Hallo an alle, mein Name ist Dr.Bipasha Bose. Ich arbeite als außerordentlicher Professor und verantwortlich im Stem Cells and Regenerative Medicine Center, Yenepoya Research Center, Yenepoya University, Mangalore, Indien. Jetzt werden wir zeigen, wie wir für das Vorhandensein von ROS, d. h. reaktiven Sauerstoffspezies, in den lebenden Kulturen von den Augenoberflächen der Maus, die verschiedenen Dosen ultravioletter C-Strahlung ausgesetzt wurden, erkennen können.
Der Vorteil dieser Technik ist, dass wir hier gleichzeitig für das Vorhandensein von reaktiven Sauerstoffspezies, lebenden und abgestorbenen Zellen erkennen können, ohne dass vester Zellen benötigt werden. Das Prinzip dieser Technik liegt im Wesentlichen in der Durchlässigkeit der lebenden Zelle dcFDA. DCFDA ist ein lebender Zellpermeant farbloser Farbstoff, der während des oxidativen Stresses von den intrazellulären Oxidasen betätigt und in grüne Fluoreszenz-DCF umgewandelt wird.
Daher ermöglicht uns die grüne Blütenstand es uns, das Vorhandensein von reaktiven Sauerstoffspezies in den lebenden Zellen zu erkennen. Andererseits ist Propidiumiodid ein ausschließlich toter Zellpermeant-Farbstoff, der rot fluoresziert. Es ist ein rDNA doppelsträngiger Interkalierender Farbstoff.
Der Farbstoff Hoechst ist jedoch sowohl für die lebenden als auch für die abgestorbenen Zellen durchstoent. Es ist ein blauer Farbe kernier Fleck. Daher ist dies eine sehr einfache Methode, bei der wir das Vorhandensein von reaktiven Sauerstoffspezies in Langzeitkulturen zeitabhängig zusammen mit der Bewertung abgestorbener Zellen erkennen können.
Tellerpunkt zwei Millionen Zellen pro 35 Millimeter Kulturgerichte. Die Zellen, die wir anwenden, sind die Zellen von der Maus-Augenoberfläche. Entfernen Sie die maximale Volumen menge medien aus jedem der Zellkultur-Gerichte.
Lassen Sie rund 500 Mikroliter Zellkulturmedien in engem Kontakt mit den Zellen zurück. Minimale Medienmenge verhindert das Trocknen der Zellen. Der Zweck einer minimalen Medienmenge besteht jedoch darin, die maximale Penetration der UVC-Exposition zu ermöglichen.
Nehmen Sie die Zellen unter einer UV-Quelle, es kann entweder ein UV-Vernetzen, oder kann jede andere ULTRAviolett-C-Quelle sein. Setzen Sie die Zellen einer unterschiedlichen Dosierung von UVC-Strahlung aus, z. B. 10, 100, 1 000 und 10 000 Joule pro Quadratmeter. Wenn die Zellen ultravioletter C-Strahlung ausgesetzt sind, sollten sich die Deckel in der offenen Position befinden.
Dies ermöglicht eine maximale Penetration des Ultraviolett-C in die Zellen und zeigt somit die optimale Dosis-Reaktion der Zellen auf die Ultraviolett-C-Strahlung. Bringen Sie die Zellen auf die laminare Luftstromhaube und füllen Sie jedes der Gerichte mit zwei Milliliter komplette Medien auf. Dieses komplette Medium enthält 20% fetales Rinderserum in DMEM, ergänzt mit Ergänzungen wie 1%Minimum nicht-essentielle Aminosäuren, und auch 1%Antibiotikum, das Penicillin und Streptomycin ist.
Danach, nach dem Auffüllen mit maximalem Volumen, d. h. zwei Milliliter nbiss, geben Sie die Platten an den Inkubator zurück und inkubieren Sie für einen Zeitraum von drei Stunden, um die frühen Auswirkungen der Ultraviolett-C-Strahlung zu sehen. Bereiten Sie die Live-Zell-Färbungsmedien in den letzten 15 Minuten der dreistündigen 3-Stündigen nach der UVC-Zellinkubation vor. Färbemedien werden in 10%FBS hergestellt, die DMEM vorgewärmt auf 37 Grad enthalten.
Für die Herstellung von 10 Milliliter Färbemedien, fügen Sie zuerst fünf Mikroliter DCFDA aus einem Bestand von 10 Millimolar, um eine endgültige Konzentration von fünf Mikromolar zu erhalten. Gut mischen, indem Sie nach oben und unten pfeifen. Zweitens, fügen Sie fünf Mikroliter Hoechst-Lösung aus einem Bestand von 10 Milligramm pro ml, um eine endgültige Konzentration von fünf Mikrogramm pro ml zu erhalten.
