Die hier berichtete Forschung wurde zum Teil vom National Cancer Institute der National Institutes of Health unter der Award-Nr. R33 CA217702 und das Programm Initiative for Maximizing Student Development (IMSD). Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Ansicht der National Institutes of Health dar.

Menschliche Serumproben wurden von einwilligenden Freiwilligen unter IRB-Zulassung und gemäß den in der Deklaration von Helsinki zum Ausdruck gebrachten Prinzipien erhalten. Die Proben wurden vor dem Transfer in das Analyselabor codiert und de-identifiziert.
1. Probenvorbereitung
<ol><li>HepG2 Zelllysate
	<ol>
<li>Entkernen Sie etwa 10 x 106 HepG2-Zellen pro Kolben in 16 T75-Kolben mit 14 ml EMEM-Medien, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), und züchten Sie Zellen für 2 Tage.</li>
		<li>RIPA-Puffer vorbereiten: in einem 50-ml-Röhrchen 1,5 ml 5 M NaCl, 2,5 ml 1 M Tris-HCl (pH = 7), 500 μL NP-40-Reagenz hinzufügen und dann das endige Volumen mit DI-Wasser auf 50 ml bringen.</li>
		<li>Lysepuffer vorbereiten: Aliquot 20 ml RIPA-Puffer in ein 50 ml Röhrchen und 200 μL einer 100-fachen Proteaseinhibitorlösung hinzufügen, um den Protein- und Lipidabbau zu hemmen. Bei 4 °C lagern. HINWEIS: Der Lysepuffer ist mit TBARS-Reagenzien kompatibel und stört die Absorption bei 532 nm nicht. Wenn Sie planen, einen anderen Lysepuffer zu verwenden oder zusätzliche Inhaltsstoffe zum Lysepuffer hinzuzufügen, müssen vorläufige Validierungsstudien durchgeführt werden, um zu überprüfen, ob die Lysepufferkomponenten mit dem TBARS-Assay kompatibel sind.</li>
		<li>Entfernen Sie Medien mit 10% FBS und waschzellen 2x mit 5 ml kaltem, sterilem 1x PBS.</li>
		<li>Geben Sie 1 ml Lysepuffer in die T75-Kolben, die die Zellen enthalten, und inkubieren Sie sie für 10 min bei Raumtemperatur (RT) mit konstanter Verwirbelung, um sicherzustellen, dass der Puffer gut verteilt ist.</li>
		<li>Sammeln Sie Lysate in entsprechend gekennzeichneten 2 ml Polypropylenröhrchen mit Schnappverschluss und inkubieren Sie 10 minuten lang auf Eis.</li>
		<li>Drehen Sie die Lysate bei 5.000 x g für 10 min bei RT, um Zelltrümmer zu sammeln, und aspirieren Sie Überstände in einem einzigen 15-ml-Rohr.</li>
		<li>Zelllysat-Überstand mit einem Speed Vac bei 50 °C und 3 mbar vierfach konzentrieren und Aliquots von je 94 μL zu 2 mL Snap-Cap-Polypropylenrohren herstellen. Lagern Sie die Proben bei -80 °C, bis sie für die In-vitro-Oxidation und/oder den TBARS-Test verwendet werden. HINWEIS: Um eine Konzentration des Zelllysat-Überstands zu vermeiden, können zellen auch mit 3 ml 1x Trypsin abgelöst, mit 6 ml Medien neutralisiert und 2x mit 5 ml kaltem PBS gewaschen werden. Zellpellets können dann in 250 μL Lysepuffer rekonstituiert werden, und die Schritte 1.1.6 und 1.1.7 können dann durchgeführt werden.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 35 mM CuCl2-Stammlösung in Essigsäure (pH = 4) vor.<ol>
<li>Essigsäurelösung herstellen (pH = 4): Verdünnen Sie 1 μL Eisessig in 100 ml DI-Wasser (pH sollte ungefähr 4 betragen, aber bestätigen Sie dies mit einem pH-Meter). Fügen Sie mehr Wasser oder Essigsäure hinzu, um den pH-Wert auf 4 einzustellen.</li>
			<li>Etwa 0,1936 g Kupfer-II-Chlorid eingewichten und in 10 mL der Essigsäurelösung (pH = 4) zu einem 144 mM CuCl2-Stamm auflösen. Aliquot 490 μL aus dieser Lösung und fügen Sie zu 1.510 μL Essigsäure (pH = 4) hinzu, um eine 35 mM CuCl2-Lösung herzustellen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aliquot 6 μL aus der 35 mM CuCl2-Stammlösung und geben Sie es zu sechs Proben, die 94 μL Zelllysat enthalten, um eine endgültige CuCl2-Konzentration von etwa 2 mM zu erhalten. 6 μL einer Essigsäurelösung (pH = 4), die kein CuCl2 enthält, werden sechs Proben mit 94 μL Zelllysaten als Kontrollen zugesetzt. Das endgültige Volumen des Zelllysats sollte 100 μL betragen, was für den TBARS-Assay verwendet wird. HINWEIS: Die Herstellung der 35 mM CuCl2-Stammlösung in Essigsäure (pH = 4) ist notwendig, um die Ausfällung von Kupferhydroxid zu verhindern.</li>
		<li>Inkubieren Sie Proben in einem Ofen bei 37 °C für 24 h und führen Sie einen TBARS-Assay an jeder Probe mit einem Endvolumen von 100 μL durch.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.1.9 und 1.1.11 2x an getrennten Tagen, um die Reproduzierbarkeit des TBARS-Assays für HepG2-Zelllysate zu überprüfen.</li>
	</ol></li>
	<li>Lipoproteine niedriger Dichte HINWEIS: Typischerweise enthält vorgereinigtes Low Density Lipoprotein (LDL) eine gewisse Menge an EDTA. Die hier verwendeten LDL-Proben enthalten 0,01% EDTA. EDTA kann die in vitro Cu(II)-vermittelte Oxidation von LDL hemmen. Daher kann es notwendig sein, EDTA vor Experimenten oder Analysen aus LDL-Proben zu entfernen. In den Schritten 1.2.1 bis 1.2.5 wird dieser Vorgang beschrieben. VORSICHT: Natriumhydroxid ist ätzend und verursacht Reizungen in Haut und Augen. Verwenden Sie die richtige persönliche Schutzausrüstung.<ol>
<li>Aliquot 24 μL aus einem 5,51 mg/ml LDL-Stamm (Proteinkonzentration bestimmt durch modifizierte Lowry-Methode unter Verwendung von BSA als Standard) in entsprechend gekennzeichnete 1 mL Snap-Cap-Polypropylenröhrchen. Stellen Sie so viele Aliquots wie nötig her und lagern Sie sie bei 4 °C bis zur Verwendung in der Oxidation und/oder TBARS-Assay.</li>
		<li>Bereiten Sie einen 10 mM HEPES-Puffer in 0,15 M NaCl, eingestellt auf pH = 7, mit NaOH-Perlen vor: Lösen Sie 4,39 g NaCl in 0,49 l Wasser auf und fügen Sie dann 1,19 g HEPES hinzu. Mit einem Rührstab gut auflösen. Fügen Sie Natriumhydroxidperlen hinzu, bis der pH-Wert 7 beträgt. Mit Wasser auf 0,5 l verdünnen. Puffer bei 4 °C lagern und innerhalb von 3 Monaten verwenden.</li>
		<li>476 μL des 10 mM HEPES-Puffers in 0,15 M NaCl (pH = 7) zu den aliquotedierten LDL-Proben geben, um das Endvolumen auf 500 μL zu bringen. Geben Sie eine verdünnte LDL-Probe in eine 0,5 ml Zentrifugalspinfiltervorrichtung mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von 100 K.</li>
		<li>Spinnproben bei 14.000 x g für 10 min bei RT, wobei ein endgültiges Retentatvolumen von etwa 30 μL verbleibt. Rekonstituieren Sie Proben in 480 μL des 10 mM HEPES-Puffers in 0,15 M NaCl (pH = 7) und drehen Sie sich erneut bei 14.000 x g für 10 min bei RT. Führen Sie diesen Schritt 2x für insgesamt vier Spin-Throughs durch.</li>
		<li>Legen Sie die Filtervorrichtung verkehrt herum in ein neues 2-ml-Polypropylenröhrchen mit Schnappverschluss und zentrifugieren Sie bei 1000 x g für 2 min, um die LDL-Probe zu sammeln (Endvolumen = ca. 30 μL).</li>
		<li>Aliquote Probe in entsprechend markiertes 1 ml Röhrchen und 20 μL Wasser zu jeder Probe geben, um ein Endvolumen von 50 μL zu erreichen.</li>
		<li>Herstellung von 200 μM CuCl2 Stammlösung in Essigsäure (pH = 4)<ol>
<li>Essigsäurelösung (pH = 4) herstellen: siehe Schritt 1.1.9.1.</li>
			<li>Man bereitet eine 144 mM CuCl2 Stammlösung vor (siehe Schritt 1.1.9.2), dann aliquot 5,5 μL aus dem 144 mM CuCl2 Stamm und löst sich in einem Endvolumen von 4 mL Essigsäure (pH = 4) auf, um die 200 μM Lösung herzustellen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aliquot 2,7 μL aus der 200 μM CuCl2 Stammlösung und geben Sie es zu sechs Proben mit 50 μL LDL, um eine endgültige CuCl2-Konzentration von ~ 10 μM zu erreichen. 2,7 μL aus einer Essigsäurelösung (pH = 4), die kein CuCl2 enthält, werden zu sechs Proben mit 50 μL LDL für die Kontrollen gegeben.</li>
		<li>Inkubieren Sie LDL-Proben für 2 h in einem Ofen bei 37 °C. Nach 2 h das Endvolumen auf 100 μL für jede Probe mit 10 mM HEPES-Puffer in 0,15 M NaCl (pH = 7) bringen. Führen Sie sofort einen TBARS-Assay durch.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.2.3–1.2.9 2x an zwei verschiedenen Tagen, um die Reproduktion des TBARS-Assays zu testen.</li>
	</ol></li>
	<li>Menschliches Serum
	<ol>
<li>Machen Sie aus einer menschlichen Serumprobe Aliquots von je 94 μL in 2 mL Snap-Cap Polypropylenröhrchen und lagern Sie die Proben bei -80 °C.</li>
		<li>Eine 35 mM CuCl2-Stammlösung in Essigsäure (pH = 4) herstellen: siehe Schritt 1.1.9.</li>
		<li>Aliquot 6 μL aus der CuCl2-Stammlösung und geben Sie es zu sechs Proben, die 94 μL menschliches Serum enthalten, um eine endgültige CuCl2-Konzentration von etwa 2 mM zu erhalten. Fügen Sie 6 μL einer Essigsäurelösung (pH = 4), die kein CuCl2 enthält, zu sechs Proben mit 94 μL humanem Serum hinzu, um sie als Kontrollen zu verwenden.</li>
		<li>Menschliche Serumproben 24 h lang in einem Ofen bei 37 °C inkubieren und den Oxidationsgrad mit TBARS-Assay bestimmen (Abschnitt 4).</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.3.2–1.3.4 2x an zwei verschiedenen Tagen, um die Reproduzierbarkeit des TBARS-Assays zu bestimmen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Vorbereitung des Reagenzes
VORSICHT: Thiobarbitursäure verursacht Haut- und Augenreizungen und kann durch Einatmen oder Hautabsorption schädlich sein. Essigsäure kann innere Organe schädigen, wenn sie eingeatmet wird. Bereiten Sie alle Säurelösungen in einem Abzug vor.
<ol><li>Herstellung von 8,1% (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS) Lösung<ol>
<li>32,4 g SDS auswiegen und in 350 ml DI-Wasser in einem Becherglas auflösen. Verwenden Sie einen magnetischen Rührstab, um SDS sanft aufzulösen und Blasen zu vermeiden. Bringen Sie das Endvolumen mit DI-Wasser auf 400 ml und lagern Sie die SDS-Lösung bei RT. HINWEIS: Hier wird überschüssige 8,1% SDS-Lösung vorbereitet; Für 96 Proben werden jedoch nur etwa 20 ml der 8,1% igen SDS-Lösung benötigt. Bereiten Sie diese Lösung entsprechend der Anzahl der analysierten Proben vor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herstellung von 3,5 M Natriumacetatpuffer (pH = 4)<ol>
<li>Verdünnen Sie 100 ml Eisessig in 350 mL DI-Wasser in einem Becherglas. Verwenden Sie einen magnetischen Rührstab, um es vorsichtig aufzulösen.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 6,5 M NaOH-Lösung unter Verwendung von Natriumhydroxidperlen in Wasser vor. 13 g NaOH-Perlen in 40 mL DI-Wasser lösen und mit DI-Wasser auf ein Endvolumen von 50 mL bringen.</li>
