This work was supported by the Neurotrauma Research Program (Western Australia). This project is funded through the Road Trauma Trust Account, but does not reflect views or recommendations of the Road Safety Council.

1. Optische Kalibrierung: Messlichtleistung <ol><li> Um die Lichtabgabevorrichtung vorzubereiten, schließen Sie eine Breitbandlichtquelle (zB Xenon oder Wolframlampe) an eine geeignete Stromversorgung. Positionieren einer kollimierenden Linse vor der Lichtquelle, um einen kollimierten Lichtstrahl zu erzeugen. Passieren die Licht durch ein flüssiges Wärmefilter den größten Teil der Wärme aus dem Lichtstrahl zu entfernen. Abhängig von der Anwendung, den Schwerpunkt des kollimierten Strahls auf die Eintrittsöffnung eines Flüssigkeitslichtleiters, der für eine flexiblere Abgabe des Lichts (z. B. in einen Inkubator) liefert. </li><li> Am anderen Ende des Flüssigkeitslichtleiter einsetzen, eine zweite Kollimatorlinse und eine Halterung für die Interferenz und Neutralfilter. Überprüfen Sie, ob diese Anordnung erzeugt eine gleichmäßig ausgeleuchtet Lichtpunkt des gewünschten Wellenbereich und Intensität. Hinweis: Der Abstand zwischen dem Ende des Lichtleiters und der Objektebene muss je nach zu variierendie Fläche, die beleuchtet werden muss, sondern daran, dass, wenn der Abstand von dem Ende der Lichtführung zunimmt, werden die Lichtintensität zu verringern. In der vorliegenden Studie ist dieser Abstand 14cm und erzeugt einen Strahlquerschnitt, die gleichmäßig beleuchtet eine 3x3-Muldenbereich auf einem 96-Well-Platte. </li><li> Darauf achten, dass Streulicht von der Lampe und die damit verbundenen optischen Komponenten nicht in der Lage, um die Probe zu erreichen. </li><li> Schalten Sie den Wasserkühler für das flüssige Wärmefilter und sicherzustellen, dass es den Austausch von Wasser durch den Filtermantel. Schalten die Lampe Stromquelle und eine Wartezeit von mindestens 5 min für die Breitband-Lichtquelle zu stabilisieren. Anmerkung: Die Verwendung des Wasserkühlers ist erforderlich, um ein Überhitzen der Vorrichtung zu verhindern. </li><li> Wählen eines Schmalbandinterferenzfilter (in der Regel durch ihre Mittenwellenlänge, Spitzendurchlässigkeit und die Halbwertsbreite (FWHM) Bandbreite beschrieben), um den gewünschten Wellenbereich der Beleuchtung zu erzeugen. Anmerkung: Die in der vorliegenden Studie verwendete schmalbandige Interferenzfilter sind 442 nm, 550 nm, 671 nm und 810 nm. </li><li> Messen Sie die von der Lampe auf der Ebene, in der die Probe während der Behandlung positioniert werden erzeugte Licht. Gemessen unter Verwendung eines kalibrierten Lichtstrahlungssonde (Kosinus Kollektor) mit einem geeigneten Spektroradiometer verbunden, mit Anstand Software entsprechend den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Verwenden Neutralfilter, um die Intensität des Lichts einzustellen, bis die gewünschte Ausgabe erhalten wird. Anmerkung: In der vorliegenden Arbeit wird die Intensität des von jedem Interferenzfilter geleitet eingestellt, um eine gleiche Quantenausgang an jedem der vier Behandlungswellenbänder zu ergeben. Es ist wichtig, um die Kalibrierung regelmäßig zu überprüfen, da die Lampenleistung kann sich ändern. Anmerkung: Nach dem Aufbau der Vorrichtung, sind die Zellen bereit, beleuchtet werden: Figur 1 eine Darstellung der Lichtabgabevorrichtung in der vorliegenden Studie verwendet.. </li></ol><img alt="Figur 1"src = &quot;/ files / ftp_upload / 52221 / 52221fig1.jpg&quot; /&gt; Abbildung 1. Bild des Lichtabgabevorrichtung. Dargestellt sind die Lichtenergiequelle, Xenon-Lampe mit Gehäuse, Sammellinse, Wasserfilter, Eingangsöffnung, Flüssigkeitslichtleiter, der zweite Kollimationslinse, Filterhalter, Behandlung Rahmen und mattschwarz Karte. Man beachte, dass das schmalbandige Wellenlänge und Intensität Filter sind nicht dargestellt. 