Jetzt gut mischen, indem Sie nach oben und unten. Schließlich fügen Sie 200 Mikroliter Propidiumjodid aus einem Vorrat von einem Milligramm pro ml hinzu, um eine Endkonzentration von 20 Mikrogramm pro ml zu erhalten. Gut mischen, indem Sie nach oben und unten pfeifen.
Jetzt ist die Färbelösung einsatzbereit. Entfernen Sie nach drei Stunden Inkubation nach UVC-Exposition die Platten aus dem CO2-Inkubator. Aspirieren Sie die Medien von jedem der Gerichte, die verschiedenen Dosierungen von UVC ausgesetzt wurden, wie ein, 10, 100, 1 000, und 10 000 Joule pro Quadratmeter.
Nun fügen Sie zwei Milliliter frisch zubereitete Live-Zell-Färbung Sendemittel zu jedem der Gerichte sanft von den Seiten des Geschirrs. Die Platten wieder in den CO2-Inkubator zurückgeben und 15 Minuten lang für die Färbung von Lebenden Zellen inkubieren. Nach 15 Minuten Inkubation in den LebendenZell-Färbemedien entfernen Sie die Färbemedien aus jedem der Gerichte, die Zellen enthalten, die unterschiedlichen Dosen von ULTRAviolett-C-Strahlung ausgesetzt sind.
Füllen Sie die Zellen mit zwei Milliliter n. B. gesamtmediale Medien auf. Jetzt sind die Zellen bereit für die Anzeige. Platzieren Sie nun die Steuerzellen unter das helle Feld des fluoreszierenden Imagers.
Die Zellen sehen scheinbar normal aus, da sie Kontrollzellen sind. Unter dem blauen Feld können wir die fluoreszierenden Gesamtzellen. Unter der grünen Wiese zeigt die ROS-Generation.
Da es sich um Kontrollzellen handelt, wird kein ROS generiert. Unter dem roten Feld sind die propidium iodid entleichen Zellen sichtbar. Dann halten Sie die UV-belichtet 100 Joule pro Quadratmeter unter dem hellen Feld.
Unter dem blauen Feld, und auch können wir die Gesamtzahl der Zellen unter dem blauen Feld sehen. Wenn wir jedoch der grünen Wiese aussetzen, werden DCFDA-positive Zellen gesehen, und auch PI-positive abgestorbene Zellen werden gesehen. Platzieren Sie schließlich die maximale UV-Dosis, d. h. 10.000 Joule pro Meter freigelegter Zellen pro Meter, unter das helle Feld.
Wir können abnormale Zellmorphologie sehen. Unter dem blauen Feld können wir jedoch insgesamt blaue Zellen sehen. Unter dem grünen Feld werden grüne fluoreszierende DCFDA-positive Zellen gesehen, die auf die ROS-Generation hinweisen.
Wenn die Zellen einem roten Feld ausgesetzt sind, fluoreszieren alle Zellen rot, was auf eine große Anzahl von Zellabsterben hindeutet, wenn die Zellen mit 10.000 Joule pro Quadratmeter UV-Dosierung behandelt werden. Ordnen Sie nun die in verschiedenen Kanälen aufgenommenen Bilder in einem einzigen zusammengesetzten Bildpanel an, das den Ultraviolett-C-Dosen und nicht exponierten Steuerelementen entspricht. Die Bilder sind in einem einzigen Panel in der Gruppe angeordnet.
Erstens, das helle Feld. Zweitens, der Hoechst blaue Kernfleck. Drittens, Propidiumjodid Färbung wie für tote Kerne.
Viertens, DCFDA für ROS-positive Zellen. Und fünftens, das verschmolzene Bild. Wenn wir uns die erste und die zweite Bildreihe ansehen, d.h. die unbelichtete Kontrolle und die Zellen, die der UVC-Dosis einen Joule pro Meter Quadrat ausgesetzt sind, stellten wir fest, dass es weder PI- noch ROS-positive Zellen gab, die aufgeleuchtet waren, was auf ein völliges Fehlen von ROS und Zelltod bei nicht exponierten Kontrollen und eine so niedrige UVC-Dosis von einem Joule pro Quadratmeter hindeutet.