		<li>Langsam etwa 46 ml der 6,5 M NaOH-Lösung in die Essigsäurelösung geben, während Sie mit dem Rührstab mischen (dies sollte den pH-Wert auf 4 erhöhen, aber durch langsames Hinzufügen der NaOH-Lösung während der Messung mit einem pH-Meter bestätigen).</li>
		<li>Bringen Sie das Endvolumen mit DI-Wasser auf 500 ml und lagern Sie den Natriumacetatpuffer bei RT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herstellung von 0,8% iger wässriger Lösung von Thiobarbitursäure (eingestellt auf pH = 4) HINWEIS: In diesem Schritt wird die Herstellung von Thiobarbitursäure für große Mengen optimiert, da eine große Anzahl von Proben analysiert wird (108 Proben, ohne die Standards). Bereiten Sie diese Lösung in Abhängigkeit von der Anzahl der für die Analyse geplanten Proben vor.<ol>
<li>Bereiten Sie eine 5 M Natriumhydroxidlösung mit Natriumhydroxidperlen und Wasser vor: Lösen Sie 4 g Natriumhydroxidperlen in einem Endvolumen von 20 ml Wasser auf. In einem Kunststoffbehälter aufbewahren. Diese Lösung sollte für jede Charge frisch zubereitet werden.</li>
		<li>Gewicht 4 g Thiobarbitursäure und 450 ml DI-Wasser hinzufügen. Verwenden Sie einen magnetischen Rührstab, um es vorsichtig aufzulösen. HINWEIS: Diese Lösung wird schließlich auf ein Gesamtvolumen von 500 ml gebracht.</li>
		<li>Beim Auflösen der Thiobarbitursäure mit einem Rührstab (langsam und tropfenweise) etwa 3 ml der 5 M NaOH-Lösung in 100 μL-Schritten zugeben. Nach Zugabe der NaOH-Lösung beginnen sich die Thiobarbitursäurepartikel aufzulösen.</li>
		<li>Wenn sich die Thiobarbitursäurepartikel noch nicht vollständig gelöst haben, fügen Sie mehr von der 5 M NaOH-Lösung in 100 μL-Schritten hinzu, bis alle Thiobarbitursäurepartikel vollständig gelöst sind. Für dieses spezielle Lösungsvolumen werden insgesamt 4 ml der 5 M NaOH-Lösung zugegeben, um die Thiobarbitursäurepartikel vollständig aufzulösen. HINWEIS: Bei dieser Konzentration löst sich Thiobarbitursäure nicht vollständig auf, es sei denn, der pH-Wert beträgt fast 4.</li>
		<li>Hören Sie auf, NaOH hinzuzufügen, nachdem sich die gesamte Thiobarbitursäure vollständig aufgelöst hat. Vermeiden Sie es, einen pH-Wert von 4 zu überschreiten. Der endgültige pH-Wert kann überprüft werden, indem 1 μL aus der mischenden Thiobarbitursäurelösung entnommen und auf pH-Papier gegeben wird.</li>
		<li>Bringen Sie das Endvolumen mit DI-Wasser auf 500 ml und lagern Sie wässrige 0,8% ige Thiobarbitursäurelösung bei RT.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Malondialdehyd-Bis(dimethylacetal)-Standardprobenvorbereitung
HINWEIS: Malondialdehyd (MDA) ist instabil und nicht im Handel erhältlich. Es gibt jedoch verschiedene chemische Formen von MDA, die kommerziell erhältlich sind, wie MDA-Tetrabutylammoniumsalz, MDA-Bis (Dimethylacetal) und MDA-Bis (Diethylacetal). Von diesen drei chemischen Formen wird hier MDA-Bis (Dimethylacetal) verwendet, da die Mehrheit der Studien denselben Standard verwendet21,22. Wenn Sie sich für die Verwendung der beiden anderen chemischen Formen von MDA entscheiden, sollte eine vorherige Validierung ihrer Eignung durchgeführt werden.
<ol><li>Bereiten Sie eine 550 μM MDA-Bis (Dimethylacetal) Stammlösung vor, indem Sie 92 μL reines MDA-Bis (Dimethylacetal) in 1 L DI-Wasser verdünnen. Verwenden Sie einen magnetischen Rührstab, um die Lösung 10 Minuten lang gründlich zu mischen. Die Lösung bei 4 °C lagern und innerhalb von 1 Monat verwenden.</li>
	<li>Bereiten Sie ein 200 μM MDA-Bis (Dimethylacetal) vor, indem Sie 726 μL aus dem 550 μM MDA-Bis (Dimethylacetal) -Stamm in 1274 μL DI-Wasser verdünnen. Diese 200 μM MDA-Bis(dimethylacetal)-Lösung sollte bei jeder TBARS-Untersuchung frisch zubereitet werden.</li>
	<li>Standardkurvenvorbereitung: Nehmen Sie acht 2-ml-Polypropylenröhrchen mit Schnappverschluss und beschriften Sie sie mit den Buchstaben A bis H. Fügen Sie MDA-Bis (Dimethylacetal) aus dem 200-μM-Vorrat hinzu und verdünnen Sie es wie in Tabelle 1 beschrieben in Wasser.</li>
	<li>Nehmen Sie acht Glasröhren (13 mm x 100 mm) und beschriften Sie sie A–H, dann fügen Sie 100 μL Standard zu den entsprechenden Rohren hinzu. Führen Sie sechs Replikate für den Blankostandard (Probe A) durch, um die Nachweisgrenzen des TBARS-Assays zu berechnen. HINWEIS: Das Protokoll kann hier für nicht mehr als 1 h pausiert werden.</li>
</ol>4. TBARS-Assay
HINWEIS: Sobald der TBARS-Assay gestartet ist, sollte er ohne Unterbrechung abgeschlossen sein.
<ol><li>Nehmen Sie so viele Glasröhrchen wie nötig für die Anzahl der zu analysierenden Proben und beschriften Sie sie mit den Namen der Proben. Dann fügen Sie 100 μL jeder vorbereiteten Probe (wie oben beschrieben) zu jedem Glasröhrchen hinzu.</li>
	<li>Geben Sie 200 μL 8,1% SDS zu jeder Probe und jedem Standard hinzu und schwenken Sie das Glasröhrchen vorsichtig in einer kreisförmigen Bewegung, um die Probe zu mischen.</li>
	<li>Jeder Probe und jedem Standard werden 1,5 ml des 3,5 M Natriumacetatpuffers (pH = 4) zugesetzt.</li>
	<li>Jeder Probe und jedem Standard werden 1,5 ml der wässrigen 0,8%igen Thiobarbitursäurelösung (pH = 4) zugegeben.</li>
	<li>Bringen Sie das Endvolumen für jede Probe und jeden Standard auf 4 ml, indem Sie 700 μL DI-Wasser hinzufügen.</li>
	<li>Schließen Sie jedes Glasrohr fest ab und inkubieren Sie es in einem auf 95 °C eingestellten Heizblock für 1 h. Decken Sie die Glasröhren mit Aluminiumfolie ab, um Kondensation an den Oberseiten der Rohre zu vermeiden.</li>
	<li>Entfernen Sie die Glasröhren aus dem Heizblock und inkubieren Sie 30 min auf Eis.</li>
	<li>Zentrifugenproben und Standards bei 1500 x g für 10 min bei 4 °C. Bewahren Sie nach der Zentrifugation die Glasröhrchen mit den Proben und Standards bei RT auf. HINWEIS: Wenn Sie die Proben auf Eis oder bei 4 °C aufbewahren, wird die gesamte Probe oder Norm ausgefällt.</li>
	<li>Unmittelbar nach der Zentrifugation 150 μL Überstand aus jedem Rohr aliquotieren und in eine separate Vertiefung einer 96-Well-Platte geben.</li>
	<li>Entfernen Sie alle Blasen aus jeder Vertiefung mit einer Pipettenspitze. HINWEIS: Das Vorhandensein von Blasen führt zu inkonsistenten Absorptionswerten, was zu einer hohen Assay-Ungenauigkeit führt.</li>
	<li>Ablesen der Absorptionsraten bei 532 nm. Subtrahieren Sie den durchschnittlichen Absorptionswert der leeren Proben von allen anderen Absorptionswerten.</li>
	<li>Erstellen Sie eine Standardkurve, indem Sie die blank-subtrahierten Absorptionswerte bei 532 nm im Vergleich zur bekannten Konzentration jedes Standards darstellen. Passen Sie die Datenpunkte mithilfe der linearen Regression an. Berechnen Sie unbekannte Stichprobenkonzentrationen unter Verwendung der Gleichung der linearen Regressionslinie aus der Standardkurve.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Tsikas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+lipid+peroxidation+by+measuring+malondialdehyde+(MDA)+and+relatives+in+biological+samples:+Analytical+and+biological+challenges.">Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: Analytical and biological challenges.</a> Analytical Biochemistry. 524, 13-30 (2017).</li><li>Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+of+linoleic+acid+hydroperoxide+with+thiobarbituric+acid.">Reaction of linoleic acid hydroperoxide with thiobarbituric acid.</a> Journal of Lipid Research. 19 (8), 1053-1057 (1978).</li><li>Khoubnasabjafari, M., Soleymani, J., Jouyban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoid+Using+Spectrophotometric+Determination+of+Malondialdehyde+as+a+Biomarker+of+Oxidative+Stress.">Avoid Using Spectrophotometric Determination of Malondialdehyde as a Biomarker of Oxidative Stress.</a> Biomarkers in Medicine. 12 (6), 551-554 (2018).</li><li>Morales, M., Munn&#233;-Bosch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malondialdehyde:+Facts+and+artifacts.">Malondialdehyde: Facts and artifacts.</a> Plant Physiology. 180 (3), 1246-1250 (2019).</li><li>Devasagayam, T. P. A., Boloor, K. K., Ramasarma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+estimating+lipid+peroxidation:+An+analysis+of+merits+and+demerits.">Methods for estimating lipid peroxidation: An analysis of merits and demerits.</a> Indian Journal of Biochemistry and Biophysics. 40 (5), 300-308 (2003).</li><li>Dasgupta, A., Klein, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Measuring+Oxidative+Stress+in+the+Laboratory.">Methods for Measuring Oxidative Stress in the Laboratory.</a> Antioxidants in Food, Vitamins and Supplements. , 19-40 (2014).</li><li>Wade, C. R., van Rij, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+malondialdehyde,+lipid+peroxides,+and+the+thiobarbituric+acid+reaction.">Plasma malondialdehyde, lipid peroxides, and the thiobarbituric acid reaction.</a> Clinical Chemistry. 35 (2), 336-336 (1989).</li><li>Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+malondialdehyde+as+a+biomarker+of+oxidative+stress+in+psychological+disorders.">Reliability of malondialdehyde as a biomarker of oxidative stress in psychological disorders.</a> BioImpacts. 5 (3), 123-127 (2015).</li><li>Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comments+Concerning+"Comparison+of+Airway+and+Systemic+Malondialdehyde+Levels+for+Assessment+of+Oxidative+Stress+in+Cystic+Fibrosis".">Comments Concerning "Comparison of Airway and Systemic Malondialdehyde Levels for Assessment of Oxidative Stress in Cystic Fibrosis".</a> Lung. 193 (5), 867-868 (2015).</li><li>Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Vaez-Gharamaleki, J., Jouyban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comments+on+"Salivary+8-hydroxy-2-deoxyguanosine,+malondialdehyde,+vitamin+C,+and+vitamin+E+in+oral+pre-cancer+and+cancer:+diagnostic+value+and+free+radical+mechanism+of+action".">Comments on "Salivary 8-hydroxy-2-deoxyguanosine, malondialdehyde, vitamin C, and vitamin E in oral pre-cancer and cancer: diagnostic value and free radical mechanism of action".</a> Clinical Oral Investigations. 20 (2), 395-396 (2016).