2. Zellpräparation <ol><li> Die beschriebene R / NIR-LT Liefermethode kann zu jedem Zelltyp oder in vitro Modellsystem verwendet werden; als solche die folgenden Beschreibungen der Zellkultur allgemeinen unter Verwendung wohlbekannter Techniken zur Kultur Phäochromocytom (PC12), Müller (RMC1) und primären gemischten Retinazellen. </li><li> Vor der Zellaussaat zur Lichtbehandlung und oxidativer Stress Assay immortalisierten Kulturzellen in der jeweiligen Wachstumsmedien, die geeignete Ergänzungsmittel (z. B. FBS, Antibiotika) in T75 flasks, bis 70-80% konfluent. </li><li> Lösen immortalisierten Zellen aus T75-Kolben unter Verwendung des Verfahrens für den Zelltyp geeignet z getestet werden. Trypsin. Falls erforderlich, bevor mit der Aussaat der Zellen in 96-well-Assayplatten fortfällt Vertiefungen der Assayplatte mit 10 ug / ml Poly-L-Lysin für 1 h (z. B. für PC12-Zellen) oder 10 ug / ml Poly-L-Lysin 1h mit einem O / N-Inkubation mit 10 ug gefolgt / ml Laminin (z. B. für Mischnetzhautzellen). </li><li> Zentrifugenzellen entsprechend zu sammeln (z. B. 3 min bei 405 · g für PC12-Zellen oder 10 min bei 218 × g für RMC1 Zellen), Entfernen des Überstandes und Resuspension in 8 ml der geeigneten Zellkulturmedien. </li><li> Wenn gemischt Netzhautzellen zu verwenden sind, bereiten von P0-5 neonatalen Rattenjungen durch enzymatischen Abbau (Papain) nach festgelegten Verfahren 19 </li><li> Die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit Ausnahme von 0,4% (w / v) Trypanblau unter Verwendung eines Hämozytometers. </li><li> Passen Zelldichte such, die Zellen werden etwa 70 bis 80% konfluent nach 24 oder 48 Stunden in Kultur. (Für PC12-Zellen die Aussaatdichte von 4,0 x 10 5 lebensfähigen Zellen / ml, für RMC1 Zellen ist es 2,5 x 10 5 lebensfähige Zellen / ml und bei Zusammenretinazellen ist 8 x 10 5 lebensfähige Zellen / ml). Nach der Zugabe von Zellen, entweder klar oder schwarze 96-Well-Platten (für die H 2 O 2 oder DCFH-DA Assay jeweils verwendet werden), in 100 ul des geeigneten Wachstumsmedien, lassen Sie die Platte auf eine flache Oberfläche bei 37 ° C, 5 sitzen % CO 2 (oder welche Bedingungen angemessen sind für den spezifischen Zelltyp) für mindestens 24 h auf die Zellhaftung zu ermöglichen. </li><li> Kulturzellen in einem Wachstumsmedium in das entsprechende 96-Well-Schalen, bis sie 70-80% konfluent (24h für PC12 und RMC1 Zellen 48h für Mischnetzhautzellen). </li></ol> 3. Hinzufügen Glutamat Stressor zu Zellen <ol><li> Bereiten L-Glutaminsäure Mononatriumsalz-Hydrat Stressor Konzentrationen von 0-10mm in entsprechenden Voll wachsenth Kulturmedien. </li><li> Entfernen Sie das Medium aus den Zellen und vorsichtig waschen Zellen 3 mal mit PBS (PC12) oder HBSS (RMC1 und gemischte Netzhautzellen). Nach Wäschen hinzuzufügen Glutamat enthaltenden Medien auf ein Gesamtvolumen von 100 ul / Vertiefung. </li></ol> 4. Erste-Dosierungen von Lichtbehandlung <ol><li> Unmittelbar nach der Zugabe von Glutamat oder Stressor der Wahl, aussetzen Zellen Lichtbehandlung bei den gewünschten Wellenlängen und Intensitäten, indem Sie unter der vorbereiteten Lichtabgabevorrichtung. Achten Sie darauf, die Quanten Ausgang des Lichtstrahls mit den etablierten Kombinationen von Graufilter in Abhängigkeit von der Wellenlänge verabreicht ändern. Hinweis: In den aktuellen Experimenten ausgesetzt Zellen Lichtbehandlung für 3 Minuten die Temperatur zu halten, indem die 96-Well-Platten