Die Methode basiert auf Open-Source-Software, um die lokalen motorischen Aktivitäten systematisch für das Trackingverhalten von adulten und den Larvenfliegen aus aufgezeichneten Videos auszuwerten. Diese Methode erfordert eine kostengünstige Geräteintegration zur Aufzeichnung und Analyse des Verhaltens, was sie zu einem erschwinglichen und effektiven Ansatz für das Screening der Fliegenbewegung macht. Diese Technologie wird eingesetzt, um Verhaltensänderungen in einem Fliegenmodell menschlicher Krankheiten mit lokaler Bewegungsbeeinträchtigung zu identifizieren, ist aber nicht für die Behandlung von Krankheiten, Behinderungen oder Schwierigkeiten geeignet.
Es ist wichtig, während des Analyseprozesses das relevante Videofenster zu löschen, nämlich das Original- und das Verarbeitungsvideofenster. Mischen Sie zunächst Reagenz A und Reagenz B des Kieselsäure-Kits im Verhältnis eins zu 10 gemäß den Anweisungen des Herstellers, um die Freilandarena für die Verfolgung der Drosophila-Fortbewegung vorzubereiten. Stellen Sie als Nächstes die HD-Kamera auf ein Stativ und stellen Sie sie so ein, dass das Kameraobjektiv senkrecht zur Oberfläche der Siliziumdioxidarena steht.
Öffnen Sie dann das Video mit Fidschi. Ziehen Sie den Fortschrittsbalken auf den ersten Frame und stimmen Sie stillschweigend zu. Wählen Sie den gesamten Körper der Fliege mit dem Freihand-Auswahlwerkzeug aus.
Klicken Sie auf Bild, anpassen und Helligkeit und Kontrast, um den Weißabgleich anzupassen, bis sich der Grauwert des ausgewählten Bereichs dem breiten Hintergrund nähert. Bringen Sie die betäubte Fliege in die Freilandarena. Sobald sich die Fliege von der Narkose erholt hat, stellen Sie die Arenaschale mit der Fliege unter die Kamera und schütteln Sie sie schnell von einer Seite zur anderen, um sicherzustellen, dass die Fliege in Bewegung ist, wenn die Aufnahme beginnt.
Drücken Sie die Aufnahmetaste in der Kameraanwendung, um die Videoaufnahme zu starten. Drücken Sie nach Abschluss der Aufnahme die Stopp-Taste, um die Videoaufnahme zu beenden. Konvertieren Sie die aufgenommenen Videos in das AVI-Format mit heidnischer M-J-Codierung, damit sie mit Fidschi geöffnet und analysiert werden können.
Stellen Sie außerdem die Bilder pro Sekunde des Videos auf 15 fps für erwachsene Fliegen und 12 fps für Larven ein. Um das Video mit Fidschi zu öffnen, wählen Sie im Popup-Fenster die beiden Optionen aus, verwenden Sie den virtuellen Stapel und konvertieren Sie ihn in Graustufen. Rufen Sie ein Verarbeitungsfenster ab, indem Sie das Werkzeug "Aktives Bild festlegen" des Tier-Tracker-Plugins verwenden, und erstellen Sie mit dem ovalen Werkzeug einen Tracking-Bereich, der die Arena im ursprünglichen Videofenster umkreist.
Legen Sie die Filter und die Parameter der beiden Filter für den ersten leeren Frame im Verarbeitungsfenster fest. Wählen Sie dann das nächste Bild im ursprünglichen Videofenster aus und wählen Sie die gefilterte Oberfläche des Verarbeitungsfensters aus. Sobald ein gefiltertes Verarbeitungsfenster ausgewählt ist, verwenden Sie das Werkzeug Schwellenwert festlegen, um den Traktflug mit einem roten Profil zu drehen, das im Verarbeitungsfenster verdeckt ist.
Verwenden Sie dann den gesetzten Blob-Detektor, damit der Computer die Fliege mit einem roten Profil erkennen kann, das im Verarbeitungsfenster abgedeckt ist. Legen Sie das letzte Bild für die erwachsene Fliege oder die Larven fest, wie im Textmanuskript beschrieben. Verwenden Sie das Tool "Blobs anzeigen", um ein Tracking-Rechteck im ursprünglichen Videofenster anzuzeigen.
Starten Sie das Tracking und exportieren Sie die Tracking-Datei, nachdem das Monitoring abgeschlossen ist. Laden Sie die Track- und Zonendateien mit dem Animal Tracker and Tracking Analyzer Plugin. Wählen Sie den gewünschten Index mithilfe der Zoneneinstellungen aus und ändern Sie die Parametereinstellungen.
Berechnen Sie die Zeit des Frame-Intervalls anhand der Framerate. Erstellen Sie die quantitativen Analysediagramme mit einer Tabellenkalkulationssoftware und einem Graphpad-Prisma, nachdem sie im Tracking-Analysator analysiert wurden. Öffnen Sie die Track-Datei.
Kopieren Sie alle Koordinaten nach Microsoft Office Excel und teilen Sie die Zellen mit der Leertaste. Um die Immobilitätszeit pro Frameintervall zu berechnen, wählen Sie alle berechneten Ergebnisse aus, und fügen Sie ein Säulendiagramm ein, um die Immobilitätszeit am Rand des gesamten Säulendiagramms visuell darzustellen. Um die Änderungen des Richtungswinkels zu veranschaulichen, wählen Sie alle berechneten Ergebnisse aus, und fügen Sie ein Streudiagramm ein.
Adulte Fliegen und Larven des dritten Stadiums, die mit Rotenon behandelt wurden, wiesen signifikante lokomotorische Defizite im Vergleich zu Kontrollfliegen auf, die mit Lösungsmittel DMSO gefüttert wurden. Die quantitative Analyse der Rotenon-Behandlung bei adulten Fliegen zeigte eine signifikante Abnahme der zurückgelegten Strecke und der mittleren Geschwindigkeit. Und eine deutliche Erhöhung der Immobilitätszeit.
Repräsentative Diagramme zeigten weniger Spitzen für die Bewegungsgeschwindigkeit pro Bildintervall bei Fliegen, die mit Rotenon gefüttert wurden, im Vergleich zu denen in der Kontrolle, was auf den Schweregrad des lokomotorischen Aktivitätsdefizits hinweist. Auch die institutionistische Immobilitätsspalte der bewegten Pixel pro Frame zeigte signifikant weniger Bewegung innerhalb einer Minute für mit Rotenon gefütterte Fliegen im Vergleich zu den Kontrollfliegen. Repräsentative Diagramme, die den Bewegungswinkel der Richtungsänderungen bei Rotenon- und Kontrolltieren veranschaulichen, zeigten auch Veränderungen in der von den Fliegen gewählten Richtung.
Ähnliche Ergebnisse wurden für die dritte Instar-Larve beobachtet. Die Ergebnisse zeigten, dass die Verhaltensbewegung von Trackinglarven, die mit Rotenon gefüttert wurden, im Vergleich zur Kontrolle signifikant beeinträchtigt war. Der wichtigste Schritt im Analyseprozess ist die Bildung des ersten leeren Rahmens, da er beweist, ob die Software effektiv überprüfen kann.
Diese Technologie könnte es Forschern ermöglichen, tiefer in den zugrunde liegenden Mechanismus mehrerer Defekte wie Nerven- oder Muskelverletzungen einzutauchen.