</li><li>Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comments+on+"An+Investigation+into+the+Serum+Thioredoxin+Superoxide+Dismutase,+Malondialdehyde,+and+Advanced+Oxidation+Protein+Products+in+Patients+with+Breast+Cancer".">Comments on "An Investigation into the Serum Thioredoxin Superoxide Dismutase, Malondialdehyde, and Advanced Oxidation Protein Products in Patients with Breast Cancer".</a> Annals of Surgical Oncology. 24, 573-576 (2017).</li><li>Azizi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+analytical+procedures+on+the+repeatability+of+malondialdehyde+determinations+in+biological+samples.">Effects of analytical procedures on the repeatability of malondialdehyde determinations in biological samples.</a> Pharmaceutical Sciences. 23 (3), 193-197 (2017).</li><li>Azizi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+possible+reason+for+the+low+reproducibility+of+malondialdehyde+determinations+in+biological+samples.">A possible reason for the low reproducibility of malondialdehyde determinations in biological samples.</a> Bioanalysis. 8 (21), 2179-2181 (2016).</li><li>Wasowicz, W., Neve, J., Peretz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+steps+in+fluorometric+determination+of+thiobarbituric+acid-+reactive+substances+in+serum:+Importance+of+extraction+pH+and+influence+of+sample+preservation+and+storage.">Optimized steps in fluorometric determination of thiobarbituric acid- reactive substances in serum: Importance of extraction pH and influence of sample preservation and storage.</a> Clinical Chemistry. 39 (12), 2522-2526 (1993).</li><li>Jentzsch, A. M., Bachmann, H., F&#252;rst, P., Biesalski, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+analysis+of+malondialdehyde+in+human+body+fluids.">Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids.</a> Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).</li><li>Buege, J. A., Aust, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsomal+lipid+peroxidation.">Microsomal lipid peroxidation.</a> Methods in Enzymology. 52, 302-310 (1978).</li><li>Gutteridge, J. M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-Radical+Damage+to+Lipids,+Amino-Acids,+Carbohydrates+and+Nucleic-Acids+Determined+by+Thiobarbituric+Acid+Reactivity.">Free-Radical Damage to Lipids, Amino-Acids, Carbohydrates and Nucleic-Acids Determined by Thiobarbituric Acid Reactivity.</a> International Journal of Biochemistry. 14 (7), 649-653 (1982).</li><li>Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+malondialdehyde+as+an+oxidative+stress+biomarker+in+oral+and+systemic+diseases.">Salivary malondialdehyde as an oxidative stress biomarker in oral and systemic diseases.</a> J Dent Res Dent Clin Dent Prospects. 10 (2), 71-74 (2016).</li><li>Halliwell, B., Whiteman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+reactive+species+and+oxidative+damage+in+vivo+and+in+cell+culture:+How+should+you+do+it+and+what+do+the+results+mean.">Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: How should you do it and what do the results mean.</a> British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).</li><li>Lee, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+oxidative+stress+in+human+cardiovascular+disease:+methodological+aspects+and+considerations.">Evaluating oxidative stress in human cardiovascular disease: methodological aspects and considerations.</a> Current medicinal chemistry. 19 (16), 2504-2520 (2012).</li><li>Morel, D. W., Hessler, J. R., Chisolm, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+density+lipoprotein+cytotoxicity+induced+by+free+radical+peroxidation+of+lipid.">Low density lipoprotein cytotoxicity induced by free radical peroxidation of lipid.</a> Journal of Lipid Research. 24 (8), 1070-1076 (1983).</li><li>Guzm&#225;n-Chozas, M., Vicario-Romero, I. M., Guill&#233;n-Sans, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-thiobarbituric+acid+test+for+lipid+oxidation+in+food:+Synthesis+and+spectroscopic+study+of+2-thiobarbituric+acid-malonaldehyde+adduct.">2-thiobarbituric acid test for lipid oxidation in food: Synthesis and spectroscopic study of 2-thiobarbituric acid-malonaldehyde adduct.</a> Journal of the American Oil Chemists Society. 75 (12), 1711-1715 (1998).</li><li>Shibata, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+lipid+peroxidation+product+as+a+potential+trigger+of+the+p53+pathway.">Identification of a lipid peroxidation product as a potential trigger of the p53 pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 28 (2), 1196-1204 (2006).</li><li>Skoog, D. A., West, D. M., Holler, F. J., Crouch, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sampling,+standardization,+and+calibration.">Sampling, standardization, and calibration.</a> Fundamentals of Analytical Chemistry. 9th ed. , 153-196 (2014).</li><li>Skoog, D. A., Holler, F. J., Crouch, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction.">Introduction.</a> Principles of Instrumental Analysis. 6th ed. , 1-24 (2007).</li><li>Seibig, S., Van Eldik, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+[FeII(edta)]+Oxidation+by+Molecular+Oxygen+Revisited.+New+Evidence+for+a+Multistep+Mechanism.">Kinetics of [FeII(edta)] Oxidation by Molecular Oxygen Revisited. New Evidence for a Multistep Mechanism.</a> Inorganic Chemistry. 36 (18), 4115-4120 (1997).</li><li>Jeffs, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delta-S-Cys-Albumin:+A+Lab+Test+that+Quantifies+Cumulative+Exposure+of+Archived+Human+Blood+Plasma+and+Serum+Samples+to+Thawed+Conditions.">Delta-S-Cys-Albumin: A Lab Test that Quantifies Cumulative Exposure of Archived Human Blood Plasma and Serum Samples to Thawed Conditions.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 18 (10), 2121-2137 (2019).</li><li>Yagi, K., Armstrong, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Assay+for+the+Level+of+Total+Lipid+Peroxides+in+Serum+or+Plasma.">Simple Assay for the Level of Total Lipid Peroxides in Serum or Plasma.</a> Free Radical and Antioxidant Protocols. Methods in Molecular Biology. , 101-106 (1998).</li><li>Bernheim, F., Bernheim, M. L. C., Wilbur, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reaction+between+thiobarbituric+acid+and+the+oxidation+products+of+certain+lipides.">The reaction between thiobarbituric acid and the oxidation products of certain lipides.</a> Journal of Biological Chemistry. 174 (1), 257-264 (1948).</li><li>Wilbur, K. M., Bernheim, F., Shapiro, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thiobarbituric+acid+reagent+as+a+test+for+the+oxidation+of+unsaturated+fatty+acids+by+various+agents.">The thiobarbituric acid reagent as a test for the oxidation of unsaturated fatty acids by various agents.</a> Archives of Biochemistry. 24 (2), 305-313 (1949).</li><li>Kwon, T. W., Watts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+malonaldehyde+by+ultraviolet+spectrophotometry.">Determination of malonaldehyde by ultraviolet spectrophotometry.</a> Journal of Food Science. 28 (6), 627-630 (1963).</li><li>Esterbauer, H., Schaur, F. J., Zollner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+biochemistry+of+4-hydroxynonenal,+malonaldehyde+and+related+aldehydes.">Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 11 (1), 81-128 (1991).</li><li>Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+oxidative+damage+in+human+disease.">Biomarkers of oxidative damage in human disease.</a> Clinical Chemistry. 52 (4), 601-623 (2006).</li><li>Jentzsch, A. M., Bachmann, H., F&#252;rst, P., Biesalski, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+analysis+of+malondialdehyde+in+human+body+fluids.">Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids.</a> Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).</li><li>Jo, C., Ahn, D. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorometric+Analysis+of+2-Thiobarbituric+Acid+Reactive+Substances+in+Turkey.">Fluorometric Analysis of 2-Thiobarbituric Acid Reactive Substances in Turkey.</a> Poultry Science. 77 (3), 475-480 (1998).</li><li>Tsikas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development,+validation+and+biomedical+applications+of+stable-isotope+dilution+GC-MS+and+GC-MS/MS+techniques+for+circulating+malondialdehyde+(MDA)+after+pentafluorobenzyl+bromide+derivatization:+MDA+as+a+biomarker+of+oxidative+stress+and+its+relation+to+15(S)-8-iso-prostaglandin+F2&#945;+and+nitric+oxide+(NO).">Development, validation and biomedical applications of stable-isotope dilution GC-MS and GC-MS/MS techniques for circulating malondialdehyde (MDA) after pentafluorobenzyl bromide derivatization: MDA as a biomarker of oxidative stress and its relation to 15(S)-8-iso-prostaglandin F2&#945; and nitric oxide (NO).</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1019, 95-111 (2016).</li><li>Barden, A. E., Mas, E., Croft, K. D., Phillips, M., Mori, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+artifactual+elevation+of+lipid+peroxidation+products+(F+2-isoprostanes)+in+plasma+during+collection+and+storage.">Minimizing artifactual elevation of lipid peroxidation products (F 2-isoprostanes) in plasma during collection and storage.</a> Analytical Biochemistry. 449 (1), 129-131 (2014).</li><li>Jeffs, J. W., Ferdosi, S., Yassine, H. N., Borges, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+instability+of+glycated+albumin:+A+role+for+autoxidative+glycation.">Ex vivo instability of glycated albumin: A role for autoxidative glycation.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 629, 36-42 (2017).</li><li>Lee, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malondialdehyde+in+Stored+Plasma.">Malondialdehyde in Stored Plasma.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 95 (4), 1663-1672 (1980).</li><li>Tsikas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+GC-MS/MS+measurement+of+malondialdehyde+and+4-hydroxy-2-nonenal+in+human+plasma:+Effects+of+long-term+L-arginine+administration.">Simultaneous GC-MS/MS measurement of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal in human plasma: Effects of long-term L-arginine administration.</a> Analytical Biochemistry. 524, 31-44 (2017).</li></ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte offenzulegen.

