Name: deriving retinal pigment epithelium (rpe) from induced pluripotent stem (ips) cells by different sizes of embryoid bodies
Uploaded: 2015-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
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The opinions or assertions contained herein are the private views of the authors and are not to be construed as official or as reflecting the views of the Department of the Army or the Department of Defense. This research was performed while the authors Alberto Mu&#241;iz, Ramesh R Kaini, Whitney A Greene and Jae-Hyek Choi held a National Research Council Postdoctoral Research Associateship at the USAISR. This work was supported by U.S. Army Clinical Rehabilitative Medicine Research Program (CRMRP) and Military Operational Medicine Research Program (MOMRP).

1. Vorbereitung der Reagenzien und Kultur Kulturplatten <ol><li> Bereiten Feeder-freien Stammzellkulturmedium durch Zugabe von 100 ml 5x serumfreien Ergänzung zu 400 ml der Stammzell Basalmedium. Das Medium ist bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen und bei -20 ° C für 6 Monate stabil. </li><li> In 10 uM Lösung von Rho-assoziierten, Coiled-Coil, die Proteinkinase (Rock) Inhibitor (Y-27362) zu handelsüblichen Embryoidkörper (EB) Bildung Medium. </li><li> Bereiten Differenzierungsmedium durch Zugabe von 0,1 mM β-Mercaptoethanol, 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 2 mM L-Glutamin, 10% knockout Serumersatz (KSR) und 10 ug / ml Gentamycin in Dulbeccos Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F12). </li><li> Bereiten iPS-RPE Medium durch Zugabe 1x N1 Ergänzung, 0,1 mM nicht-essentielle Aminosäuren, 250 ug / ml Taurin, 13 ng / ml triiodo-L-thyronin-Natriumsalz, 20 ng / ml Hydrocortison, 5 ug / ml Gentamicin, und 15% Fötales Rinderserum (FBS) &lt;sup&gt; 21 bis Minimum Essential Medium Eagle (MEM). Den pH-Wert auf 7,4. </li><li> Bereiten Triiod-L-Thyronin Natriumsalz-Stammlösung. Lösen Sie 1 mg Triiod-L-Thyronin Natriumsalz in 1 N Natronlauge durch vorsichtiges Schwenken. Hinzufügen 49 ml MEM auf 50 ml von 20 ug / ml triiodo-L-thyronin-Natriumsalz zu machen. Bereiten Aliquots und bei -20 ° C, bis sie benötigt. Verwenden Sie geeignete Lautstärke, um die gewünschte Konzentration in Endmedium erzielen. </li><li> Bereiten Sie Hydrocortison-Stammlösung. Solubilisieren 1 mg Hydrocortison in 1 ml 100% Ethanol leicht gerührt. Fügen Sie 19 ml MEM auf 20 ml 50 ug / ml Hydrocortison-Stammlösung zu machen. Aliquotieren und bei -20 ° C, bis es benötigt. Verwenden Sie geeignete Lautstärke, um die gewünschte Konzentration in der fertigen Kulturmedium zu erreichen. </li><li> Vorbereiten einer Arbeitslösung Dispase von 1 mg / ml in DMEM / F12. </li><li> Herstellung der Matrix beschichteten Platten <ol><li> Bereiten Proteinmatrix von Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) extrahiert mouse Sarkomzellen in DMEM / F12 bis 0,08 mg / ml. Coat jede Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen mit 1 ml der Matrixlösung. Inkubieren der beschichteten Platten bei Raumtemperatur für 1 Std. </li><li> Nach 1 h Inkubation aspirieren die überschüssige DMEM / F12. 