auf einer 37 ° C Wärmepolster ruht. Behandlungszeit kann je nach Bedarf variiert werden. <ol><li> Legen Sie eine matte schwarze Karte unter den Zellen, um Licht zu verhindern reflektieren in benachbarten Vertiefungen in der 96-well Fach für andere Behandlungsparameter bezeichnet. </li></ol></li><li> Wird die Behandlung über längere Zeiträume gewünscht, fügen 25 mM Hepes-Puffer, um den pH der Zellkulturmedien erhalten oder im Idealfall stellen die Vorrichtung und das Behandlungs Platten in einem Inkubator mit CO &amp; sub2; -Konzentration von 5% CO 2 reguliert wird, oder Bedingungen, die optimal sind, für den spezifischen Zelltyp. </li><li> Nach Abschluss der Lichtbehandlung, legen Sie die Zellen auf einer ebenen Fläche und bei 37 ° C und 5% CO 2 (oder was auch immer Bedingungen sind optimal für den Zelltyp) für 24 Stunden. Anmerkung: Zusätzliche Dosierungen von R / NIR-LT kann wie oben beschrieben nach Wunsch verabreicht werden. </li></ol> 5. Schluss Dosierung des Lichts Behandlung und Erkennung von ROS <ol><li> Vor der Durchführung der Endrunde der Lichtbehandlung, bereiten die Reagenzien für ROS Erkennung verwendet werden. Vorbereitung 50 mM Citratpuffer (pH 6,0), Triton X100, und H 2 O 2 Nachweisreagenz ArbeitsLösung (1: 2: 97-Verhältnis von 10 mM H 2 O 2 Nachweisreagenz Stammlösung; 10 U / ml Meerrettichperoxidase; 50 mM Natriumcitrat (pH 6,0)). Bereiten DCFH-DA bei einer Endkonzentration von 100 uM in geeigneten Medien. Hinweis: DCFH-DA-Reagenz für PC12-Zellen in RPMI-Medium, DCFH-DA-Reagenz für RMC1 Zellen in DMEM-Medium. Beachten Sie, dass im Handel erhältliche Nachweisreagenzien sind Differenz Empfindlichkeiten auf bestimmte ROS und Reagenzien sollte sorgfältig ausgewählt werden, um die für eine einzelne Anwendung gewünschten Informationen zu liefern. </li><li> Verabreichen Lichtbehandlung zu den Zellen, wie in Schritt 4.1-4.1.2 beschrieben. Achten Sie darauf, die Zellen werden mit den gewünschten Einflüsse / Wellenlängen von Licht behandelt. </li><li> Unmittelbar nach der Lichtbehandlung, entfernen Sie die glutamathaltigen Medien und waschen zweimal mit geeigneten Pufferlösung (bei PC12-Zellen, PBS verwendet wird und für RMC1 Zellen, HBSS verwendet wird). Führen Sie die ROS-Assays auf die Zellen wie folgt: <ol><li> H 2 O 2 </sub&gt; Test: in 45 ul 50 mM Citratpuffer (pH 6,0) und 5 ul Triton X100 zu jeder der Vertiefungen. Schütteln Sie die Zellen auf einem Orbitalschüttler für 30 Sekunden und bei 37 ° C und 5% CO 2 für 15 min. In 50 ul H 2 O 2 Erkennung Arbeitslösung und Inkubation für 30 min bei RT. Messen Fluoreszenz unter Verwendung eines Plattenlesegeräts mit einer Anregungswellenlänge von 530 nm und einer Emissionswellenlänge von 480 nm. </li><li> DCF-Assay: 100 l der 100 &amp; mgr; M Lösung von DCFH-DA, um jede der Vertiefungen und Inkubieren für 30 Minuten bei 37 ° C und 5% CO 2. Druckmaterial, das 100 uM DCFH-DA und wasche mit geeigneten Pufferlösung (wie oben beschrieben) zweimal. Hinzufügen von 90 ul Pufferlösung und 10 ul Triton X100 zu jeder der Vertiefungen und vorsichtig Schütteln auf einem Orbitalschüttler für 30 Sekunden vor dem 15-minütigen Inkubation bei 37 ° C. Messen DCF ableiten Fluoreszenz unter Verwendung eines Plattenlesegeräts mit einer Anregungswellenlänge von 480 nm und einer Emissions wavelength von 530 nm. </li><li> Express ROS Werte bezogen auf die Proteinkonzentration der Zellen in den Wells verbleibende, unter Verwendung eines kolorimetrischen Kits zur Proteinkonzentration quantifiziert gemäß den Anweisungen des Herstellers, unter Bezugnahme auf eine Standardkurve auf mg Protein berechnet. </li></ol></li></ol>