Trotz seiner Einschränkungen1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 und mangelnder Eignung für Vergleiche zwischen Laboratorien ist der TBARS-Assay einer der <...

Lipidperoxidation ist ein Prozess, bei dem freie Radikale, wie reaktive Sauerstoffspezies und reaktive Stickstoffspezies, Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen in Lipiden angreifen, ein Prozess, der die Abstraktion eines Wasserstoffs aus einem Kohlenstoff und die Insertion eines Sauerstoffmoleküls beinhaltet. Dieser Prozess führt zu einer Mischung komplexer Produkte, einschließlich Lipidperoxylreste und Hydroperoxide als Primärprodukte sowie Malondialdehyd (MDA) und 4-Hydroxynonenal als vorherrschende Sekundärprodukte1.
MDA wurde in der biomedizinischen Forschung aufgrund seiner einfachen Reaktion mit Thiobarbitursäure (TBA) häufig als Marker für die Lipidperoxidation verwendet. Die Reaktion führt zur Bildung von MDA-TBA2, einem Konjugat, das im sichtbaren Spektrum bei 532 nm absorbiert und eine rot-rosa Farbe erzeugt2. Andere Moleküle, die neben MDA aus der Lipidperoxidation stammen, können ebenfalls mit TBA reagieren und Licht bei 532 nm absorbieren, was zum gemessenen Gesamtabsorptionssignal beiträgt. In ähnlicher Weise kann MDA mit den meisten anderen wichtigen Klassen von Biomolekülen reagieren, was möglicherweise seine Zugänglichkeit für die Reaktion mit TBA3,4 einschränkt. Daher wird dieser traditionelle Assay einfach als Messung von "Thiobarbitursäure-reaktiven Substanzen" oder TBARS5 betrachtet.
Bei richtiger Anwendung und Interpretation wird der TBARS-Assay im Allgemeinen als guter Indikator für den Gesamtgehalt des oxidativen Stresses in einer biologischen Probe angesehen6. Leider, wie von Khoubnasabjafari und anderen dokumentiert, wird der TBARS-Assay oft auf eine Weise durchgeführt und interpretiert, die zweifelhafte Schlussfolgerungen ermöglicht3,4,7,8,9,10,11. Die Ursachen dafür liegen in erster Linie in probenbezogenen präanalytischen Variablen und einem Mangel an Assay-Robustheit, der scheinbar geringfügige Variationen im Assay-Protokoll ohne wesentliche Änderungen der Assay-Ergebnisse verbietet1,7,12,13.
Präanalytische Variablen im Zusammenhang mit der Handhabung und Lagerung von Bioproben (z. B. Blutplasma, das vorübergehend bei -20 °C gehalten wird)14,15 können einen großen Einfluss auf die TBARS-Testergebnisse haben16,17; so sehr, dass TBARS-Assay-Ergebnisse nicht zwischen verschiedenen Labors verglichen werden sollten, es sei denn, dies wird durch explizite analytische Validierungsdaten zwischen den Labors gerechtfertigt. Diese Empfehlung ähnelt der Art und Weise, wie Western Blots häufig verwendet und interpretiert werden. Vergleiche der Banddichten gelten für Studien innerhalb des Blots und vielleicht innerhalb des Labors, aber der Vergleich der Banddichten zwischen Laboratorien wird im Allgemeinen als ungültige Praxis angesehen.
Einige Forscher haben vorgeschlagen, dass MDA, gemessen mit dem TBARS-Assay, einfach nicht die analytischen oder klinischen Kriterien erfüllt, die für einen akzeptablen Biomarker erforderlich sind3,9,10,18,19. In der Tat, wenn der Assay nicht vor über 50 Jahren entwickelt worden wäre, hätte er wahrscheinlich nicht die weit verbreitete Verwendung und stillschweigende Akzeptanz erlangt, die er heute hat. Obwohl es andere Assays mit größerer analytischer Sensitivität, Spezifität und Robustheit gibt, die zur Bestimmung von oxidativem Stress verwendet werden, bleibt der TBARS-Assay, der auf der Absorption bei 532 nm basiert, bei weitem einer der am häufigsten verwendeten Assays zur Bestimmung der Lipidperoxidation20 und damit zur Bewertung von oxidativem Stress.
Der TBARS-Assay ist nur als teures Kit (über 400 US-Dollar) zu finden, in dem die Anleitung keine detaillierten Informationen über die meisten Konzentrationen der verwendeten Reagenzien liefert. Darüber hinaus können die bereitgestellten Reagenzien nur für ein Experiment verwendet werden, da nur eine kolorimetrische Standardkurve pro Kit hergestellt werden kann. Dies kann für Forscher problematisch sein, die beabsichtigen, den Oxidationsgrad innerhalb weniger Proben zu verschiedenen Zeitpunkten zu bestimmen, da die gleiche Standardkurve nicht mehrmals verwendet werden kann. Daher müssen mehrere Kits für mehrere Experimente gekauft werden. Derzeit gibt es kein detailliertes Protokoll für die Durchführung eines TBARS-Assays, es sei denn, es wird ein teures Kit gekauft. Einige Forscher haben in der Vergangenheit vage beschrieben, wie man einen TBARS-Assay durchführt21,22, aber weder ein vollständig detailliertes Protokoll noch ein umfassendes Video darüber, wie man den TBARS-Assay ohne ein teures Kit durchführt, ist in der Literatur verfügbar.
Hier berichten wir über eine detaillierte, analytisch validierte Methodik zur Durchführung eines TBARS-Assays auf einfache, reproduzierbare und kostengünstige Weise. Veränderungen in der Lipidperoxidation von humanem Serum, HepG2-Lysaten und Lipoproteinen niedriger Dichte bei der Behandlung mit Cu(II)-Ionen werden als illustrative Anwendungen für den TBARS-Assay nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigen, dass dieser TBARS-Assay im Alltag konsistent und reproduzierbar ist.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Sterile PBS pH 7.4 1 L</td>
			<td>VWR, PA</td>
			<td>101642--262</td>
			<td>cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL self-standing centrifuge tube</td>
			<td>Corning, NY</td>
			<td>CLS430897</td>
			<td>General material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate, Non-Treated, clear, with lid, Non-sterile</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, MA</td>
			<td>280895</td>
			<td>To measure absorbance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 100 kD centrifugal spin filter device</td>
			<td>Fisher Scientific, NH</td>
			<td>UFC510024</td>
			<td>LDL purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caps for glass tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, MA</td>
			<td>14-930-15D</td>
			<td>for TBARS assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper II Chloride</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>222011-250G</td>
			<td>to induce oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tubes, Disposable, with Screw-Cap Finish, Borosilicate Glass (13 x 100 mm)</td>
			<td>VWR, PA</td>
			<td>53283-800</td>
			<td>for TBARS assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s Minimum Essential Medium (EMEM)</td>
			<td>ATCC, VA</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td>HepG2 cell media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>eppendorf, NY</td>
			<td>22363204</td>
			<td>General material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Genesee Sceitific, CA</td>
			<td>22363352</td>
			<td>General material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum US Source</td>
			<td>Omega Scientific, CA</td>
			<td>FB-11</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>27225-1L-R</td>
			<td>TBARS Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x)</td>
			<td>Thermo Scientific, MA</td>
			<td>87786</td>
			<td>cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td>LDL solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2 Cells</td>
			<td>ATCC, VA</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td>Biological matrix prototype</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific, NH</td>
			<td>A144-212</td>
			<td>cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Legend Micro 17 Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific, MA</td>
			<td>75002431</td>
			<td>General material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Density Lipoprotein, Human Plasma</td>
			<td>Athens Research &#38; Technology, GA</td>
			<td>12-16-120412</td>
			<td>Biological matrix prototype</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stir Bars, Octagon 6-Assortment</td>
			<td>VWR, PA</td>
			<td>58948-025</td>
			<td>General material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malondialdehyde bis (dimethyl acetal)</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>8207560250</td>
			<td>TBARS Standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiskan Go Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>Fisher Scientific, NH</td>
			<td>51119200</td>
			<td>To measure absorbance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>EMD Millipore Corp, MA</td>
			<td>492016-100ML</td>
			<td>cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td>cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>436143-100G</td>
			<td>TBARS Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>367176-2.5KG</td>
			<td>TBARS Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac Concentrator</td>
			<td>Thermo Scientific, MA</td>
			<td>SC250EXP</td>
			<td>For concentrating cell lysates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 Flask, Tissue Culture Treated, 250 mL, w/filter cap</td>
			<td>USA Scientific, FL</td>
			<td>658175</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiobarbituric Acid</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>T5500-100G</td>
			<td>TBARS Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS base</td>
			<td>Fluka, GA</td>
			<td>93362</td>
			<td>cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (1x)</td>
			<td>VWR, PA</td>
			<td>16777-166</td>
			<td>To detach HepG2 cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of oxidative stress in biological samples using the thiobarbituric acid reactive substances assay