0,5 ml von Feeder-freien Stammzellkulturmedium, um das Trocknen der Vertiefungen zu verhindern. Die Matrix beschichteten Platten sind gebrauchsfertig. </li></ol></li><li> Bereiten Mikrotiterplatten durch Spülen jedes Well mit 2 ml DMEM / F12. Entfernen DMEM / F12, und fügen Sie 0,5 ml EB Bildung Medium mit Rock-Inhibitor in jede Vertiefung ergänzt. Zentrifugieren Sie die Platte bei 2.000 xg für 5 min, um Luftblasen zu entfernen. </li><li> Bereiten FACS Färbepuffer durch Vermischen von 2% FBS und 0,09% Natriumazid in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Stellen Sie den Puffer auf pH 7,4. </li><li> Bereiten Trypsin Neutralisierungslösung durch Zugabe von 10% FBS zu DMEM / F12. </li></ol> 2. iPS Kultur <ol><li> Vor der iPS-Zellaussaat, warm Einzug freie Spindelzellkulturmedium auf 37 ° C, und die matrix beschichteten Platten bereit. </li><li> Tauen schnell die IMR90-1 iPS-Zellen in einem 37 ° C Wasserbad. Entfernen Sie dann die Kryo-Röhrchen aus dem Wasserbad und wischen Sie das Fläschchen mit 70% Ethanol. Übertragen der Zellen in ein 15 ml konisches Röhrchen mit einer 2 ml-Pipette zum Brechen von Zellklumpen zu minimieren. </li><li> 5 ml warmem Feeder-freien Stammzellkulturmedium zu den Zellen tropfenweise und vorsichtig mischen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 xg für 5 Minuten bei Raumtemperatur und Überstand. </li><li> Die Zellklumpen vorsichtig resuspendieren in 2 ml von Feeder-freien Stammzellkulturmedium und das Seeding von Zellklumpen in die Vertiefungen matrixbeschichteten Platte. Legen Sie die Platte in eine 37 ° C-Inkubator mit 5% CO 2, 95% Luftfeuchtigkeit. </li><li> Ändern Sie den iPS-Zellkulturmedium täglich. Beachten undifferenzierte Kolonien fünf bis sieben Tage nach der Aussaat. Prüfen Sie, ob undifferenzierte Kolonien, die bereit sind für den Durchgang (Kolonien mit einem dichten Zentrum) unter einem Lichtmikroskop sind. </li></ol> 3. Passagieren von iPS-Zellen <ol><li> Vor Beginn um den Durchgang der iPS-Zellen, warm das Dispase-Lösung, DMEM / F12 und Feeder-freien Stammzellkulturmedium auf 37 ° C im Wasserbad. </li><li> Vor der Passage iPS-Zellen, entfernen Sie alle Bereiche der Differenzierung durch Abschaben der Gegend und Absaugen des Mediums. Die iPS-Zellen vorsichtig spülen Sie mit 2 ml DMEM / F12. </li><li> 1 ml von 1 mg / ml Dispase in jede Vertiefung und Inkubieren bei 37 ° C für 7 min. Saugen Sie das Dispase und sanft spülen Sie die Zellkolonien mit 2 ml DMEM / F12 zweimal. Nach dem Spülen, 2 ml Feeder freie Spindelzellkulturmedium in jede Vertiefung. </li><li> Mit einem 5 ml-Pipette sanft kratzen die Kolonien von der Platte, um Zellklumpen zu bilden. Übertragen Sie die freistehende Zellklumpen zu einem 15 ml konischen Röhrchen. Ausreichend Einzug freie Spindelzellkulturmedium, um den nächsten Durchgang von Zellen Saatgut. </li></ol> 4. Erzeugung von EVG Mit Mikrotiterplatten <ol><li> Herstellung einer Einzelzellsuspension von iPS <ol><li> Entfernen Sie die medium von den iPS-Zellen und spülen Sie die iPS-Zellen mit 2 ml DMEM / F12. Fügen Sie 750 ul von Accutase zu iPS-Zellen in jedem Well der 6-Well-Platte. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2, um damit die Zellen von der Platte (ca. 5-10 min) löst. </li><li> Verwende eine Pipette, um sanft dissoziieren jegliche verbleibenden Zellen und um jegliche verbleibenden Zellen auf der Plattenoberfläche zu lösen. Übertragen der Zellen in ein 50 ml konischen Röhrchen. Spülen der Platte mit 5 ml DMEM / F12 und verbinden das gespült DMEM / F12 mit den Zellen in dem konischen Rohr. Übergeben Sie die Zellsuspension durch ein 40 um Zellsieb um mögliche Restzellklumpen zu entfernen. </li><li> Zentrifugiere die Zellen bei 300 g für 5 min bei RT, die Accutase entfernen. Zellpellet in EB Bildung Medium, so daß die Zellkonzentration etwa 0,5-1,0 x 10 7 Zellen / ml. </li><li> Bestimmung der Anzahl der lebensfähigen Zellen durch Zählen der Zellen mit Trypan-Blau und einem Hämocytometer. </li></ol></li><li> Einrig Zelldichte in Mikrogröße gesteuerte EVGs zu bilden <ol><li> Stellen Sie die Anzahl der Zellen in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte, um die gewünschten EB Größen erzeugen. In Zellen, um die Vertiefungen der in Schritt 1.9 vorbereitet Platten, Verteilen Sie die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren Sie die Zellen mehrmals. HINWEIS: Anzahl der Zellen pro Vertiefung required = gewünschte Anzahl von Zellen pro EB x Anzahl der Vertiefungen pro Vertiefung. </li><li> Stellen Sie die EB Bildung Medium mit Fels Inhibitor zu einem Endvolumen von 2,0 ml, ergänzt in den Vertiefungen. Verteilen Sie die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren jede Vertiefung. Zentrifugieren Sie die Mikrotiterplatten bei 100 × g für 3 min. Legen Sie die Platten in einem Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2 und 95% Feuchtigkeit für 24 Stunden. </li></ol></li><li> Ernten EBs aus den Mikrotiterplatten <ol><li> Ernte-EVG von Vertiefungen pipettiert Medium in der gut nach oben und unten mit einer 1 ml Mikropipette, die meisten der EVG zu entfernen. Übergeben Sie die EB Suspension durch ein umgekehrtes 40 um ZellSieb auf einem 50 ml konischen Röhrchen um einzelne Zellen zu entfernen. </li><li> 5 mal Waschen Sie die Mikrotiterplatte mit 1 ml DMEM / F12, um alle EVG entfernen. Sammeln Sie wäscht und übergehen das invertierte Zellsieb. Drehen Sie den Zellsieb rechten Seite nach oben auf ein neues 50 ml konischen Röhrchen. Sammeln Sie die EVG durch Waschen mit EB Bildung Medium. Graf EVG, um die Ausbeute zu bestimmen. </li></ol></li></ol> 5. Überzug EVG und Initiieren Differenzierung <ol><li> Platte der EVG auf Proteinmatrix beschichtet sechs Well-Platten (wie in Schritt 1.8.1) mit einer Dichte von &lt;1,000 EVG / Vertiefung in EB Bildung Medium plus 10 uM Felsen Inhibitor. EBS Bei 37 ° C mit 5% CO 2 und 95% Luftfeuchtigkeit für 24 Stunden. </li><li> 24 h nach der EB-Beschichtung, ersetzen mit Differenzierungsmedium zur Differenzierung zu initiieren. Ändern Hälfte des Differenzierungsmedium alle zwei Tage, bis die Zellen werden für die weitere Analyse gesammelt. </li><li> Proben werden an Tag 6, 17, 29 und 60 bis RT-PCR durchzuführen, immunocytochemistry und FACS, die Expression von charakteristischen RPE Gene und Proteine ​​zu validieren. </li></ol> 6. RNA-Extraktion und PCR <ol><li> Extrahieren von RNA aus den EB Proben entsprechend den Anweisungen