<ol>
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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocity+of+exposure+time+and+irradiance+on+energy+density+during+photoradiation+on+wound+healing+in+a+murine+pressure+ulcer+model.">Reciprocity of exposure time and irradiance on energy density during photoradiation on wound healing in a murine pressure ulcer model.</a> Lasers in surgery and medicine. 39, 534-542 (2007).</li><li>Castano, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-level+laser+therapy+for+zymosan+induced+arthritis+in+rats:+Importance+of+illumination+time.">Low-level laser therapy for zymosan induced arthritis in rats: Importance of illumination time.</a> Lasers in surgery and medicine. 39, 543-550 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Wir haben erfolgreich eine genaue und kalibrierte Lichtabgabesystem geeignet ist, einen Mechanismus für die Studie zur Optimierung der R / NIR-LT in vitro bereitzustellen. Wellenlängen- und Intensitätsparameter R / NIR-LT der Lage sind, mit diesem System genau und effektiv bearbeitet werden. Wir haben festgestellt, dass das Licht die Behandlung der Zellen nicht zum Zelltod führen, wenn auch ROS nicht bei den Wellenlängen und Dosierungen geliefert reduziert, in den getesteten Zelltypen. Höchstintensitäten...

Für eine Reihe von Signalwegen und normale Reaktionen des Zellstoffwechsels, einschließlich der Neuroprotektion 1 sind reaktive Sauerstoffspezies (ROS) erforderlich. Wenn jedoch endogenen antioxidativen Mechanismus nicht in der Lage, die Produktion von ROS zu steuern, Zellen gegenüber oxidativem Stress 2,3 erliegen. Nach Verletzung des ZNS, werden die damit verbundenen Anstieg in Gegenwart von ROS und oxidativer Stress vermutlich eine wesentliche Rolle bei der Progression der Schädigung 4,5 spielen. Trotz der umfangreichen Reihe von Strategien zur Abschwächung oxidativen Stress, die beurteilt wurden, gibt es noch keine vollständig wirksam, klinisch relevante antioxidativen Strategien zur Dämpfung von ROS-Produktion und die damit verbundenen oxidativen Stress in der klinischen Anwendung folgende Neurotrauma 6. Deshalb ist die Abschwächung des oxidativen Stress bleibt ein wichtiges Ziel für die therapeutische Intervention 7. Verbesserungen folgening R / NIR-LT sind in einer Vielzahl von Verletzungen und Erkrankungen einschließlich Senkung der kardialen Infarktgröße, renale und hepatische Komplikationen bei Diabetes, Netzhautdegeneration, ZNS-Verletzung und Schlaganfall 8, vielleicht durch die Reduzierung von oxidativem Stress berichtet. Insbesondere im Hinblick auf ZNS-Verletzung, haben präklinische Studien der Wirksamkeit von 670 nm Licht gute Effekte in Modellen der Netzhautdegeneration 9-11, Verletzungen des Rückenmarks 12, neuronalen Tod 13 gezeigt. Klinische Studien haben für trockene altersbedingte Makuladegeneration durchgeführt worden und werden derzeit für einen Schlaganfall 14, aber die Ergebnisse dieser Studien nicht vielversprechend erscheinen, möglicherweise aufgrund eines Fehlers zu einer wirksamen Behandlung beschäftigen Parameter 15. Als solche R / NIR-LT, nicht sehr stark im Rahmen der normalen klinischen Praxis bei Neurotrauma angenommen, obwohl sie eine leicht zu verwalten, nicht-invasive und relativ kostengünstige Behandlung. Hindernisse für klinische Umsetzung gehören der Mangel an einem clAnfang verstanden Wirkmechanismus und das Fehlen eines standardisierten effektiven Behandlungsprotokoll 16,17. Aktuelle Literatur in Bezug auf die Lichttherapie zeigt eine Fülle von Variationen in der Behandlungsparameter in Bezug auf Strahlungsquellen (LED oder Laser), Wellenlänge (zB 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm) Gesamtdosis (Joule-Bestrahlung / Flächeneinheit), Dauer (Belichtungszeit), Zeitpunkt (vor oder nach dem Insult), Behandlungshäufigkeit und Art der Lieferung (Puls oder kontinuierlich) 8. Die Variabilität der Behandlungsparameter zwischen den Studien einen Vergleich schwierig und hat zu Skepsis gegenüber der Wirksamkeit 16 beigetragen. Daher wird die Optimierung der R / NIR-LT eindeutig erforderlich, mit Zellkultursystemen, die zur High-Throughput-Screening-Mechanismus notwendig, um die mehreren Variablen zu vergleichen ist. Allerdings gibt es nur wenige handelsübliche Beleuchtungssysteme, die eine ausreichende Flexibilität und Kontrolle über wa bieten kannvelength und Intensität, solche Optimierungsversuche durchzuführen. Kommerziell erhältliche LED-Vorrichtungen sind im Allgemeinen nicht in der Lage, mehrere Wellenlängen oder Intensitäten, was Forscher die mehrere LED-Vorrichtungen von unterschiedlichen Herstellern, die nicht nur in der Intensität variieren kann, zu liefern, sondern auch das Spektrum der Wellenlänge des emittierten Lichts. Wir haben dieses Problem durch Verwendung eines Breitband-Xenon-Lichtquelle durch schmalbandige Interferenzfilter gefiltert, wodurch eine Reihe von Wellenlängen und Energiedichten von Licht, so dass in der Nähe, eine genaue Kontrolle der Parameter des R / NIR-LT gerichtet. Es ist wichtig zu beachten, dass die therapeutische Dosis der Behandlung wird durch die Anzahl der Photonen, die Interaktion mit dem photoacceptor (Chromophor), die im Fall von R / NIR-LT wird postuliert, Cytochrom c Oxidase (COX) 18 werden definiert. Photonenenergie geliefert mit der Wellenlänge variiert; dh gleiche Dosen von Energie bei verschiedenen Wellenlängen werden comvon unterschiedlichen Anzahlen von Photonen geschätzt. Daher wurde das Licht von der Vorrichtung emittiert wird kalibriert, um eine gleiche Anzahl von Photonen für jede der gewählten Wellenlängen zu prüfenden emittieren. Wir haben ein System, das verwendet werden kann, um R / NIR-LT in einem Bereich von Wellenlängen und Intensitäten zu Zellen in vitro zu liefern entwickelt und demonstriert die Fähigkeit, die Wirkungen des gelieferten R / NIR-LT auf ROS-Produktion in Zellen unterworfen zu messen Glutamat Stress.