Trotz seiner begrenzten analytischen Spezifität und Robustheit wurde der Thiobarbitursäure-reaktive Substanzen (TBARS) Assay weit verbreitet als generische Metrik der Lipidperoxidation in biologischen Flüssigkeiten verwendet. Es wird oft als ein guter Indikator für den Grad des oxidativen Stresses in einer biologischen Probe angesehen, vorausgesetzt, die Probe wurde ordnungsgemäß gehandhabt und gelagert. Der Assay beinhaltet die Reaktion von Lipidperoxidationsprodukten, hauptsächlich Malondialdehyd (MDA), mit Thiobarbitursäure (TBA), was zur Bildung von MDA-TBA2-Addukten namens TBARS führt. TBARS ergibt eine rot-rosa Farbe, die spektralphotometrisch bei 532 nm gemessen werden kann. Der TBARS-Assay wird unter sauren Bedingungen (pH = 4) und bei 95 °C durchgeführt. Reines MDA ist instabil, aber diese Bedingungen erlauben die Freisetzung von MDA aus MDA-Bis (Dimethylacetal), das als analytischer Standard in dieser Methode verwendet wird. Der TBARS-Assay ist eine einfache Methode, die in etwa 2 h abgeschlossen werden kann. Die Herstellung von Assay-Reagenzien wird hier ausführlich beschrieben. Budgetbewusste Forscher können diese Reagenzien für mehrere Experimente zu geringen Kosten verwenden, anstatt ein teures TBARS-Assay-Kit zu kaufen, das nur die Konstruktion einer einzigen Standardkurve erlaubt (und somit nur für ein Experiment verwendet werden kann). Die Anwendbarkeit dieses TBARS-Assays wird in humanem Serum, Lipoproteinen niedriger Dichte und Zelllysaten gezeigt. Der Assay ist konsistent und reproduzierbar, und es können Nachweisgrenzen von 1,1 μM erreicht werden. Es werden Empfehlungen für die Verwendung und Interpretation des spektralphotometrischen TBARS-Assays gegeben.

Unter sauren Bedingungen (pH = 4) und bei 95 °C ergibt Malondialdehyd (MDA) bis(dimethyl acetal) MDA23. MDA und eng verwandte chemische Kongenere reagieren mit zwei Molekülen Thiobarbitursäure (TBA), um Verbindungen zu produzieren, die als Thiobarbitursäure-reaktive Substanzen (TBARS) bezeichnet werden, die eine rot-rosa Farbe ergeben und eine Absorption λmax bei 532 nm aufweisen (Abbildung 1, Abbildung 2). Unter Verwendun...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Oxidative Stress in Biological Samples Using the Thiobarbituric Acid Reactive Substances Assay at JoVE.com

Evaluation of Oxidative Stress in Biological Samples Using the Thiobarbituric Acid Reactive Substances Assay

Das Ziel des Thiobarbitursäure-Reaktivsubstanz-Assays ist es, oxidativen Stress in biologischen Proben zu bewerten, indem die Produktion von Lipidperoxidationsprodukten, hauptsächlich Malondialdehyd, unter Verwendung der Spektrophotometrie der sichtbaren Wellenlänge bei 532 nm gemessen wird. Die hier beschriebene Methode kann auf menschliches Serum, Zelllysate und Lipoproteine niedriger Dichte angewendet werden.

