Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Gewebereparatur und Regeneration über die Assoziationen zwischen den zytoprotektive Bahnen, oxidativen Stress, und die Wundheilung Reaktion zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser leistungsstarken Technik ist, dass Sie reaktive Sauerstoffspezies in einer Wunde in Echtzeit messen können, um ihre Auswirkungen auf die Geweberegeneration zu bestimmen. Mit mir wird Jennifer Kwong, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin in meinem Labor, das Verfahren demonstrieren.
Verwenden Sie ein Glukometer, um den Blutzucker jeder anästhesierten acht bis zwölf Wochen alten Diabetikermaus zu messen. Und verwenden Sie einen Haarschneider und Enthaarungscreme, um das rückende Haar vom ersten Tier zu entfernen. Verwenden Sie alkoholtücher zweimal, um die exponierte Haut zu reinigen und drapieren Sie das Tier, so dass nur der chirurgische Bereich ausgesetzt ist.
Wenn der Alkohol getrocknet ist, verwenden Sie sterile 10-Millimeter-Biopsie-Punche, um zwei, 10 Millimeter volle Dickenwunden zu erzeugen, die sich durch den Panniculus-Carnosus nach einer gut etablierten exzisionalen Wundheilungstechnik erstrecken. Verwenden Sie eine 0,5 Millimeter dicke Silikonfolie mit 10 Millimeter kreisförmigen Ausschnitten, um die Wunden zu bestreichen und die Stints mit unterbrochenen 4/0 Seidennähten zu sichern. Dann legen Sie die Mäuse auf ein Heatpad mit Überwachung bis zur vollständigen Genesung, bevor Sie in ihren individuellen Käfig zurückkehren, Papierhandtücher als zusätzliches Nistmaterial für zwei Wochen zur Verfügung stellen.
Am nächsten Tag entweder kontrollieren Sie entweder unsinniges kleines störendes RNA-Gel oder experimentelles kleines störendes Keap1-Gel an der Oberseite der Wunde jedes Tieres und wickeln Sie jeden Oberkörper mit transparentem Filmdressing, um das Gel an Ort und Stelle zu halten, während die Gliedmaßen frei bleiben. Laden Sie am dritten Tag des Experiments eine ein Millimeter spritze mit einer 27-Spur-Nadel mit frisch zubereiteter L-012-Lösung ausgestattet und wickeln Sie die Spritze, um die Lösung vor Licht zu schützen. Um die Wunden abzubilden, entfernen Sie vorsichtig den transparenten Filmverband von jeder der Mäuse, ohne die Wunden zu stören, und legen Sie die Mäuse in die Bildkammer eines Biolumineszenz-Bildgebungssystems.
Stellen Sie den Sauerstoffzufluss des Bildgebungssystems und den Sauerstoffgehalt der Induktionskammer auf einen Liter pro Minute ein und stellen Sie die Mäuse anhand von Biolumineszenz und hellem Feld an der Grundlinie dar. Als nächstes wischen Sie den Bauch mit Alkoholtüchern und injizieren Sie dann fünf Milligramm L-012 Lösung pro 200 Gramm Körpergewicht, IP, in jede Maus, sobald der Alkohol getrocknet ist. Die Injektion der L-012-Lösung, ohne die Wunden auf der Rückenhaut zu stören, ist entscheidend, da jede Verzerrung die Wundheilungsbahn und die Dateninterpretation beeinflusst.
Stellen Sie sicher, dass das Tier vor der Injektion sicher in dorsaler Rekumbency ist. Unmittelbar nach der Injektion legen Sie die Mäuse wieder an ihre jeweiligen Stellen in der Bildkammer und stellen die Tiere alle vier Minuten über einen 60-minütigen Bildzeitraum eine Minute lang dar, indem Sie die 10-Millimeter-Wunde als Interessensbereich für die Bestimmung des Niveaus der reaktiven Sauerstoffspezies definieren. Dann legen Sie die Mäuse auf ein Wärmepolster mit Überwachung bis zur vollständigen Genesung, bevor Sie die Tiere in ihre einzelnen Käfige zurück.
Drei Tage nach der Bildung bilateraler Wunden nach dem etablierten Exzisionswwmodell wird vor der L-012-Injektion keine Biolumineszenz beobachtet. Nach intraperintonealer L-012-Lösungsinjektion wird die Biolumineszenz in den Bereichen der Wunde beobachtet, in denen reaktive Sauerstoffspezies nachgewiesen werden. Die Aufzeichnung der Biolumineszenz für eine Minute alle vier bis fünf Minuten im Laufe von 60 Minuten zeigt die biolumineszierende Sättigung der Region von Interesse im Laufe der Zeit, mit der optimalen Bildgebungszeit, um eine vollständige L-012-Sättigung zu erreichen, die bei etwa 50 Minuten beobachtet wird.
Die Biolumineszenz in jeder Wundregion von Interesse vor und nach der L-012-Injektion in unsinnige kleine interferierende RNA behandelte oder Keap1 kleine interferierende RNA behandelte Mäuse kann dann berechnet werden, indem die Gesamtzahl der Lichtintensität durch das Gebiet dividiert wird. Die Analyse von Wundgewebeabschnitten des Tages 10 zur Bestätigung der Genauigkeit der Messung des Niveaus der reaktiven Sauerstoffspezies durch H&E-Färbung zeigt eine reduzierte zelluläre Infiltration in kleine, von Keap1 behandelte Wunden im Vergleich zu kleinen störenden, unsinnig behandelten Geweben, was auf eine reduzierte entzündliche Morphologie bei den experimentellen gelbehandelten Tieren hindeutet. Die Analyse der Immunreaktivität von F4/80, einem Protein-Makrophagenmarker auf Wundgewebeabschnitten, zeigt eine reduzierte Anzahl von Makrophagen in kleinen, von Keap1 behandelten Wunden im Vergleich zu kleinen störenden, unsinnig behandelten Wunden, was die Gültigkeit dieser Methode weiter unterstreicht.
Stellen Sie beim Versuch dieses Verfahrens sicher, dass die L-012 nicht abgelaufen ist, und rühren Sie die Lösung an einem lichtgeschützten Ort. Nach diesem Verfahren können gezielte Sonden und immun-assaybasierte Methoden verwendet werden, um die subzelluläre Lokalisierung von reaktiven Sauerstoffspezies und deren Korrelationen zu untersuchen, was eine schnelle Bewertung von Interventionen und Mechanismen ermöglicht, die die Redux-Statistiken von Wunden beeinflussen.