Nun kommen sie zur dritten Reihe von zusammengesetzten Bildern der Zellen, die 100 Joule pro Quadratmeter ausgesetzt waren. Ein sehr geringer Prozentsatz der Zellen, etwa 10%, waren sowohl für PI als auch für DCFDA in dieser Dosis positiv, was auf eine geringe Menge an ROS-Generierung und Zelltod hindeutet. Nun geht es zu einer weiter höheren Dosis UVC-Strahlung, d. h. 1.000 Joule pro Quadratmeter, wie in der vierten Reihe des zusammengesetzten Bildes angegeben.
Hier waren etwa 70% der Zellen positiv für PI und DCFDA. Schließlich kommen wir zur höchsten Dosis UVC-Exposition, d. h. 10.000 Joule pro Quadratmeter, wie in der fünften Reihe des zusammengesetzten Bildes dargestellt. Hier wurden festgestellt, dass fast 100% der Zellen sowohl für PI als auch für DCFDA positiv waren, was auf einen 100%Zelltod und die ROS-Generierung bei dieser speziellen UVC-Dosis hindeutet.
Übertragen Sie die Bilder an die Bildverarbeitungssoftware. Öffnen Sie zuerst das blaue Bild, das die Hoescht-gebeizten Kerne anzeigt, d. h. die Gesamtzahl der Zellen. Öffnen Sie das Zählwerkzeug, und klicken Sie auf jede Zelle nacheinander, um die Zahl zu erhalten.
Öffnen Sie nun das Bild, das unter dem roten Kanal aufgenommen wurde und die PI-positiven toten Zellen anzeigt. Öffnen Sie das Zählwerkzeug, und klicken Sie auf jeden der roten Flecken, der die Anzahl der positiven abgestorbenen PI-Zellen angibt. Sobald die Zählung der abgestorbenen Zellen abgeschlossen ist, klicken Sie auf den grünen Kanal erfasste Zellen und öffnen Sie das Zählwerkzeug und klicken Sie auf jeden der grünen Flecken, die die Zellen anzeigen, die die ROS-Generation anzeigen.
Schließen Sie die Zählung der grünen Zellen ab, die unter dem grünen Kanal erfasst wurden, und führen Sie dann die Formel auf, um den Prozentsatz des Zelltodes durch UVC-Schäden und den Prozentsatz der ROS-Produktion durch UVC-Schäden aufzuzählen. Dies wird mit der einfachen Formelzahl der PI-positiven Zellen berechnet, d.h. den roten Fluoreszenzzellen, geteilt durch die Anzahl der Hoechst-positiven Zellen multipliziert mit 100. Der Prozentsatz der ROS-Produktion durch UV-Schäden wird anhand der Formel, Anzahl der DCFDA-positiven oder grünen Fluoreszenzzellen berechnet, dividiert durch die Anzahl der Hoechst-positiven Zellen multipliziert mit 100.
Sobald Sie sowohl die Prozentsätze, d. h. den Prozentsatz des Zelltodes, als auch den Prozentsatz der ROS-Produktion haben, verwenden Sie diese Werte, um ein Balkendiagramm darzustellen. X-Achse gibt die Dosierung von UV an, während y-Achse den Prozentsatz der Zellen angibt. Die grünen Balken geben den Prozentsatz der ROS-Generierung an, während der rote Balken den Prozentsatz des Zelltodes angibt.
Bei der Analyse ist es offensichtlich, dass bei UVC-Dosis 100 Joule gibt es 10%ROS erzeugende Zelle sowie einen 10%Zelltod. Während bei der UVC-Dosis 10 auf drei Joule pro Quadratmeter angehoben wurde, zeigten 70%Zellen die ROS-Generation sowie den Zelltod. Während bei der höchsten Dosis von UVC, das ist 10 auf vier Joule pro Meter Quadrat erhöht, etwa 100%Zellen zeigten Zelltod sowie ROS-Produktion.
Daher kann geschlossen werden, dass es eine starke positive Korrelation zwischen der ROS-Generation und dem Zelltod gibt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Technik sehr praktisch für die gleichzeitige Bewertung von reaktiven Sauerstoffspezies, lebenden und abgestorbenen Zellen in lebender, normaler Ereigniskultur ist. Diese Technik ist auch nützlich für die begrenzte Bewertung von reaktiven Sauerstoffspezies, lebenden und abgestorbenen Zellen, in Langzeitkulturen, die verschiedenen zellschädigenden Mitteln wie ultravioletter Strahlung oder chemischen Mitteln ausgesetzt waren.
Und diese Technik kann auch einen Forscher bei der Bestimmung der optimalen Zeit für die Ernte der Zellen wie 50%ROS, 75%ROS, so und so weiter, wie es für viele nachgeschaltete Anwendungen, wie QR zu PCR und Western Blotting sein kann führen.