Bewertung von oxidativem Stress in biologischen Proben mit dem Thiobarbitursäure-Reaktivsubstanz-Assay

Despite its limited analytical specificity and ruggedness, the thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) assay has been widely used as a generic ...

evaluation-oxidative-stress-biological-samples-using-thiobarbituric

Research

JoVE Journal

Chemistry

27.3K Aufrufe.  Arizona State University. Das Ziel des Thiobarbitursäure-Reaktivsubstanz-Assays ist es, oxidativen Stress in biologischen Proben zu bewerten, indem die Produktion von Lipidperoxidationsprodukten, hauptsächlich Malondialdehyd, unter Verwendung der Spektrophotometrie der sichtbaren Wellenlänge bei 532 nm gemessen wird. Die hier beschriebene Methode kann auf menschliches Serum, Zelllysate und Lipoproteine niedriger Dichte angewendet werden.

Serie: Evaluation of Oxidative Stress in Biological Samples Using the Thiobarbituric Acid Reactive Substances Assay

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first separated into polar and non-polar fractions by a liquid-liquid phase extraction, and partially purified to facilitate downstream analysis. Both aqueous (polar metabolites) and organic (non-polar metabolites) phases of the initial extraction are processed to survey a broad range of metabolites. Metabolites are separated by different liquid chromatography methods based upon their partition properties. In this method, we present microflow ultra-performance (UP)LC methods, but the protocol is scalable to higher flows and lower pressures. Introduction into the mass spectrometer can be through either general or compound optimized source conditions. Detection of a broad range of ions is carried out in full scan mode in both positive and negative mode over a broad m/z range using high resolution on a recently calibrated instrument. Label-free differential analysis is carried out on bioinformatics platforms. Applications of this approach include metabolic pathway screening, biomarker discovery, and drug development.

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Untargeted metabolomics provides a hypothesis generating snapshot of a metabolic profile. This protocol will demonstrate the extraction and analysis of metabolites from cells, serum, or tissue. A range of metabolites are surveyed using liquid-liquid phase extraction, microflow ultraperformance liquid chromatography/high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) coupled to differential analysis software.

Untargeted Metabolomics aus biologischen Quellen Mit UltraPerformance Flüssigkeits-Chromatographie-hochauflösender Massenspektrometrie (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Forschung

Chemie

Anticancer Metal Complexes: Synthesis and Cytotoxicity Evaluation by the MTT Assay

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; therefore their preparation should be conducted under an inert atmosphere. Evaluation of the anticancer activity of these complexes can be achieved by the MTT assay.
The MTT assay is a colorimetric viability assay based on enzymatic reduction of the MTT molecule to formazan when it is exposed to viable cells. The outcome of the reduction is a color change of the MTT molecule. Absorbance measurements relative to a control determine the percentage of remaining viable cancer cells following their treatment with varying concentrations of a tested compound, which is translated to the compound anticancer activity and its IC50 values. The MTT assay is widely common in cytotoxicity studies due to its accuracy, rapidity, and relative simplicity.
Herein we present a detailed protocol for the synthesis of air sensitive metal based drugs and cell viability measurements, including preparation of the cell plates, incubation of the compounds with the cells, viability measurements using the MTT assay, and determination of IC50 values.

A method for synthesis of air-sensitive titanium and vanadium anticancer agents is described, along with the evaluation of their cytotoxic activity towards human cancer cell line by the MTT Assay.

Anti-Krebs-Metall-Komplexe: Synthese und Zytotoxizität Bewertung durch die MTT-Assay

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; ...

Supercritical Nitrogen Processing for the Purification of Reactive Porous Materials

Supercritical fluid extraction and drying methods are well established in numerous applications for the synthesis and processing of porous materials. Herein, nitrogen is presented as a novel supercritical drying fluid for specialized applications such as in the processing of reactive porous materials, where carbon dioxide and other fluids are not appropriate due to their higher chemical reactivity. Nitrogen exhibits similar physical properties in the near-critical region of its phase diagram as compared to carbon dioxide: a widely tunable density up to ~1 g ml-1, modest critical pressure (3.4 MPa), and small molecular diameter of ~3.6 &#197;. The key to achieving a high solvation power of nitrogen is to apply a processing temperature in the range of 80-150 K, where the density of nitrogen is an order of magnitude higher than at similar pressures near ambient temperature. The detailed solvation properties of nitrogen, and especially its selectivity, across a wide range of common target species of extraction still require further investigation. Herein we describe a protocol for the supercritical nitrogen processing of porous magnesium borohydride.

Nitrogen is an effective supercritical fluid for extraction or drying processes due to its small molecular size, high density in the near-liquid supercritical regime, and chemical inertness. We present a supercritical nitrogen drying protocol for the purification treatment of reactive, porous materials.

Kritischer Stickstoff Verarbeitung für die Reinigung von Reactive Porous Materials

Supercritical fluid extraction and drying methods are well established in numerous applications for the synthesis and processing of porous materials. ...

Using Polystyrene-block-poly(acrylic acid)-coated Metal Nanoparticles as Monomers for Their Homo- and Co-polymerization

We present a template-free method for &#8220;polymerizing&#8221; nanoparticles into long chains without side branches. A variety of nanoparticles are encapsulated in polystyrene-block-poly(acrylic acid) (PSPAA) shells and then used as monomers for their self-assembly. Spherical PSPAA micelles upon acid treatment are known to assemble into cylindrical micelles. Exploiting this tendency, the core-shell nanoparticles are induced to aggregate, coalesce, and then transform into long chains. When more than one type of nanoparticles are used, random and block &#8220;copolymers&#8221; of nanoparticles can be obtained. Detailed procedures are reported for the PSPAA encapsulation of nanoparticles, homo- and co-polymerization of the core-shell nanoparticles, separation and purification of the resulting nanoparticle chains. Transformations of single-line chains into double- and triple-line chains are also presented. The synergy between the polymer shell and the embedded nanoparticles leads to an unusual chain-growth polymerization mode, giving long nanoparticle chains that are distinct from the products of the traditional step-growth aggregation process.

Using Polystyrene-block-polyacrylic acid-coated Metal Nanoparticles as Monomers for Their Homo- and Co-polymerization

We report protocols for &#8220;polymerizing&#8221; various types of polymer-encapsulated metal nanoparticles into long chains of &#8220;homo-&#8220; and &#8220;co-polymers&#8221;.

Verwendung Polystyrol-<em&gt; Block</em&gt; -Poly (Acrylsäure) beschichteten Metallnanopartikel als Monomere für ihre Homo- und Polymerisation

We present a template-free method for &#8220;polymerizing&#8221; nanoparticles into long chains without side branches. A variety of nanoparticles are ...

Photochemical Oxidative Growth of Iridium Oxide Nanoparticles on CdSe@CdS Nanorods

We demonstrate a procedure for the photochemical oxidative growth of iridium oxide catalysts on the surface of seeded cadmium selenide-cadmium sulfide (CdSe@CdS) nanorod photocatalysts. Seeded rods are grown using a colloidal hot-injection method and then moved to an aqueous medium by ligand exchange. CdSe@CdS nanorods, an iridium precursor and other salts are mixed and illuminated. The deposition process is initiated by absorption of photons by the semiconductor particle, which results with formation of charge carriers that are used to promote redox reactions. To insure photochemical oxidative growth we used an electron scavenger. The photogenerated holes oxidize the iridium precursor, apparently in a mediated oxidative pathway. This results in the growth of high quality crystalline iridium oxide particles, ranging from 0.5 nm to about 3 nm, along the surface of the rod. Iridium oxide grown on CdSe@CdS heterostructures was studied by a variety of characterization methods, in order to evaluate its characteristics and quality. We explored means for control over particle size, crystallinity, deposition location on the CdS rod, and composition. Illumination time and excitation wavelength were found to be key parameters for such control. The influence of different growth conditions and the characterization of these heterostructures are described alongside a detailed description of their synthesis. Of significance is the fact that the addition of iridium oxide afforded the rods astounding photochemical stability under prolonged illumination in pure water (alleviating the requirement for hole scavengers).