in dem im Handel erhältlichen Kit bereitgestellt. RNA-Konzentration zu bestimmen, unter Verwendung eines Spektrophotometers. </li><li> Führen Sie die reverse Transkription auf 100 ng Gesamt-RNA nach handelsüblichen RNA in cDNA umgekehrter Transkript Kit. </li><li> Führen PCR mit 10 ng der cDNA unter Verwendung der folgenden Primer (Tabelle 1) bei einer Konzentration von 10 umol / 10 ng cDNA. Stellen Sie die PCR wie folgt: Denaturierung DNA bei 95 ° C für 5 Minuten, zu amplifizieren mit 35 Zyklen bei 95 ° C für 15 sec, 60 ° C für 30 sec, 72 ° C für 1 min, gefolgt von einem abschließenden Zyklus bei 72 &amp; deg; C für 10 min. Führen des PCR-Produkts auf einem 1% Agarose-Gel. </li></ol> 7. Immunocytochemistry <ol><li> Zweimal bei RT Waschen Sie die EVG mit PBS. Befestigen Sie die EVG bei RT in 4% paraformaldehyde für 10 min. Einmal mit PBS spülen bei RT. Lagerung von Proben in PBS bei 4 ° C bis zur Färbung verwendet. </li><li> Auf Färbung Tag behandeln die fixierten Zellen mit Fixierung und Permeabilisierung Reagenzien. Die Proben mit Blockierungslösung (10% Ziegenserum in Permeabilisierung Lösung) für 1 Stunde bei RT inkubiert. </li><li> Führen Immun in 10% Ziegenserum in Permeabilisierung Lösung mit den folgenden primären Antikörpern bei den angegebenen Verdünnungen: anti-Pax6 (1:10), anti-RX (1: 200), anti-MITF (1:30) und anti- NV1 (1: 100). Proben inkubieren mit entsprechenden Antikörpern O / N bei 4 ° C. </li><li> Am nächsten Tag, nehmen Sie den primären Antikörper aus den Zellen und dreimal spülen Sie die Proben mit PBS. Proben mit Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper, Inkubation für 1 h bei RT. </li><li> Entfernen Sie die sekundäre Antikörper aus den Zellen und dreimal spülen Sie die Proben in PBS. Montieren Sie die Deckgläser auf Glasobjektträger mit DAPI, die Einschlussmittel und erlauben Proben O / N in einem dunklen Raum eingestellt.Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um die Färbung zu visualisieren. </li></ol> 8. Die Färbung für die FACS-Analyse <ol><li> Zweimal waschen kultiviert EVG in PBS. Die EVG mit 0,5 ml 0,25% Trypsin inkubieren 5-10 Minuten, um eine Einzelzellsuspension zu machen. Neutralisieren des Trypsins mit Trypsin Neutralisierungslösung (1 ml / Vertiefung). </li><li> Übertragen der Einzelzellsuspension in ein 15 ml konisches Röhrchen und zentrifugiert bei 600 g für 10 min. </li><li> Überstand verwerfen und 10 ml DMEM / F12, um die Zellen in der Röhre. Vorsichtig umdrehen, um die Zellen zu mischen. Zentrifuge bei 600 x g. Nach dem Zentrifugieren den Überstand verwerfen und die Zellen resuspendieren in FACS Färbepuffer. </li><li> Zählen der Gesamtzahl der Zellen. Zentrifuge bei 600 × g für 10 min. Nach Zentrifugation Ablagestand. Fixieren die Zellen unmittelbar durch Zugabe von 0,5 ml 4% Paraformaldehyd. Gut mischen durch vorsichtiges Vortexen. Inkubieren der Zellen bei 4 ° C für 20 min. </li><li> Zentrifugieren bei 600 · g für 10 Minuten und entfernen Sie dieÜberstand. Vortex vorsichtig, um das Zellpellet zu stören. Permeabilisierung der Zellen durch Zugabe von 1 ml gekühltem Permeabilisierung Lösung. Vortex vorsichtig mischen und Inkubation auf Eis für 30 min. </li><li> