Name: genetic and biochemical approaches for in vivo and in vitro assessment of protein oligomerization: the ryanodine receptor case study
Uploaded: 2016-07-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
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Die Autoren haben nichts zu erklären.

Die Bildung von Protein Homooligomere ist ein fundamentaler biologischer Prozess, der die Aktivität von Transkriptionsfaktoren, Enzyme, Rezeptoren , Ionenkanäle und 25,26 reguliert. Wichtig ist , daß Protein Oligomerisierung auch pathologische Folgen einschließlich Neurodegeneration und arrhythmogenic Herzerkrankung 4,27. Die Methoden in diesem Artikel beschrieben werden verwendet, um Domain-Domain Wechselwirkungen Vermittlung von Protein-Selbstassoziation und Oligomerisierung zu identifizieren. Im Folgenden zeigen wir wichtige Schritte innerhalb jedes Protokoll, und wir diskutieren wichtige Überlegungen, Einschränkungen und Fehlersuche. Das Y2H System kann zuerst verwendet werden, um potentielle Interacting Protein Partner zu screenen wegen seiner relativ hohen Durchsatzscreening, Benutzerfreundlichkeit und sehr gut reproduzierbare Ergebnisse. Y2H Verfahren werden in einem mikrobiologischen Labor mit Standard (Platte oder Shaker) Inkubatoren und Raum ausgestattet nach den Richtlinien durchgeführt. Die Verwendung von freshly hergestellten kompetenten Zellen (Schritt 1.1.8), ist entscheidend für eine hohe Effizienz Hefetransformation, wohingegen für die besten Ergebnisse in β-Gal-Assays frisch Hefekolonien gezüchtet (bis zu 5 Tage alt) sollte (Schritt 1.2.3) verwendet werden. Systeme auf Basis von Transkriptionsfaktoren als GAL4 und / oder zusätzliche / alternative Reportergene vorhanden sind, und daher Bait und Prey-Plasmiden sollte mit dem entsprechenden Y2H Belastung angepasst werden. Einige Stämme sollten in Gegenwart von 3-Amino-1,2,4-triazol, einem kompetitiven Inhibitor des HIS3 - Protein kultiviert werden, um jede konstitutive Expression des HIS3 - Reportergen 7,8 zu quenchen. Die Expression von Köder und Zielfusionsproteine ​​sollten durch Immunoblotting 17 überprüft werden. Im Falle Köder / Beute-Fusionsproteine ​​toxisch sind Hefe, niedrigere tolerierbar Proteinspiegel durch Klonierung in verschiedenen Vektoren erreicht werden könnte, wo Köder / Beute-Expression durch einen anderen Promotor angetrieben wird. Ferner ist es wesentlich, t, um sicherzustellen,Hut Köder / Beute-Fusionsproteine ​​zeigen keine autonome Aktivität des Reportergens. Autonome Reportergenaktivierung kann durch Modifikation des Konstrukts gerettet werden, um die verantwortliche Region zu entfernen, oder durch die GAL4 DNA-BD und AD-Fusionen für die beiden getesteten Proteine ​​tauschen. Darüber hinaus sind Domänen Trans besser aus Köder / Beute-Konstrukte weggelassen, weil sie Fehlfaltungen oder Fehllokalisation von Fusionsproteinen in intrazellulären Membrankompartimente induzieren kann. Tatsächlich ist der größte Nachteil des Y2H System , dass die Köder und Zielproteine ​​in der Hefe Zellkern lokalisiert sind weg von ihren physiologischen subzellulären Ort und möglicherweise spezifische post-translationale Modifikationen fehlen, was zu falsch-positiven oder falsch-negative Wechselwirkungen 6-9 . Mammalian heterologe Expressionssysteme sind besser geeignet für die Untersuchung von Säugetier integrale Membranproteine ​​in Bezug auf die Konformation, post-translationale Modifikationen und subzelluläre Lokalisierung.Eines der am häufigsten verwendeten Zell Transfektionsverfahren ist die Calciumphosphat - Präzipitation, vor allem wegen der Mindestausrüstung und Reagenzien erforderlich 11,15. Alternative Methoden, nämlich die Elektroporation, Liposomen, kationische Lipide und Polymere ergeben können höhere Transfektionseffizienz auf der Zelllinie abhängig und gebrauchte konstruieren. Im Allgemeinen sind die primären Faktoren Transfektionseffizienz beeinflussen Plasmid-DNA Qualität und Zellgesundheit / Lebensfähigkeit. Die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn Plasmid-DNA von höchster Reinheit (260 nm / 280 nm-Absorptionsverhältnis von ~ 1,8) und sich aktiv teilende Zellen verwendet werden. Die Zellen sollten daher nicht mehr als 60 transfiziert werden - 70% Konfluenz (Schritt 2.1.2), da die Fähigkeit zur Oberfläche der Zelle zu dem Medium 11 ausgesetzt zusammenhängt Fremd - DNA aufzunehmen. Zusätzlich Einschluss von Antibiotika in das Kulturmedium während der Transfektion (Schritt 2.1.3) nicht aufgrund der erhöhten Zelltod 15 geraten. Foder Fällung Calciumphosphat insbesondere eine sorgfältige Vorbereitung und pH-Einstellung (auf 7,05 genau) der 2x HBS-Lösung (Schritt 2.1.1) und die korrekte Bildung von Plasmid-DNA / Calcium / Phosphat-Komplexe durch kräftiges Mischen (Schritt 2.1.5) sind wichtige Schritte für eine hohe Effizienz der Transfektion. Typischerweise Proteinexpression durch transiente Transfektion Spitzen innerhalb 24 - 72 Stunden. Sobald die Zellen geerntet werden, müssen nachfolgende Verfahren bei 4 ° C durchgeführt werden, um die Proteaseaktivität zu minimieren, und die Zugabe von Proteaseinhibitoren zu empfehlen ist. Zell Homogenisierung sollte durch einen Zentrifugationsschritt folgen Kerne zu entfernen, weil chromosomale DNA kann die Lösungsviskosität erhöhen und die nicht-spezifische Bindung. Somit Homogenisierung durch mechanische Mittel in einer iso-osmotischen Puffer ist bevorzugt, in der Regel in (0,3 M) Sucrose oder (150 mM) NaCl. Im allgemeinen werden bekannte Saccharose-basierten Puffern Proteinstabilität zu verbessern und potenzielle nicht-native Proteinaggregation vermindern, aber aufgrund preferentiellen Hydratation auf der Proteinoberfläche werden elektrostatische Protein-Protein-Wechselwirkungen begünstigt. Umgekehrt Salzbasis Puffer beeinflussen die Nettoladung der geladenen Aminosäure-Seitengruppen auf der Proteinoberfläche, wodurch eine Vorspannung 28 hydrophoben Wechselwirkungen basierenden Richtung mehr. Co-IP ist das am häufigsten eingesetzte biochemische Assays Protein-Protein-Wechselwirkungen insbesondere von nativem Gewebe zu beurteilen. Sein Hauptnachteil ist die Voraussetzung für hochspezifisch für den Einsatz validierter Antikörper in IP und Immunoblotting 10,16,18. So werden häufig rekombinante Proteine ​​mit einem Peptid - Epitop markiert, z. B. Influenza - Hämagglutinin (YPYDVPDYA) oder menschliche cMyc (EQKLISEEDL), für den hochaffinen spezifischen Antikörpern sind kommerziell erhältlich. Falls gewünscht, kann die Immunpräzipitation Antikörper chemisch an die Protein-A-Harz, konjugiert werden, um seine Elution und Detektion während des Immunoblotting Stufe zu vermeiden, die die co-ausgefällten pr verdunkelnotein 16; Um dies zu erreichen, haben wir erfolgreich den chemischen Vernetzer 3,3&#39;-Dithiobis (sulfosuccinimidylpropionat) 24 verwendet. Es ist zwingend notwendig, dass ein geeignetes Detergens in dem Puffer IP enthalten ist und das unlösliche Material von homogenisierten Zellen durch Zentrifugieren entfernt wird, nicht-spezifische Bindung (Schritt 3.1.3) zu minimieren. Die Wahl und Konzentration des Detergens sind wichtige Überlegungen: stärkere Detergenzien und / oder höhere Konzentrationen werden im wesentlichen nicht-spezifische Verringerung Bindung kann aber auch X abschaffen: Y Protein-Wechselwirkung, wohingegen geringere Konzentrationen oder milder Detergentien können eine schwache Wechselwirkung ermöglichen beobachtet werden, sondern kann führen zu hohen unspezifischen Bindung. Zwischenfestigkeit Detergenzien sind bevorzugt, beispielsweise Triton X-100 bei 0,5 -. 1% Konzentration. Weiter zu reduzieren , nicht-spezifische Bindung, ein neutrales Protein (beispielsweise Rinderserumalbumin bei 100 ug / ml) in dem IP - Puffer enthalten sein, und / oder das Zelllysat kann vorge cleare werdend vorheriger Inkubation mit Protein-A-Harz allein. Y Paar getestet, typischerweise drei 10-minütiges Waschen mit IP-Puffer (Schritt 3.1.9): Die Anzahl der Wäschen sollte für die X optimiert werden. In jedem Fall ist ein Co-IP Probe mit nicht-immunem IgG als Immunpräzipitation Antikörper sollte immer parallel verarbeitet werden, als Negativkontrolle (Schritt 3.1.6) zu dienen. Der Hauptvorteil der chemischen Vernetzung ist, dass es auf die stöchiometrische Zusammensetzung des Proteins Homooligomer informiert. Glutaraldehyd ist eine häufig verwendete Vernetzer , weil es keine spezielle Ausrüstung erfordert und erzeugt thermisch und chemisch stabile Vernetzungen zwischen interagierenden Proteinen 19,20. Verbindungen mit freien Aminogruppen sollte von Assay-Puffer (Schritt 3.2.1) weggelassen werden, da sie die chemische Reaktion auslöschen wird. Glutaraldehyd-Konzentration und Reaktionszeit (Schritt 3.2.4) sollte für die oligomeren Proteinkomplex von Interesse optimiert werden. Der Hauptnachteil dieser Technik especiVerbündeter, wenn auf ganze Zellpräparaten durchgeführt wird, ist die nicht-Spezifität der chemischen Reaktion, die künstliche Proteinaggregate ergeben könnte, die biologische Bedeutung fehlt. Alternative in vivo (z. B. Fluoreszenz - Resonanz - Energie - Transfer, bi-molekulare Fluoreszenz oder Lumineszenz Komplementierung) und in - vitro - Techniken (z. B. Größenausschlusschromatographie, analytische Ultrazentrifugation, isothermen Titrationskalorimetrie) zur Charakterisierung der Selbstassoziation und Beurteilung Protein zur Verfügung stehen Oligomerisie- Stöchiometrie 29,30. Jedes Verfahren hat seine eigenen Vorteile und Nachteile, und es kann besser geeignet für die Untersuchung eines spezifischen Proteins auf Proteinreinigung / Stabilität und Ausrüstung / Reagenz Verfügbarkeit abhängig sein. Die drei komplementären hier beschriebenen Verfahren im Detail, nämlich Y2H, Co-IP und Vernetzung wurden in Kombination verwendet worden zwingende Beweise für RyR2 homo-oligome bereitzustellenr Bildung in Isolation und innerhalb einer lebenden Zelle.

Skelett- und Herzmuskelkontraktion wird durch Retikulum Ca 2+ Freisetzung vermittelt durch RyR ausgelöst. Es gibt drei Säugetier RyR Isoformen mit dem Funktionskanal aus vier identischen Untereinheiten zusammengesetzt. Jede RyR Untereinheit besteht aus einer großen zytoplasmatischen regulatorischen N-terminalen Teil und einem kleinen C-terminalen Teil der Transmembran - Domänen enthält , die einen hohen Leitwert Ca 2+ Pore bilden. Abnormale intra- und interUnterEinheit Wechselwirkungen zu Grunde liegen RyR Kanalstörungen und führen zu einer neuromuskulären und Herzerkrankungen 1. Die Identifizierung und Charakterisierung von spezifischen Bereichen beteiligt in RyR Struktur: Funktionsbeziehung ist daher von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Pathophysiologie RyR. Traditionelle biochemische Protein-Protein-Interaktionstechniken erfordern beträchtliche Mengen an gereinigtem Protein, oft in Bakterien produziert. Dies ist nicht möglich, in dem Fall der RyR, eine sehr große Membran protein von ~ 5000 Aminosäuren besteht, während seine rekombinante Fragmente nicht leicht zugänglich für die bakterielle Expression und Reinigung sind. So alternative Expressionssysteme eukaryotischen Wirtszellen beteiligt sind für Säuger integrale Membranproteine ​​erforderlich. Wir haben zuvor Y2H, Co-IP und Vernetzungsassays eingesetzt kollektiv zu zeigen , dass N-Terminus Tetramerisierung ein strukturelles Merkmal, das in den drei Säugetier RyR 2,3 - Isoformen konserviert ist. Wichtig haben, wir , dass eine einzelne Punktmutation mit arrhythmogenic Herzkrankheit stört N-Terminus Selbstassoziation und die Ergebnisse in einer dysfunktionalen RyR Kanal 4 assoziiert gefunden. Wir haben auch diese Techniken Oligomerisierung Untersuchungen der RyR zytoplasmatischen C-terminal tail 5 sowie den N-Terminus des homologe intrazellulären Ca 2+ -Freisetzung Kanal angewendet, der Inositol - 1,4,5 triphosphat Rezeptor 2. Im Y2H-Assay wird die interactiauf zwischen zwei Proteinen (X und Y) durch die Rekonstitution eines funktionellen Transkriptionsfaktors (GAL4) und der anschließenden Aktivierung von Reportergenen 6-9 gemessen. Zwei verschiedene Klonierungsvektoren verwendet Fusionen der beiden getesteten Proteine ​​mit den zwei physikalisch trennbaren unabhängigen Domänen von GAL4 zu generieren: DNA-bindenden Domäne (DNA-BD) / Protein X-Fusions (bait) und Aktivierungsdomäne (AD) / Protein Y Fusions (Ziel). Die Y2H kann verwendet werden, um zu testen, ob ein Protein mit sich selbst in Wechselwirkung von GAL4 DNA-BD und AD-Fusionen des gleichen Proteins zu erzeugen. Gentechnisch veränderte Y2H Stämme sind GAL4 und GAL80 - defizienten (das GAL80 - Protein ist ein Repressor der GAL4) sowie TRP1 und LEU2 - defizienten (Ernährungs Auswahl für Köder und Beute Plasmide zur Verfügung zu stellen, beziehungsweise). In der Hefe Kern werden die rekombinanten DNA-BD und AD-Peptide in enge physische Nähe brachte einen Hybrid-GAL4-Transkriptionsfaktor zu erzeugen, nur durch ihre Fusionen &#39;X: Y interaction. Dieser Ansatz ermöglicht eine schnelle genetische Screening von Protein-Protein - Wechselwirkungen durch die parallel Transkriptionsaktivierung von prototrophen (HIS3 - Codierung für ein Enzym , die für Histidin - Biosynthese) und chromogenem (LacZ - Codierung für β-Galactosidase (β-Gal)) Reportergene zu detektieren. Der Hauptvorteil des Y2H ist , dass es ein in vivo Assay, der sogar schwach oder transiente Protein-Protein - Interaktionen detektiert. Darüber hinaus beinhaltet die einfache Detektion Verwendung von Wachstumsselektion (in Medium ohne Histidin) oder eines kolorimetrischen (β-Gal) Assay ohne die Notwendigkeit zur Reinigung der Köder und Zielproteine ​​oder die Erzeugung von spezifischen Antikörpern. Zusätzlich kann die Y2H verwendet werden, um eine Sammlung von zufälligen unbekannte Klone (cDNA-Bibliothek-Klone zu GAL4 AD fusioniert) zu screenen für neuartige Bindungspartner eines Köderprotein, auch einen direkten Zugang zu der cDNA der Bibliothek Protein geben. Um die Y2H Beobachtungen erstrecken, independent biochemischen Techniken können eingesetzt werden. Co-IP und Vernetzungsassays mit Immunoblotting kombiniert werden Verfahren verwendet , um Protein - Assoziationen in komplexen Probengemische erfassen, z. B., Ganzzelllysaten 10. Ihr Hauptvorteil ist, dass sie berichten über Protein-Protein-Wechselwirkungen von nativem Gewebe, im Gegensatz zu anderen Verfahren, die die Verwendung von rekombinanten Proteinen erforderlich. Rekombinante Proteine ​​können auch verwendet werden, typischerweise in einer Säugerzelllinie exprimiert wird, wo sie wahrscheinlich ihre korrekte Konformation und post-translationale Modifikationen aufweisen, sowie subzelluläre Lokalisierung. Da jedoch Co-IP und Vernetzung sind in vitro - Assays Verwendung von homogenisierten Zellen machen, ist es notwendig , zu bestätigen , ob die zwei Proteinpartnern in der intakten Zelle 11 co-lokalisiert sind. Wir verwenden routinemäßig Transfektion von Säuger HEK293 Zellen , die transient Säugetier integrale Membran und cytosolische Proteine ​​zu exprimieren unter Verwendung des Calciumphosphat - Fällungsverfahren 2-4,12-14, Beschrieben hier im Detail. Dies ist eine kostengünstige Möglichkeit , um effizient die Plasmid - DNA in Zellen zu liefern , aber es ist abhängig von der jeweiligen Zelllinie verwendet und Zellkonfluenz sowie die Reinheit der Plasmid DNA 11,15. Der Co-IP - Test umfasst die Isolierung des nativen oder rekombinanten Proteins von Interesse aus den Zelllysaten unter nicht-denaturierenden Bedingungen ermöglicht die gleichzeitige Reinigung von vermeintlichen Interaktionspartner 10,16. Es erfordert die Verwendung von zwei unabhängigen Antikörper, die Immunpräzipitation Antikörper zur Isolierung von Protein X und dem Immunoblotting-Antikörper zur Detektion von Proteinpartner Y. es verwendet werden kann, um zu testen, ob ein Protein mit sich selbst durch Erzeugen von zwei verschiedenen Fusionen mit zwei verschiedenen Epitop interagiert Tags (z. B. HA und cMyc). Der Immunopräzipitieren Antikörper wird durch die Fc-Region auf Protein-A gebunden (oder Protein-G, von der Tierart ab, in dem der Antikörper erhöht wurde), diean Agarose (Sepharose oder Harz) konjugiert. Protein-A-Harz nach Inkubation mit dem Zelllysat, nämlich die detergenslöslichen Fraktion von homogenisiertem Zellen: Protein X wird durch den Antikörper präzipitiert. Protein Immunkomplexe eluiert mit SDS-haltigem Puffer und anschließend durch SDS-PAGE analysiert und Immunblotting unter Verwendung eines Antikörpers das Vorhandensein von Protein 17 Y zu detektieren. Co-IP sollte mit detergenslöslichen Proteinen durchgeführt werden, um übermäßige unspezifische Bindung zu vermeiden. Y pair 10,16,18: Die Wahl des Waschmittels und dessen Konzentration, sowie die Anzahl der Waschungen, sollte für jeden X optimiert werden. Vernetzung wird verwendet, um die Stöchiometrie des oligomeren Proteinkomplexes zu bestimmen. Es basiert auf einer chemischen Reaktion basiert auf kovalenten Bindungen zwischen benachbarten zusammenwirkenden Protomere erzeugen und es daher ermöglicht, die Erhaltung des oligomeren Status des Proteins während der SDS-PAGE-Trennung. Es gibt zahlreiche Vernetzungs reagents verschiedener Längen und Chemie verschiedene reaktive Gruppen auf Proteinen, die typischerweise primäre Amine, Carboxyl- oder Thiolgruppen Targeting. Hier beschreiben wir die Verwendung von Glutaraldehyd (OHC (CH 2) 3 CHO), ein homo-bifunktionelle Vernetzer mit zwei Aldehydgruppen an beiden Enden , die mit freien Aminogruppen in Lysinresten 19,20 reagieren. Vernetzung wird in einer konzentrations- und zeitabhängigen Weise, gefolgt in Adduktbildung führt. Glutaraldehyd Reaktion mit Hydrazin (H 2 NNH 2) und Proteinproben gestoppt werden dann durch SDS-PAGE analysiert und 17 Immunoblotting ihre Oligomerisierungszustand zu bewerten. Wir sollten diese Vernetzung beachten Sie keine Oligomerisierung induzieren, sondern lediglich schafft stabile Brücken zwischen bereits bestehenden Proteinkomplexen. Wichtige Überlegungen bei der Vernetzungs Durchführung von Experimenten sind die Wahl der Vernetzer, seine Konzentration und Reaktionszeit 19,20.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;PART 1 yeast two-hybrid&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plate incubator</td><td>Hereaus</td><td>B6120</td><td>Used at 30 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Orbital shaker incubator</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>INNOVA 4300</td><td>Used at 30 &amp;deg;C with shaking at 230 - 250 rpm</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Perkin Elmer</td><td>Lambda Bio+</td><td>To measure OD&lt;sub&gt;600&lt;/sub&gt; of yeast culture; to measure Absorbance at 420 nm in liquid b-Gal assay</td></tr><tr><td>Matchmaker Two-Hybrid System 2 Kit</td><td>Takara Clontech</td><td>K1604-1</td><td>Contains bait vector pGBKT7, prey vector pACT2&amp;nbsp; and yeast strain Y190&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0626</td><td>To prepare minimal SD growh medium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dropout supplement lacking leucine and tryptophan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0750</td><td>To prepare minimal SD growh medium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dropout supplement lacking leucine, tryptophan, histidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2001</td><td>To prepare minimal SD growh medium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Herring testes carrier DNA&amp;nbsp;</td><td>Takara Clontech</td><td>630440</td><td>For yeast transformation</td></tr><tr><td>Whatman filter paper Grade 5&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1005070</td><td>for use in colony-lift filter paper b-Gal assay</td></tr><tr><td>X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&amp;beta;-D-galactopyranoside)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td>for use in colony-lift filter paper b-Gal assay</td></tr><tr><td>ONPG (o-nitrophenyl-&amp;beta;-D-galactopyranoside)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1127</td><td>for use in liquid b-Gal assay</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;PART 2. Protein expression in a mammalian cell line&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293 cell line</td><td>ATCC</td><td>ATCC&amp;reg;&amp;nbsp;CRL-1573&amp;trade;</td><td></td></tr><tr><td>Humidified incubator (5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 37 &amp;deg;C)</td><td>SANYO</td><td>MCO-18AIC</td><td>To culture mammalian cells</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s medium)</td><td>Invitrogen (ThermoFisher)</td><td>41966</td><td>To prepare growth medium for mammalian cells</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Invitrogen (ThermoFisher)</td><td>10500</td><td>To prepare growth medium for mammalian cells</td></tr><tr><td>Glass beads</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td>To homogenise cells</td></tr><tr><td>Needle 23 G (0.6 x 30 mm)</td><td>BD Microlance</td><td>300700</td><td>To homogenise cells</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail (Complete)&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11873508001</td><td>To prevent proteolysis</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;PART 3. In vitro biochemical methods&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell (SDS-PAGE system)</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000EDU&amp;nbsp;</td><td>For polyacrylamide gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Trans-Blot SD (Semi-dry transfer system)</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td>For electrophoretic transfer</td></tr><tr><td>Compact X-ray film processor</td><td>Xograph</td><td>X4</td><td>For use in immunoblotting</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td>For use in chemical cross-linking</td></tr><tr><td>Protein-A sepharose beads&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5280-01&amp;nbsp;</td><td>For use in co-IP assay</td></tr><tr><td>Anti-HA (Y-11 rabbit polyclonal IgG)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-805</td><td>For use in co-IP assay</td></tr><tr><td>Non-immune rabbit IgG</td><td>Santa Cruz Biotechnology&amp;nbsp;</td><td>sc-2027</td><td>For use in co-IP assay</td></tr><tr><td>Anti-cMyc (9E10 mouse monoclonal IgG)</td><td>Santa Cruz Biotechnology&amp;nbsp;</td><td>sc-40</td><td>For use in immunoblotting</td></tr><tr><td>Anti-HA (16B12 mouse monoclonal IgG)</td><td>Covance</td><td>MMS-101P</td><td>For use in immunoblotting</td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG-HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td><td>For use in immunoblotting</td></tr><tr><td>Hyperfilm ECL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28906836</td><td>For use in immunoblotting</td></tr><tr><td>ECL Western Blotting Substrate</td><td>Pierce (ThermoFisher)</td><td>32106</td><td>For use in immunoblotting</td></tr></tbody></table>

genetic and biochemical approaches for in vivo and in vitro assessment of protein oligomerization: the ryanodine receptor case study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Im Y2H System der Köder: Beute - Interaktion wird anfänglich durch das Wachstum der Hefe in Medium ohne Selektion (Tryptophan, Leucin und) Histidin und anschließend beurteilt durch β-Gal enzymatische Aktivitätstests (Figur 1) getestet. Hefe in Medium ohne Histidin hat langsame Wachstumsrate, die auf der Stärke des Köders hängt: Prey-Protein-Interaktion. Die β-Gal-Assay wird in Hefe durchgeführt (kultiviert in Medium ohne Tryptophan und Leucin nur) entweder wachsen auf festen Träger (Agarplatten) oder in Flüssigkultur, wobei letztere Nachgeben quantitative Ergebnisse. Wir haben erfolgreich die Y2H zu identifizieren domain-Domäne Wechselwirkungen innerhalb der RyR2 sowie neuartige Proteinpartner 2-4,12,21,22 verwendet. Beispielsweise gescreent wir eine Reihe von Konstrukten überlappend über die gesamte Länge des RyR2 Peptidsequenz für die Wechselwirkung mit einem N-terminalen Fragment überspannt (AD4L: RyR2 Reste 1-906 mit GAL4 AD fusioniert). 3 Kolonie-Lift - Filterpapier β-Gal Assays erzeugt lebendige blau-gefärbten Hefekolonien nur für die BT4L: AD4L Paar (2A), die zeigen , dass AD4L mit sich selbst in Wechselwirkung tritt, nämlich die BT4L konstruieren (RyR2 Reste 1-906 fusioniert mit GAL4 DNA-BD). Blasse blaue Kolonien wurden für die BT8 erkannt: AD4L Paar eine sekundäre schwächere Assoziation mit der extremen C-terminalen Domäne (BT8) darauf hindeutet, während Hefe co-transformiert mit einem anderen Konstrukt blieb weiß und daher negativ für Köder: Prey-Protein-Interaktion. Quantitative Ergebnisse, erhalten durch Flüssig β-Gal - Assays (2B), robust BT4L angegeben: AD4L Wechselwirkung äquivalente Festigkeit zu der bekannten Assoziation zwischen dem p53 Protein (PVA3) und SV40 large T - Antigen (pTD1), während die BT8: AD4L Wechselwirkung deutlich schwächer war (&lt;10% im Vergleich zur Kontrolle). Wir führen routinemßig aus Co-IP Experimenten (Figur 3) ftransiente Expression in einer Säugerzelllinie (HEK293) ach als unabhängige biochemische Assays die Y2H Erkenntnisse 2-4,12-14,21-24 zu verstärken. RyR2 N-Terminus Selbst Interaktion, zwei getrennte Plasmide kodieren für RyR2 Reste 1 Um zu überprüfen - 906 markiert mit entweder der cMyc oder HA-Peptid-Epitop (BT4L und AD4L, jeweils) waren cotransfiziert in HEK293-Zellen unter Verwendung des Calciumphosphat-Fällungsverfahren 3. Die post-nukleären Fraktion von homogenisiertem Zellen wurde mit dem Detergens CHAPS solubilisiert, und das unlösliche Material durch Zentrifugation entfernt wurde das Zell-Lysat zu erzeugen. Das Zelllysat, mit dem Reduktionsmittel Dithiothreitol behandelt wird , wurde dann mit Ab HA und Protein-A - Sepharose - Kügelchen inkubiert HA-markiertes AD4L zu immunpräzipitieren. Co-IP - Proben, Elution mit SDS-Puffer, wurden auf zwei getrennten Gelen SDS-PAGE geladen (1/10 und 9/10 th split) und analysiert durch Immunoblotting mit Ab HA und Ab cMyc, respectively. Erfolgreiche direkte IP von AD4L (~ 100 kDa) durch Ab HA wurde durch Immunoblotting nachgewiesen, aber nicht in der Negativkontrolle unter Verwendung von nicht-immunen Kaninchen IgG (4A). Wichtig ist , dass nur in der Ab HA IP gewonnen cMyc-tagged BT4L (~ 100 kDa) und nicht in der negativen Kontrolle in Abwesenheit von immunpräzipitierten AD4L (4B). Y2H und Co-IP-Assays bereitgestellt timmende Beweise für RyR2 N-Terminus selbst Wechselwirkung, aber sie haben auf der Oligomerisierung Status der N-terminalen Domäne nicht informieren, nämlich ob sie nur Dimere oder höhere Komplexe bildet. Es sollte beachtet werden, dass Komplexe dissoziiert und nur die Untereinheiten umfasst, wird durch SDS-PAGE nachgewiesen werden wegen SDS- und wärmeinduzierte Denaturierung von Proteinen Protein-Protein-Wechselwirkungen aufzuheben. Um dies zu überwinden, verwenden wir eine Vernetzung (Abbildung 5) , die chemisch stabil und vorbestehenden protei docktn - Oligomere, deren Molekularmasse kann dann 2-5 durch SDS-PAGE Größentrennung untersucht werden. Zum Beispiel Homogenat HEK293 Zellen exprimiert cMyc-BT4L, mit dem Reduktionsmittel Dithiothreitol behandelt wurde mit Glutaraldehyd und analysiert durch SDS-PAGE und Immunoblotting unter Verwendung von Ab cMyc (Abbildung 6) umgesetzt. Zusätzlich zu dem Monomer (~ 100 kDa), ein hochmolekulares Proteinbande von ~ 400 kDa wurde in einer zeitabhängigen Weise detektiert, was darauf hinweist RyR2 N-Terminus Tetramerbildung 3. Bemerkenswerterweise war Tetramer die vorherrschenden oligomeren Spezies, mit minimalen Dimer und Trimer beobachteten Banden. Um seine scheinbare Molekularmasse bestimmen, wurde das Oligomer BT4L getrennt durch 4-15% Gradienten - SDS-PAGE - Gelen 3. Wir produzierten die Molekularmasse / Gel-Retardation-Standardkurve unter Verwendung von Proteinstandards mit einem Bereich von 30 bis 460 kDa, und wir das Oligomer berechnet werden 358 kDa 15 (n = 4). Diese scheinbare Molekularmasse steht im Einklang mit einem BT4L Tetramer in a angeordnetgeschlossenen Kreismode statt in linearer Form, wie aus der Anordnung der vier Untereinheiten innerhalb der nativen Kanal RyR2 erwartet. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig1.jpg" /> Abbildung 1. Y2H Flussdiagramm. Hefe, co-transformiert mit Köder und Ziel Plasmide, wird für das Wachstum in Medium ohne Histidin ausgewählt und / oder für β-Gal enzymatische Aktivität getestet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig2.jpg" /> Abbildung 2. Y2H Schlägt RyR2 N-Terminus Domain Self-Interaktion. (A) Schematische Darstellung der (Köder) Reihe von menschlichen RyR2 überlappende Protein getestet Fragmente im Y2H System für<html> Interaktion mit dem RyR2 N-terminalen AD4L (Beute) Konstrukt. &quot;-&quot; Für negative Wechselwirkung (B) Quantitative Flüssigkeit β-Gal - Tests gegen die positive Kontrolle normiert (PVA3 kodiert für GAL4 DNA-BD. Qualitative Ergebnisse , die durch Kolonie-Lift - Filterpapier β-Gal Assays sind in &quot;+&quot; Multiples oder angezeigt Fusion mit p53-Protein; pTD1 kodiert für GAL4 AD Fusion mit SV40 large T-Antigen). Geändert von 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig3.jpg" /> Abbildung 3. Co-IP Flussdiagramm. Säugerzellen co-transfiziert mit Plasmiden , X und Y, werden homogenisiert und Detergens-solubilisierten das Zelllysat in dem Co-IP - Assay, gefolgt von SDS-PAGE und Immunoblotting verwendet erzeugen.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig4.jpg" /> Abbildung 4. Co-IP Zeigt RyR2 N-Terminus Domain Self-Interaktion in Mammalian Cells. HEK293 - Zellen wurden kotransfiziert für transiente Coexpression cMyc-tagged (BT4L) und HA-markiertes (AD4L) RyR2 N-Terminus - Domäne ( Reste 1-906). AD4L wurde mit Ab HA von CHAPS-solubilisierte und Dithiothreit-behandelten Lysats HEK293 immunpräzipitiert, wohingegen als negative Kontrolle, Co-IP - Assays wurden mit nicht-immunem Kaninchen - IgG durchgeführt. Immunpräzipitierten Proteine ​​wurden für 5 min bei 85 ° C erhitzt und bei 20 mA für 3 Stunden durch getrennte 6% SDS-PAGE - Gele geladen mit 1/10 oder 9/10 th von IP Proben gelöst. Nach Proteintransfer bei 80 V für 2 h auf polyvinylidene difluoride Membran wurde Immunoblotting - Analyse durchgeführt unter Verwendung von (1: 1000 Verdünnung) Ab HA (A) oder Ab cMyc (B) verbunden sind, gefolgt von Meerrettich - Peroxidase-konjugiertem anti-Maus - IgG (1: 10000 Verdünnung) und verstärkte Chemilumineszenz Detektions (1 min Exposition). Ein Aliquot des Zelllysats, 1/50 des Volumens in IP - Proben verarbeitet, wurde auch als Molekularmassenstandard dienen enthalten. Geändert von 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig5.jpg" /> Abbildung 5. Vernetzungsflussdiagramm. Mammalian Zellen, die mit Plasmid X transfiziert werden homogenisiert und einer Reaktion mit Glutaraldehyd im Vernetzungs Assay, gefolgt von SDS-PAGE und Immunoblotting. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig6.jpg" /> Abbildung 6. Die Vernetzung Zeigt RyR2 N-Terminus Domain Tetramerbildung HEK293 - Zellen für die transiente Expression von transfizierten wurden cMyc-markierte (BT4L) RyR2 N-Terminus - Domäne (Reste 1-906).. Zellhomogenisat, mit dem Reduktionsmittel Dithiothreitol behandelt wurde mit Glutaraldehyd für den angegebenen Zeitpunkten inkubiert. Proben wurden 5 min bei 85 ° C erhitzt und durch SDS-PAGE (6% Gel) bei 20 mA für 3 h gelöst. Folgende Proteintransfer bei 80 V für 2 h auf Polyvinylidendifluorid-Membran wurde Immunoblotting - Analyse durchgeführt unter Verwendung von (1: 1000 Verdünnung) Ab cMyc, gefolgt von Meerrettich - Peroxidase-konjugiertem anti-Maus - IgG (1:10.000 Verdünnung) und verbesserte Chemolumineszenznachweise (1 min Exposition). Monomer (M: ~ 100 kDa) und tetrameren (T) Formen sind durch die Pfeile angedeutet ist. Geändert von 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig6large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Genetische und biochemische Ansätze für<em&gt; In Vivo</em&gt; und<em&gt; In Vitro</em&gt; Beurteilung von Protein Oligomerisierung: Der Ryanodinrezeptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

11.4K Aufrufe.  Cardiff University School of Medicine, College of Biomedical and Life Sciences. Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Serie: Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. However, there is still little information about how insoluble protein aggregates exert their toxic effects in vivo. Simple prokaryotic and eukaryotic model organisms, such as bacteria and yeast, have contributed significantly to our present understanding of the mechanisms behind the intracellular amyloid formation, aggregates propagation, and toxicity. In this protocol, the use of yeast is described as a model to dissect the relationship between the formation of protein aggregates and their impact on cellular oxidative stress. The method combines the detection of the intracellular soluble/aggregated state of an amyloidogenic protein with the quantification of the cellular oxidative damage resulting from its expression using flow cytometry (FC). This approach is simple, fast, and quantitative. The study illustrates the technique by correlating the cellular oxidative stress caused by a large set of amyloid-&#946; peptide variants with their respective intrinsic aggregation propensities.

Protein aggregation elicits cellular oxidative stress. This protocol describes a method for monitoring the intracellular states of amyloidogenic proteins and the oxidative stress associated with them, using flow cytometry. The approach is used to study the behavior of soluble and aggregation-prone variants of the amyloid-&#946; peptide.

Bewertung der Auswirkungen der Proteinaggregation auf zellulären oxidativen Stress in der Hefe

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

Forschung

Biochemie

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be employed using a conventional confocal microscope equipped with digital detectors. A protocol for the use of the technique in vitro is shown by means of a use case where number and brightness can be seen to accurately quantify the oligomeric state of mVenus-labelled FKBP12F36V before and after the addition of the dimerizing drug AP20187. The importance of using the correct microscope acquisition parameters and the correct data preprocessing and analysis methods are discussed. In particular, the importance of the choice of photobleaching correction is stressed. This inexpensive method can be employed to study protein-protein interactions in many biological contexts.

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

This protocol describes a calibration-free approach for quantifying protein homo-oligomerization in vitro based on fluorescence fluctuation spectroscopy using commercial light scanning microscopy. The correct acquisition settings and analysis methods are shown.

Kalibrierung-kostenlose In-vitro- Quantifizierung von Protein Homo-Oligomerisierung mit kommerziellen Instrumentierung und kostenlose Open Source-Helligkeit-Analyse-Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest control. To date, several diamide insecticides targeting pest RyRs have been commercialized, which generate annual revenue of 2 billion U.S. dollars. But comprehension of the mode of action of RyR-targeting insecticides is limited by the lack of structural information regarding insect RyR. This in turn restricts understanding of the development of insecticide resistance in pests. The diamondback moth (DBM) is a devastating pest destroying cruciferous crops worldwide, which has also been reported to show resistance to diamide insecticides. Therefore, it is of great practical importance to develop novel insecticides targeting the DBM RyR, especially targeting a region different from the traditional diamide binding site. Here, we present a protocol to structurally characterize the N-terminal domain of RyR from DBM. The x-ray crystal structure was solved by molecular replacement at a resolution of 2.84 &#197;, which shows a beta-trefoil folding motif and a flanking alpha helix. This protocol can be adapted for the expression, purification and structural characterization of other domains or proteins in general.

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

In this article, we describe the protocols of protein expression, purification, crystallization and structure determination of the N-terminal domain of&#160;ryanodine receptor from diamondback moth (Plutella xylostella).

Kristallstruktur des N-terminale Domäne des Ryanodin-Rezeptoren von Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. While the outer surface membrane and associated TATS membrane components appear to be continuous, there are substantial differences in lipid and protein content. In ventricular myocytes (VMs), certain TATS components are highly abundant contributing to rectilinear tubule networks and regular branching 3D architectures. It is thought that peripheral TATS components propagate action potentials from the cell surface to thousands of remote intracellular sarcoendoplasmic reticulum (SER) membrane contact domains, thereby activating intracellular Ca2+ release units (CRUs). In contrast to VMs, the organization and functional role of TATS membranes in atrial myocytes (AMs) is significantly different and much less understood. Taken together, quantitative structural characterization of TATS membrane networks in healthy and diseased myocytes is an essential prerequisite towards better understanding of functional plasticity and pathophysiological reorganization. Here, we present a strategic combination of protocols for direct quantitative analysis of TATS membrane networks in living VMs and AMs. For this, we accompany primary cell isolations of mouse VMs and/or AMs with critical quality control steps and direct membrane staining protocols for fluorescence imaging of TATS membranes. Using an optimized workflow for confocal or superresolution TATS image processing, binarized and skeletonized data are generated for quantitative analysis of the TATS network and its components. Unlike previously published indirect regional aggregate image analysis strategies, our protocols enable direct characterization of specific components and derive complex physiological properties of TATS membrane networks in living myocytes with high throughput and open access software tools. In summary, the combined protocol strategy can be readily applied for quantitative TATS network studies during physiological myocyte adaptation or disease changes, comparison of different cardiac or skeletal muscle cell types, phenotyping of transgenic models, and pharmacological or therapeutic interventions.

In cardiac myocytes, tubular membrane structures form intracellular networks. We describe optimized protocols for i) isolation of myocytes from mouse heart including quality control, ii) live cell staining for state-of-the-art fluorescence microscopy, and iii) direct image analysis to quantify the component complexity and the plasticity of intracellular membrane networks.

Analyse von Membranrohrnetze in Herzmuskelzellen von Vorhöfe und Kammern

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Biotechnik

Development of Knock-Out Muscle Cell Lines using Lentivirus-Mediated CRISPR/Cas9 Gene Editing

One important application of clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas 9 is the development of knock-out cell lines, specifically to study the function of new genes/proteins associated with a disease, identified during the genetic diagnosis. For the development of such cell lines, two major issues have to be untangled: insertion of the CRISPR tools (the Cas9 and the guide RNA) with high efficiency into the chosen cells, and restriction of the Cas9 activity to the specific deletion of the chosen gene. The protocol described here is dedicated to the insertion of the CRISPR tools in difficult to transfect cells, such as muscle cells. This protocol is based on the use of lentiviruses, produced with plasmids publicly available, for which all the cloning steps are described to target a gene of interest. The control of Cas9 activity has been performed using an adaptation of a previously described system called KamiCas9, in which the transduction of the cells with a lentivirus encoding a guide RNA targeting the Cas9 allows the progressive abolition of Cas9 expression. This protocol has been applied to the development of a RYR1-knock out human muscle cell line, which has been further characterized at the protein and functional level, to confirm the knockout of this important calcium channel involved in muscle intracellular calcium release and in excitation-contraction coupling. The procedure described here can easily be applied to other genes in muscle cells or in other difficult to transfect cells and produce valuable tools to study these genes in human cells.

The protocol describes how to generate knock-out myoblasts using CRISPR/Cas9, starting from the design of guide-RNAs to the cellular cloning and characterization of the knock-out clones.

Entwicklung von Knock-out-Muskelzelllinien mittels Lentivirus-vermittelter CRISPR/Cas9-Gen-Editing

One important application of clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas 9 is the development of knock-out cell lines, ...