A protocol for the photochemical oxidative growth of small crystalline iridium oxide nanoparticles on the surface of CdSe@CdS seeded rod nanoparticles is presented.

Photochemische oxidative Wachstum von Iridium-Nanopartikel auf CdSe @ CdS-Nanostäbchen

We demonstrate a procedure for the photochemical oxidative growth of iridium oxide catalysts on the surface of seeded cadmium selenide-cadmium sulfide ...

The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples

Mass spectrometry (MS)-based integrated metaproteomic, metabolomic, and lipidomic (multi-omic) studies are transforming our ability to understand and characterize microbial communities in environmental and biological systems. These measurements are even enabling enhanced analyses of complex soil microbial communities, which are the most complex microbial systems known to date. Multi-omic analyses, however, do have sample preparation challenges, since separate extractions are typically needed for each omic study, thereby greatly amplifying the preparation time and amount of sample required. To address this limitation, a 3-in-1 method for the simultaneous extraction of metabolites, proteins, and lipids (MPLEx) from the same soil sample was created by adapting a solvent-based approach. This MPLEx protocol has proven to be both simple and robust for many sample types, even when utilized for limited quantities of complex soil samples. The MPLEx method also greatly enabled the rapid multi-omic measurements needed to gain a better understanding of the members of each microbial community, while evaluating the changes taking place upon biological and environmental perturbations.

A protocol is presented for simultaneously extracting metabolites, proteins, and lipids from a single soil sample, allowing reduced sample preparation times and enabling multi-omic mass spectrometry analyses of samples with limited quantities.

Das MPLEx-Protokoll für Multi-Omic Analysen von Bodenproben

Mass spectrometry (MS)-based integrated metaproteomic, metabolomic, and lipidomic (multi-omic) studies are transforming our ability to understand and ...

Separation of Aldehydes and Reactive Ketones from Mixtures Using a Bisulfite Extraction Protocol

The purification of organic compounds is an essential component of routine synthetic operations. The ability to remove contaminants into an aqueous layer by generating a charged structure provides an opportunity to use extraction as a simple purification technique. By combining the use of a miscible organic solvent with saturated sodium bisulfite, aldehydes and reactive ketones can be successfully transformed into charged bisulfite adducts that can then be separated from other organic components of a mixture by the introduction of an immiscible organic layer. Here, we describe a simple protocol for the removal of aldehydes, including sterically-hindered neopentyl aldehydes and some ketones, from chemical mixtures. Ketones can be separated if they are sterically unhindered cyclic or methyl ketones. For aliphatic aldehydes and ketones, dimethylformamide is used as the miscible solvent to improve removal rates. The bisulfite addition reaction can be reversed by basification of the aqueous layer, allowing for the re-isolation of the reactive carbonyl component of a mixture.

Here, we present a protocol to remove aldehydes and reactive ketones from mixtures by a liquid-liquid extraction protocol directly with saturated sodium bisulfite in a miscible solvent. This combined protocol is rapid and facile to perform. The aldehyde or ketone can be re-isolated by the basification of the aqueous layer.

Trennung von Aldehyden und reaktive Ketone von Mischungen mit einem Bisulfit-Extraktion-Protokoll

The purification of organic compounds is an essential component of routine synthetic operations. The ability to remove contaminants into an aqueous layer ...

Reactive Inkjet Printing and Propulsion Analysis of Silk-based Self-propelled Micro-stirrers

In this study, a protocol for using reactive inkjet printing to fabricate enzymatically propelled silk swimmers with well-defined shapes is reported. The resulting devices are an example of self-propelled objects capable of generating motion without external actuation and have potential applications in medicine and environmental sciences for a variety of purposes ranging from micro-stirring, targeted therapeutic delivery, to water remediation (e.g., cleaning oil spills). This method employs reactive inkjet printing to generate well-defined small-scale solid silk structures by converting water soluble regenerated silk fibroin (silk I) to insoluble silk fibroin (silk II). These structures are also selectively doped in specific regions with the enzyme catalase in order to produce motion via bubble generation and detachment. The number of layers printed determines the three-dimensional (3D) structure of the device, and so here the effect of this parameter on the propulsive trajectories is reported. The results demonstrate the ability to tune the motion by varying the dimensions of the printed structures.

This protocol demonstrates the ability to utilize reactive inkjet printing to print self-motile biocompatible and environmentally friendly micro-stirrers for use in biomedical and environmental applications.

Reaktive Inkjet-Druck-und Antriebsanalyse von seidenbasierten, selbstfahrenden Mikro-Rührern

In this study, a protocol for using reactive inkjet printing to fabricate enzymatically propelled silk swimmers with well-defined shapes is reported. The ...

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. Yet maleimide-based conjugates display limited stability in vivo because the succinimidyl thioether linkage can undergo a retro-Michael reaction. This, of course, can lead to the release of the radioactive payload or its exchange with thiol-bearing biomolecules in circulation. Both of these processes can produce elevated activity concentrations in healthy organs as well as decreased activity concentrations in target tissues, resulting in reduced imaging contrast and lower therapeutic ratios. In 2018, we reported the creation of a modular, stable, and easily accessible phenyloxadiazolyl methyl sulfone reagent &#8212; dubbed &#8216;PODS&#8217; &#8212; as a platform for thiol-based bioconjugations. We have clearly demonstrated that PODS-based site-selective bioconjugations reproducibly and robustly create homogenous, well-defined, highly immunoreactive, and highly stable radioimmunoconjugates. Furthermore, preclinical experiments in murine models of colorectal cancer have shown that these site-selectively labeled radioimmunoconjugates exhibit far superior in vivo performance compared to radiolabeled antibodies synthesized via maleimide-based conjugations. In this protocol, we will describe the four-step synthesis of PODS, the creation of a bifunctional PODS-bearing variant of the ubiquitous chelator DOTA (PODS-DOTA), and the conjugation of PODS-DOTA to the HER2-targeting antibody trastuzumab.

In this protocol, we will describe the synthesis of PODS, a phenyoxadiazolyl methyl sulfone-based reagent for the site-selective attachment of cargos to the thiols of biomolecules, particularly antibodies. In addition, we will describe the synthesis and characterization of a PODS-bearing bifunctional chelator and its conjugation to a model antibody.

Synthese und Biokonjugaten der Thiol-reaktive Reagenzien für die Erstellung der Website selektiv geändert Immunokonjugate

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample preparation is a key and often complex procedure, particularly for biological samples. Although X-ray speciation techniques are widely used, no detailed protocol has been yet disseminated for users of the technique. Further, chemical state modification is of concern, and cryo-based techniques are recommended to analyze the biological samples in their near-native hydrated state to provide the maximum preservation of chemical integrity of the cells or tissues. Here, we propose a cellular preparation protocol based on cryo-preserved samples. It is demonstrated in a high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy study of selenium in cancer cells and a study of iron in phytoplankton. This protocol can be used with other biological samples and other X-ray techniques that can be damaged by irradiation.

This protocol presents a detailed procedure to prepare biological cryosamples for synchrotron-based X-ray absorption spectroscopy experiments. We describe all the steps required to optimize sample preparation and cryopreservation with examples of the protocol with cancer and phytoplankton cells. This method provides a universal standard of sample cryo-preparation.

Biologische Probenvorbereitung für die Speziation bei kryogener Temperatur mittels hochauflösender Röntgenabsorptionsspektroskopie

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...