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence)</td>
			<td>Cell Biolabs</td>
			<td>STA-342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex UltraRed Reagent</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A36006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 Watt Xenon Arc Lamp</td>
			<td>Newport Corporation</td>
			<td>6258</td>
			<td>Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB4000-FL Fluorescence Spectrometer</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200&#956;m diameter quartz fibre optic</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraSuite Spectroscopy Platform</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2300 EnSpire Multimode Plate Reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Acute toxicity, wear gloves when handling.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid monosodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>142-47-2 (anhydrous)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-2522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082-147</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum, New Zealand origin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinal Muller (rMC1) cells</td>
			<td>University of California, San Diego</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-118</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75cm2 Flasks</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>B4-BE-353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25988-63-0</td>
			<td>Aliquot and store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-134</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-049</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin Mouse Protein, Natural</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>23017-015</td>
			<td>Aliquot and store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>Warm to 37&#176;C in water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>165U Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W326305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96 well plates, clear bottom, black</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3603-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile.</td>
			<td>Costar</td>
			<td>07-200-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seesaw Rocker</td>
			<td>Standard lab epuipment</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Standard lab epuipment</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Density Filter Paper (0.3)</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>442nm Bandpass Filter</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>FL441.6-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>550nm Bandpass Filter</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>FB550-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>670nm Bandpass Filter</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>FB670-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>810nm Bandpass Filter</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>FB810-10e</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmounted &#216;25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1)</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>NE01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmounted &#216;25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2)</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>NE02B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmounted &#216;25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3)</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>NE03B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmounted &#216;25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5)</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>NE05B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmounted &#216;25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6)</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>NE06B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmounted &#216;25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0)</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>NE10B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method for the assessment of effects of a range of wavelengths and intensities of red/near-infrared light therapy on oxidative stress in vitro

Rot / Nahinfrarotlicht Therapie (R / NIR-LT) durch Laser- oder Leuchtdiode (LED) geliefert werden, verbessert funktionellen und morphologischen Ergebnisse in einem Bereich des zentralen Nervensystems Verletzungen in vivo, ggf. durch Reduzierung von oxidativem Stress. Jedoch Wirkungen von R / NIR-LT auf oxidativen Stress wurde gezeigt abhängig von der Wellenlänge oder der Intensität der Bestrahlung ab. Studien zum Vergleich der Behandlungsparameter fehlen, aufgrund der Abwesenheit von im Handel erhältlichen Geräten, die mehrere Wellenlängen und Intensitäten, geeignet für Hochdurchsatz-in-vitro-Optimierungsstudien liefern. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Abgabe von Licht in einem Bereich von Wellenlängen und Intensitäten der therapeutischen Dosis für eine gegebene Verletzungsmodell erforderlich optimieren. Wir nahmen an, dass eine Methode der Bereitstellung von Licht, in dem Wellenlängen- und Intensitätsparameter könnte leicht geändert werden könnten Bestimmung einer optimalen Dosis von R / NIR-LT zur Reduzierung reaktiver Sauerstoffspezies zu erleichtern(ROS) in vitro. Nichtkohärenten Xenon-Licht wurde mit Schmalband-Interferenz-Filter filtriert, um unterschiedlicher Wellenlänge (Mittenwellenlängen von 440, 550, 670 und 810 nm) und Fluenzen liefern (8,5 x 10 -3 bis 3,8 x 10 -1 J / cm 2) der Licht auf kultivierte Zellen. Lichtausbeute aus der Vorrichtung wurde kalibriert, um therapeutisch relevante, gleich Quanten Dosen von Licht bei jeder Wellenlänge emittieren. Reaktive Spezies nachgewiesen in Glutamat gestreßten Zellen mit Licht behandelt, mit DCFH-DA und H 2 O 2 sensitive Fluoreszenzfarbstoffe. Wir haben erfolgreich geliefert Licht bei einer Reihe von physiologisch und therapeutisch relevanten Wellenlängen und Intensitäten, um kultivierte Zellen zu Glutamat als Modell der ZNS-Verletzung ausgesetzt. Während die Einflüsse von R / NIR-LT in der vorliegenden Studie verwendet nicht eine Wirkung auf ROS durch die kultivierten Zellen erzeugten ausübt, ist das Verfahren der Lichtabgabe auf andere systems einschließlich Einzel Mitochondrien oder mehrere physiologisch relevanten organotypischen Kulturmodellen und könnte verwendet werden, um Auswirkungen auf eine Reihe von Zielkriterien des oxidativen Stoffwechsels zu bewerten.

Der Ausgang von Licht bei einer Wellenlänge von 670 nm abgegeben wurde mit Neutraldichtefiltern, um Zellen mit einer Reihe von Fluenzen umfassend eine Dosis eines zuvor gezeigt vorteilhaft in vivo (0,3 J / cm 2) 20 bis 670 nm sein, Licht zu bestrahlen kalibriert. Da die Zahl der Neutralfilter vor der Lichtquelle erhöht wird, die Intensität (W / m 2) verringert, so dass weniger Licht auf den Zielbereich passieren. In Tabelle 1 sind die Kalibrierungsdaten von 670nm Licht von der Lichtquel...

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Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Verfahren zur Beurteilung der Auswirkungen einer Reihe von Wellenlängen und Intensitäten von Rot / Nah-Infrarot-Licht-Therapie auf oxidativen Stress<em&gt; In-vitro-</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

method-for-assessment-effects-range-wavelengths-intensities-rednear

Research

JoVE Journal

Biology

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

8.6K Aufrufe.  The University of Western Australia. Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Serie: Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

A Behavioral Assay, um die Reaktionsfähigkeit der Zebrafisch zu Änderungen in Lichtintensitäten messen

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Forschung

Biologie

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular metabolism. Many methods to detect glycogen already exist but only a few are quantitative. We describe here a method using the Abcam Glycogen assay kit, which is based on specific degradation of glycogen to glucose by glucoamylase. Glucose is then specifically oxidized to a product that reacts with the OxiRed probe to produce fluorescence. Titration is accurate, sensitive and can be achieved on cell extracts or tissue sections. However, in contrast to other techniques, it does not give information about the distribution of glycogen in the cell. As an example of this technique, we describe here the titration of glycogen in two cell lines, Chinese hamster lung fibroblast CCL39 and human colon carcinoma LS174, incubated in normoxia (21% O2) versus hypoxia (1% O2). We hypothesized that hypoxia is a signal that prepares cells to synthesize and store glycogen in order to survive1.

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

We describe here an accurate, reproducible and convenient biochemical method for titration of glycogen in vitro. This technique uses the Abcam Glycogen assay kit and is based on successive hydrolysis of glycogen to glucose and glucose titration by fluorescence.

Biochemische Titration von Glykogen<em&gt; In-vitro-</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Analyse von oxidativem Stress in Zebrafischembryonen

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

Mess Oxidativer Stress Widerstandsrat<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In 96-Well-Mikrotiterplatten

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

Die Quantifizierung der Endothelial Cell Haftfähigkeit<em&gt; In-vitro-</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

Interzelluläre Gap Junction-Kommunikation: Eine funktionelle Biomarker zur Beurteilung Unerwünschte Auswirkungen von Schadstoffen und Toxinen und gesundheitlichen Vorteile von Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Filtration Isolierung von Nukleinsäuren: Eine einfache und schnelle DNA-Extraktionsmethode

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents in the treatment of several diseases. The development of new, innovative strategies for miRNA/siRNA therapy is based on an extensive knowledge of the underlying mechanisms. Recent data suggest that small RNAs are exchanged between cells in a gap junction-dependent manner, thereby inducing gene regulatory effects in the recipient cell. Molecular biological techniques and flow cytometric analysis are commonly used to study the intercellular exchange of miRNA. However, these methods do not provide high temporal resolution, which is necessary when studying the gap junctional flux of molecules. Therefore, to investigate the impact of miRNA/siRNA as intercellular signaling molecules, novel tools are needed that will allow for the analysis of these small RNAs at the cellular level. The present protocol describes the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) microscopy to elucidating the gap junction-dependent exchange of miRNA molecules between cardiac cells. Importantly, this straightforward and non-invasive live-cell imaging approach allows for the visualization and quantification of the gap junctional shuttling of fluorescently labeled small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution. The data obtained by 3D-FRAP confirm a novel pathway of intercellular gene regulation, where small RNAs act as signaling molecules within the intercellular network.

Here, we describe the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) for the analysis of the gap junction-dependent shuttling of miRNA. In contrast to commonly applied methods, 3D-FRAP allows for the quantification of the intercellular transfer of small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution.

Analyse der Gap-Junction-abhängigen Übertragung von miRNA mit 3D-FRAP-Mikroskopie

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

A Method to Assess Bacteriocin Effects on the Gut Microbiota of Mice

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the factors that contribute to maintaining the population balance. However, there are limited available methodologies to evaluate these factors. Bacteriocins are antimicrobial peptides produced by many bacteria that may confer a competitive advantage for food acquisition and/or niche establishment. Many probiotic lactic acid bacteria (LAB) strains have great potential to promote human and animal health by preventing the growth of pathogens. They can also be used for immuno-modulation, as they produce bacteriocins. However, the antagonistic activity of bacteriocins is normally determined by laboratory bioassays under well-defined but over-simplified conditions compared to the complex gut environment in humans and animals, where bacteria face multifactorial influences from the host and hundreds of microbial species sharing the same niche. This work describes a complete and efficient procedure to assess the effect of a variety of bacteriocins with different target specificities in a murine system. Changes in the microbiota composition during the bacteriocin treatment are monitored using compositional 16S rDNA sequencing. Our approach uses both the bacteriocin producers and their isogenic non-bacteriocin-producing mutants, the latter giving the ability to distinguish bacteriocin-related from non-bacteriocin-related modifications of the microbiota. The fecal DNA extraction and 16S rDNA sequencing methods are consistent and, together with the bioinformatics, constitute a powerful procedure to find faint changes in the bacterial profiles and to establish correlations, in terms of cholesterol and triglyceride concentration, between bacterial populations and health markers. Our protocol is generic and can thus be used to study other compounds or nutrients with the potential to alter the host microbiota composition, either when studying toxicity or beneficial effects.

Bacteriocins are believed to play a key role in defining microbial diversity in different ecological niches. Here, we describe an efficient procedure to assess how bacteriocins affect gut microbiota composition in an animal model.

Eine Methode zur Beurteilung von Bakteriocin-Wirkungen auf die Gut-Mikrobiota von Mäusen

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure plasma (LPP) discharges contain a broad spectrum of active species, which lead to rapid microbial inactivation. To study the efficiency and mechanisms of sterilization by LPP, we use spores of the test organism Bacillus subtilis because of their extraordinary resistance against conventional sterilization procedures. We describe the production of B. subtilis spore monolayers, the sterilization process by low pressure plasma in a double inductively coupled plasma reactor, the characterization of spore morphology using scanning electron microscopy (SEM), and the analysis of germination and outgrowth of spores by live cell microscopy. A major target of plasma species is genomic material (DNA) and repair of plasma-induced DNA lesions upon spore revival is crucial for survival of the organism. Here, we study the germination capacity of spores and the role of DNA repair during spore germination and outgrowth after treatment with LPP by tracking fluorescently-labelled DNA repair proteins (RecA) with time-resolved confocal fluorescence microscopy. Treated and untreated spore monolayers are activated for germination and visualized with an inverted confocal live cell microscope over time to follow the reaction of individual spores. Our observations reveal that the fraction of germinating and outgrowing spores is dependent on the duration of LPP-treatment reaching a minimum after 120 s. RecA-YFP (yellow fluorescence protein) fluorescence was detected only in few spores and developed in all outgrowing cells with a slight elevation in LPP-treated spores. Moreover, some of the vegetative bacteria derived from LPP-treated spores showed an increase in cytoplasm and tended to lyse. The described methods for analysis of individual spores could be exemplary for the study of other aspects of spore germination and outgrowth.

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

This protocol illustrates the important consecutive steps required to assess the relevance of monitoring vitality parameter and DNA repair processes in reviving Bacillus subtilis spores after treatment with low pressure plasma by tracking fluorescence-labelled DNA repair proteins via time-resolved confocal microscopy and scanning electron microscopy.

Untersucht die nachteiligen Effekte der Low Druck Plasmasterilisation auf das Überleben von Bacillus Subtilis Sporen mittels Live Cell Mikroskopie

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...