Genetik

A Rhodopsin Transport Assay by High-Content Imaging Analysis

Rhodopsin misfolding mutations lead to rod photoreceptor death that is manifested as autosomal dominant retinitis pigmentosa (RP), a progressive blinding disease that lacks effective treatment. We hypothesize that the cytotoxicity of the misfolded rhodopsin mutant can be alleviated by pharmacologically stabilizing the mutant rhodopsin protein. The P23H mutation, among the other Class II rhodopsin mutations, encodes a structurally unstable rhodopsin mutant protein that is accumulated in the endoplasmic reticulum (ER), whereas the wild type rhodopsin is transported to the plasma membrane in mammalian cells. We previously performed a luminescence-based high-throughput screen (HTS) and identified a group of pharmacological chaperones that rescued the transport of the P23H rhodopsin from ER to the plasma membrane. Here, using an immunostaining method followed by a high-content imaging analysis, we quantified the mutant rhodopsin protein amount in the whole cell and on the plasma membrane. This method is informative and effective to identify true hits from false positives following HTS. Additionally, the high-content image analysis enabled us to quantify multiple parameters from a single experiment to evaluate the pharmacological properties of each compound. Using this assay, we analyzed the effect of 11 different compounds towards six RP associated rhodopsin mutants, obtaining a 2-D pharmacological profile for a quantitative and qualitative understanding about the structural stability of these rhodopsin mutants and efficacy of different compounds towards these mutants.

Here, we described a high-content imaging method to quantify the transport of rhodopsin mutants associated with retinitis pigmentosa. A multiple-wavelength scoring analysis was used to quantify rhodopsin protein on the cell surface or in the whole cell.

Ein Rhodopsin Transport Test von High-Content Imaging-Analyse

Rhodopsin misfolding mutations lead to rod photoreceptor death that is manifested as autosomal dominant retinitis pigmentosa (RP), a progressive blinding ...

Chemie

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Visualisierung des endoplasmatischen Reticulum Subdomains in kultivierten Zellen

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Biologie

Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between these features may be interrogated by controlling the phase transition of a disease-associated protein in a vulnerable cell type, although this experimental approach has been limited so far. Here, we describe a protocol to induce phase transition of the RNA/DNA-binding protein TDP-43 in spinal motor neurons of zebrafish larvae for modeling cytoplasmic aggregation of TDP-43 occurring in degenerating motor neurons in amyotrophic lateral sclerosis (ALS). We describe a bacterial artificial chromosome (BAC)-based genetic method to deliver an optogenetic TDP-43 variant selectively to spinal motor neurons of zebrafish. The high translucency of zebrafish larvae allows for the phase transition of the optogenetic TDP-43 in the spinal motor neurons by a simple external illumination using a light-emitting diode (LED) against unrestrained fish. We also present a basic workflow of live imaging of the zebrafish spinal motor neurons and image analysis with freely available Fiji/ImageJ software to characterize responses of the optogenetic TDP-43 to the light illumination. This protocol enables the characterization of TDP-43 phase transition and aggregate formation in an ALS-vulnerable cellular environment, which should facilitate an investigation of its cellular and behavioral consequences.

We describe a protocol to induce phase transition of TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) by light in the spinal motor neurons using zebrafish as a model.

Optogenetischer Phasenübergang von TDP-43 in spinalen Motoneuronen von Zebrafischlarven

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between ...

Neurowissenschaften

Functional Characterization of Endogenously Expressed Human RYR1 Variants

More than 700 variants in the RYR1 gene have been identified in patients with different neuromuscular disorders including malignant hyperthermia susceptibility, core myopathies and centronuclear myopathy. Because of the diverse phenotypes linked to RYR1 mutations it is fundamental to characterize their functional effects to classify variants carried by patients for future therapeutic interventions and identify non-pathogenic variants. Many laboratories have been interested in developing methods to functionally characterize RYR1 mutations expressed in patients&#39; cells. This approach has numerous advantages, including: mutations are endogenously expressed, RyR1 is not over-expressed, use of heterologous RyR1 expressing cells is avoided. However, since patients may present mutations in different genes aside RYR1, it is important to compare results from biological material from individuals harboring the same mutation, with different genetic backgrounds. The present manuscript describes methods developed to study the functional effects of endogenously expressed RYR1 variants in: (a) Epstein Barr virus immortalized human B-lymphocytes and (b) satellite cells derived from muscle biopsies and differentiated into myotubes. Changes in the intracellular calcium concentration triggered by the addition of a pharmacological RyR1 activators are then monitored. The selected cell type is loaded with a ratiometric fluorescent calcium indicator and intracellular [Ca2+] changes are monitored either at the single cell level by fluorescence microscopy or in cell populations using a spectrofluorometer. The resting [Ca2+], agonist dose response curves are then compared between cells from healthy controls and patients harboring RYR1 variants leading to insight into the functional effect of a given variant.

Here methods used to study the functional effect of RYR1 mutations endogenously expressed in Epstein Barr Virus immortalized human B-lymphocytes and muscle biopsy derived satellite cells differentiated into myotubes are described.

Funktionelle Charakterisierung endogen exprimierter humaner RYR1-Varianten

More than 700 variants in the RYR1 gene have been identified in patients with different neuromuscular disorders including malignant hyperthermia ...

Medizin

Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

The pro-arrhythmic cardiac disorder catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) manifests as polymorphic ventricular tachycardia episodes following physical activity, stress, or catecholamine challenge, which can deteriorate into potentially fatal ventricular fibrillation. The mouse heart is a widespread species for modeling inherited cardiac arrhythmic diseases, including CPVT. Simultaneous optical mapping of transmembrane potential (Vm) and calcium transients (CaT) from Langendorff-perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying arrhythmogenesis. Compared with the cellular level investigation, the optical mapping technique can test some electrophysiological parameters, such as the determination of activation, conduction velocity, action potential duration, and CaT duration. This paper presents the instrumentation setup and experimental procedure for high-throughput optical mapping of CaT and Vm in murine wild-type and heterozygous RyR2-R2474S/+ hearts, combined with programmed electrical pacing before and during the isoproterenol challenge. This approach has demonstrated a feasible and reliable method for mechanistically studying CPVT disease in an ex vivo mouse heart preparation.

Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

This protocol introduces dual-dye optical mapping of mouse hearts obtained from wild-type and knock-in animals affected by catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia, including electrophysiological measurements of transmembrane voltage and intracellular Ca2+ transients with high temporal and spatial resolution.

Optisches Dual-Dye-Mapping von Herzen aus RyR2R2474S Knock-In-Mäusen mit katecholaminerger polymorpher ventrikulärer Tachykardie

The pro-arrhythmic cardiac disorder catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) manifests as polymorphic ventricular tachycardia episodes ...

Genetische und biochemische Ansätze für

Zusammenfassung

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