 30 Minuten vor dem Aussterben Ausbildung (Pfeil) erleichtert Aussterben Rückruf im Vergleich zum Fahrzeug 16.

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Protocol for Studying Extinction of Conditioned Fear in Naturally Cycling Female Rats

Gonadal hormones such as estrogen modulate memory formation in a number of experimental paradigms including fear extinction memory. This protocol describes a set of methods for investigating the influence of gonadal hormones specifically during extinction in naturally cycling females, including estrous cycle monitoring and exogenous estrogen administration.

Protokoll zur Untersuchung Extinction konditionierter Furcht in natürlich Radfahren weiblichen Ratten

Extinction of conditioned fear has been extensively studied in male rodents. Recently, there have been an increasing number of studies indicating that ...

protocol-for-studying-extinction-conditioned-fear-naturally-cycling

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Behavior

13.3K Aufrufe.  Massachusetts General Hospital. Gonadal hormones such as estrogen modulate memory formation in a number of experimental paradigms including fear extinction memory. This protocol describes a set of methods for investigating the influence of gonadal hormones specifically during extinction in naturally cycling females, including estrous cycle monitoring and exogenous estrogen administration.

Serie: Protocol for Studying Extinction of Conditioned Fear in Naturally Cycling Female Rats

Trace Fear Conditioning in Mice

In this experiment we present a technique to measure learning and memory. In the trace fear conditioning protocol presented here there are five pairings between a neutral stimulus and an unconditioned stimulus. There is a 20 sec trace period that separates each conditioning trial. On the following day freezing is measured during presentation of the conditioned stimulus (CS) and trace period. On the third day there is an 8 min test to measure contextual memory. The representative results are from mice that were presented with the aversive unconditioned stimulus (shock) compared to mice that received the tone presentations without the unconditioned stimulus. Trace fear conditioning has been successfully used to detect subtle learning and memory deficits and enhancements in mice that are not found with other fear conditioning methods. This type of fear conditioning is believed to be dependent upon connections between the medial prefrontal cortex and the hippocampus. One current controversy is whether this method is believed to be amygdala-independent. Therefore, other fear conditioning testing is needed to examine amygdala-dependent learning and memory effects, such as through the delay fear conditioning.

In the following experiment we describe a protocol for trace fear conditioning in mice. This type of associative memory includes a trace period that separates the neutral stimulus and the unconditioned stimulus.

Trace Angstkonditionierung bei Mäusen

In this experiment we present a technique to measure learning and memory. In the trace fear conditioning protocol presented here there are five pairings ...

Forschung

Verhalten

A Procedure for Studying the Footshock-Induced Reinstatement of Cocaine Seeking in Laboratory Rats 

The most insidious aspect of drug addiction is the high propensity for relapse. Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been used extensively to study the neurobiology and phenomenology of relapse to drug use. Although procedural variations have emerged over the past several decades, the most conventional reinstatement procedures are based on the drug self-administration (SA) model. In this model, an animal is trained to perform an operant response to obtain drug. Subsequently, the behavior is extinguished by withholding response-contingent reinforcement. Reinstatement of drug seeking is then triggered by a discrete event, such as an injection of the training drug, re-exposure to drug-associated cues, or exposure to a stressor 1.
Reinstatement procedures were originally developed to study the ability of acute non-contingent exposure to the training drug to reinstate drug seeking in rats and monkeys 1, 2. Reinstatement procedures have since been modified to study the role of environmental stimuli, including drug-associated cues and exposure to various forms of stress, in relapse to drug seeking 1, 3, 4.
Over the past 15 years, a major focus of the reinstatement literature has been on the role of stress in drug relapse. One of the most commonly used forms of stress for studying this relationship is acute exposures to mild, intermittent, electric footshocks. The ability of footshock stress to induce reinstatement of drug seeking was originally demonstrated by Shaham and colleagues (1995) in rats with a history of intravenous heroin SA5. Subsequently, the effect was generalized to rats with histories of intravenous cocaine, methamphetamine, and nicotine SA, as well as oral ethanol SA 3, 6.
Although footshock-induced reinstatement of drug seeking can be achieved reliably and robustly, it is an effect that tends to be sensitive to certain parametrical variables. These include the arrangement of extinction and reinstatement test sessions, the intensity and duration of footshock stress, and the presence of drug-associated cues during extinction and testing for reinstatement. Here we present a protocol for footshock-induced reinstatement of cocaine seeking that we have used with consistent success to study the relationship between stress and cocaine seeking.

A Procedure for Studying the Footshock-Induced Reinstatement of Cocaine Seeking in Laboratory Rats

Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been used extensively to study the role of stress in relapse to drug seeking. Here, we report on a method for inducing the reinstatement of cocaine seeking in laboratory rats via acute exposures to mild, intermittent electric footshock.

Ein Verfahren zur Untersuchung der Fußschock-Induced Wiedereinsetzung von Kokain suche in Laborratten

The most insidious aspect of drug addiction is the high propensity for relapse.  Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been ...

Neurowissenschaften

Quantifying Cognitive Decrements Caused by Cranial Radiotherapy

With the exception of survival, cognitive impairment stemming from the clinical management of cancer is a major factor dictating therapeutic outcome. For many patients afflicted with CNS and non-CNS malignancies, radiotherapy and chemotherapy offer the best options for disease control. These treatments however come at a cost, and nearly all cancer survivors (~11 million in the US alone as of 2006) incur some risk for developing cognitive dysfunction, with the most severe cases found in patients subjected to cranial radiotherapy (~200,000/yr) for the control of primary and metastatic brain tumors1. Particularly problematic are pediatric cases, whose long-term survival plagued with marked cognitive decrements results in significant socioeconomic burdens2. To date, there are still no satisfactory solutions to this significant clinical problem.
We have addressed this serious health concern using transplanted stem cells to combat radiation-induced cognitive decline in athymic rats subjected to cranial irradiation3. Details of the stereotaxic irradiation and the in vitro culturing and transplantation of human neural stem cells (hNSCs) can be found in our companion paper (Acharya et al., JoVE reference). Following irradiation and transplantation surgery, rats are then assessed for changes in cognition, grafted cell survival and expression of differentiation-specific markers 1 and 4-months after irradiation. To critically evaluate the success or failure of any potential intervention designed to ameliorate radiation-induced cognitive sequelae, a rigorous series of quantitative cognitive tasks must be performed. To accomplish this, we subject our animals to a suite of cognitive testing paradigms including novel place recognition, water maze, elevated plus maze and fear conditioning, in order to quantify hippocampal and non-hippocampal learning and memory. We have demonstrated the utility of these tests for quantifying specific types of cognitive decrements in irradiated animals, and used them to show that animals engrafted with hNSCs exhibit significant improvements in cognitive function3.
The cognitive benefits derived from engrafted human stem cells suggest that similar strategies may one day provide much needed clinical recourse to cancer survivors suffering from impaired cognition. Accordingly, we have provided written and visual documentation of the critical steps used in our cognitive testing paradigms to facilitate the translation of our promising results into the clinic.

Cognitive impairment resulting from the radiotherapeutic management of brain tumors represents a clinically intractable condition that adversely impacts quality of life. The capability to critically evaluate potential interventions for ameliorating radiation-induced cognitive decrements ultimately depends on the capability to undertake rigorous quantitative assessments of cognition.

Quantifizierung Kognitive Dekrementiert von Cranial Strahlentherapie verursachten Schäden

With the exception of survival, cognitive impairment stemming from the clinical management of cancer is a major factor dictating therapeutic outcome. For ...

Medizin

Vagus Nerve Stimulation as a Tool to Induce Plasticity in Pathways Relevant for Extinction Learning

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been maintaining the behavior. There is close correspondence between fear and human anxiety, and therefore studies of extinction learning might provide insight into the biological nature of anxiety-related disorders such as post-traumatic stress disorder, and they might help to develop strategies to treat them. Preclinical research aims to aid extinction learning and to induce targeted plasticity in extinction circuits to consolidate the newly formed memory. Vagus nerve stimulation (VNS) is a powerful approach that provides tight temporal and circuit-specific release of neurotransmitters, resulting in modulation of neuronal networks engaged in an ongoing task. VNS enhances memory consolidation in both rats and humans, and pairing VNS with exposure to conditioned cues enhances the consolidation of extinction learning in rats. Here, we provide a detailed protocol for the preparation of custom-made parts and the surgical procedures required for VNS in rats. Using this protocol we show how VNS can facilitate the extinction of conditioned fear responses in an auditory fear conditioning task. In addition, we provide evidence that VNS modulates synaptic plasticity in the pathway between the infralimbic (IL) medial prefrontal cortex and the basolateral complex of the amygdala (BLA), which is involved in the expression and modulation of extinction memory.

Vagus nerve stimulation (VNS) has emerged as a tool to induce targeted synaptic plasticity in the forebrain to modify a range of behaviors. This protocol describes how to implement VNS to facilitate the consolidation of fear extinction memory.

Vagusnervstimulation als Instrument zur Plastizität in Pathways Relevant für Extinction Learning herbei

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been ...

Extinction Training During the Reconsolidation Window Prevents Recovery of Fear

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents the return of fear. Pavlovian fear-conditioning paradigms are commonly employed to create a controlled, novel fear association in the laboratory. After pairing an innocuous stimulus (conditioned stimulus, CS) with an aversive outcome (unconditioned stimulus, US) we can elicit a fear response (conditioned response, or CR) by presenting just the stimulus alone1,2 . Once fear is acquired, it can be diminished using extinction training, whereby the conditioned stimulus is repeatedly presented without the aversive outcome until fear is no longer expressed3. This inhibitory learning creates a new, safe representation for the CS, which competes for expression with the original fear memory4. Although extinction is effective at inhibiting fear, it is not permanent. Fear can spontaneously recover with the passage of time. Exposure to stress or returning to the context of initial learning can also cause fear to resurface3,4.
Our protocol addresses the transient nature of extinction by targeting the reconsolidation window to modify emotional memory in a more permanent manner. Ample evidence suggests that reactivating a consolidated memory returns it to a labile state, during which the memory is again susceptible to interference5-9. This window of opportunity appears to open shortly after reactivation and close approximately 6hrs later5,11,16, although this may vary depending on the strength and age of the memory15. By allowing new information to incorporate into the original memory trace, this memory may be updated as it reconsolidates10,11. Studies involving non-human animals have successfully blocked the expression of fear memory by introducing pharmacological manipulations within the reconsolidation window, however, most agents used are either toxic to humans or show equivocal effects when used in human studies12-14. Our protocol addresses these challenges by offering an effective, yet non-invasive, behavioral manipulation that is safe for humans.
By prompting fear memory retrieval prior to extinction, we essentially trigger the reconsolidation process, allowing new safety information (i.e., extinction) to be incorporated while the fear memory is still susceptible to interference. A recent study employing this behavioral manipulation in rats has successfully blocked fear memory using these temporal parameters11. Additional studies in humans have demonstrated that introducing new information after the retrieval of previously consolidated motor16, episodic17, or declarative18 memories leads to interference with the original memory trace14. We outline below a novel protocol used to block fear recovery in humans.

Conditioned fear can be diminished through an inhibitory process called extinction, but can resurface under conditions such as the passage of time or exposure to stress. Our protocol presents a novel way of preventing fear recovery by introducing extinction during the reconsolidation window (the re-storage phase of a reactivated memory).

Extinction Training Während der Rückverfestigung Fenster Verhindert Recovery-of Fear

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents ...

Stress-Enhanced Fear Learning, a Robust Rodent Model of Post-Traumatic Stress Disorder

Fear behaviors are important for survival, but disproportionately high levels of fear can increase the vulnerability for developing psychiatric disorders such as post-traumatic stress disorder (PTSD). To understand the biological mechanisms of fear dysregulation in PTSD, it is important to start with a valid animal model of the disorder. This protocol describes the methodology required to conduct stress-enhanced fear learning (SEFL) experiments, a preclinical model of PTSD, in both rats and mice. SEFL was developed to recapitulate critical aspects of PTSD, including long-term sensitization of fear learning caused by an acute stressor. SEFL uses aspects of Pavlovian fear conditioning but produces a distinct and robust sensitized fear response far greater than normal conditional fear responses. The trauma procedure involves placing a rodent in a conditioning chamber and administering 15 unsignaled shocks randomly distributed over 90 minutes (for rat experiments; for mouse experiments, 10 unsignaled shocks randomly distributed over 60 minutes are used). On day 2, rodents are placed in a novel conditioning context where they receive a single shock; then, on day 3 they are placed back in the same context as on day 2 and tested for changes in freezing levels. Rodents that previously received the trauma display enhanced levels of freezing on the test day compared to those that received no shocks on the first day. Thus, with this model, a single highly stressful experience (the trauma) produces extreme fear of the stimuli associated with the traumatic event.

Here we describe the detailed methodology required to conduct stress-enhanced fear learning (SEFL) experiments, a preclinical model of post-traumatic stress disorder, in both rats and mice. The model utilizes aspects of Pavlovian fear conditioning and freezing as an index of enhanced fear in rodents.

Stress verstärkt Angst lernen, ein stabiles Nagetier Modell der posttraumatischen Belastungsstörung

Fear behaviors are important for survival, but disproportionately high levels of fear can increase the vulnerability for developing psychiatric disorders ...

Fear Incubation Using an Extended Fear-Conditioning Protocol for Rats

Emotional memory has been primarily studied with fear-conditioning paradigms. Fear conditioning is a form of learning through which individuals learn the relationships between aversive events and otherwise neutral stimuli. The most-widely utilized procedures for studying emotional memories entail fear conditioning in rats. In these tasks, the unconditioned stimulus (US) is a footshock presented once or several times across single or several sessions, and the conditioned response (CR) is freezing. In a version of these procedures, called cued fear conditioning, a tone (conditioned stimulus, CS) is paired with footshocks (US) during the training phase. During the first test, animals are exposed to the same context in which training took place, and freezing responses are tested in the absence of footshocks and tones (i.e., a context test). During the second test, freezing is measured when the context is changed (e.g., by manipulating the smell and walls of the experimental chamber) and the tone is presented in the absence of footshocks (i.e., a cue test). Most cued fear conditioning procedures entail few tone-shock pairings (e.g., 1-3 trials in a single session). There is a growing interest in less common versions involving an extensive number of pairings (i.e., overtraining) related to the long-lasting effect called fear incubation (i.e., fear responses increase over time without further exposure to aversive events or conditioned stimuli). Extended fear-conditioning tasks have been key to the understanding of fear incubation&#8217;s behavioral and neurobiological aspects, including its relationship with other psychological phenomena (e.g., post-traumatic stress disorder). Here, we describe an extended fear-conditioning protocol that produces overtraining and fear incubation in rats. This protocol entails a single training session with 25 tone-shock pairings (i.e., overtraining) and a comparison of conditioned freezing responses during context and cue tests 48 h (short-term) and 6 weeks (long-term) after training.

We describe an extended fear-conditioning protocol that produces overtraining and fear incubation in rats. This protocol entails a single training session with 25 tone-shock pairings (i.e., overtraining) and a comparison of conditioned freezing responses during context and cue tests 48 h (short-term) and 6 weeks (long-term) after training.

Angst-Inkubation mit einem erweiterten Angst-Konditionierungsprotokoll für Ratten

Emotional memory has been primarily studied with fear-conditioning paradigms. Fear conditioning is a form of learning through which individuals learn the ...

A Novel Pavlovian Fear Conditioning Paradigm to Study Freezing and Flight Behavior

Fear- and anxiety-related behaviors significantly contribute to an organism&#8217;s survival. However, exaggerated defensive responses to perceived threat are characteristic of various anxiety disorders, which are the most prevalent form of mental illness in the United States. Discovering the neurobiological mechanisms responsible for defensive behaviors will aid in the development of novel therapeutic interventions. Pavlovian fear conditioning is a widely used laboratory paradigm to study fear-related learning and memory. A major limitation of traditional Pavlovian fear conditioning paradigms is that freezing is the only defensive behavior monitored. We recently developed a modified Pavlovian fear conditioning paradigm that allows us to study both conditioned freezing and flight (also known as escape) behavior within individual subjects. This model employs higher intensity footshocks and a greater number of pairings between the conditioned stimulus and unconditioned stimulus. Additionally, this conditioned flight paradigm utilizes serial presentation of pure tone and white noise auditory stimuli as the conditioned stimulus. Following conditioning in this paradigm, mice exhibit freezing behavior in response to the tone stimulus, and flight responses during the white noise. This conditioning model can be applied to the study of rapid and flexible transitions between behavioral responses necessary for survival.

Defensive behavioral responses are contingent upon threat intensity, proximity, and context of exposure. Based on these factors, we developed a classical conditioning paradigm that elicits clear transitions between conditioned freezing and flight behavior within individual subjects. This model is crucial for the understanding the pathologies involved in anxiety, panic, and post-traumatic stress disorders.

Ein neuartiges Pavlovian Fear Conditioning Paradigma zur Untersuchung von Einfrieren und Flugverhalten

Fear- and anxiety-related behaviors significantly contribute to an organism&#8217;s survival. However, exaggerated defensive responses to perceived threat ...

An Inescapable Cat Odor Exposure Protocol for Studying Innate and Contextual Threat Conditioning in Rats

Animals respond to threatening situations by exhibiting a number of defensive behaviors, including avoidance, freezing, and risk assessment. An animal model with an ethological approach offers a deeper insight into the biological mechanisms underlying threat responses. This paper describes a methodology to measure defensive behaviors toward both innate and learned aversive stimuli in rats. Animals were individually exposed to predator odor in an inescapable chamber to elicit a measurable, sustained, defensive state. The experimental design involved placing a rat in a familiar chamber for 10 min followed by exposure to cat odor for another 10 min in the same context. The next day, the rats were re-exposed for 10 min to the same context chamber where cat odor exposure occurred. Sessions were video-recorded and defensive behaviors were assessed on both days. 
The behavioral test was coupled with reversible functional inactivation and c-Fos immunohistochemistry techniques to determine the role of the interoceptive cortex in threat responses. Rats exposed to cat odor on the first day and re-exposed to the context chamber on the second day displayed higher levels of defensive behaviors, and that cat odor elicited a robust increase in the neural activity of the interoceptive cortex. Moreover, muscimol inactivation of the interoceptive cortex reduced the expression of defensive behaviors in response to cat odor and impaired contextual threat memory. These results show that this behavioral assay is a useful tool for studying neural mechanisms of defensive behaviors and may offer insight into mechanisms that mediate fear in humans and its related disorders.

Cat skin/fur odor exposure provides a reliable method to investigate neural circuits and mechanisms of defensive responses in rodents and may offer insight into mechanisms that mediate fear in humans. Here, we describe a protocol for investigating the role of the interoceptive cortex in threat responses in rats.

Animals respond to threatening situations by exhibiting a number of defensive behaviors, including avoidance, freezing, and risk assessment. An animal ...

Untersuchung aktiver Abwehrverhaltensweisen bei Mäusen mit modifizierter Angstkonditionierung

Modified Fear Conditioning for Inducing Flight Behaviors in Mice

The appropriate manifestation of defensive behavior in a threatening situation is critical for survival. The prevailing theory suggests that an active defensive behavior, such as jumping or rapid darting, is expressed under high threat imminence or actual threat, whereas passive defensive behavior, such as freezing, is expressed when the threat is predicted, but the threat imminence is relatively low. In classical fear conditioning, subjects typically exhibit freezing as a conditioned defensive response, with little expression of active defensive behavior in most cases. Here, we introduce a modified fear conditioning procedure for mice to observe the transition from freezing to flight and vice versa, involving five repetitive pairings of conditioned stimuli (CS; continuous tone, 8 kHz, 95 dB SPL (sound pressure levels)) and unconditioned stimuli (US; foot shock, 0.9 mA, 1.0 s) over two days. This modified fear conditioning procedure requires a relatively large number of conditioning sessions and conditioning days but does not necessitate a high-intensity foot shock for modest expression of flight behavior. Using the same context for conditioning and salient CS presentations is essential to elicit flight behaviors. This modified fear conditioning procedure is a reliable method for observing active defensive behaviors in mice, providing an opportunity to elucidate the fine mechanisms and characteristics of such behaviors in a fearful context.

Autor im Rampenlicht: Erforschung neuronaler Korrelate von defensiven Verhaltensweisen beim Lernen und Aussterben von Angst

To study flight behaviors in a fearful context, we introduce a modified fear conditioning protocol. This protocol ensures that mice consistently exhibit flight behaviors during cue presentation in the fear conditioning.

Modifizierte Angstkonditionierung zur Induktion von Fluchtverhalten bei Mäusen

The appropriate manifestation of defensive behavior in a threatening situation is critical for survival. The prevailing theory suggests that an active ...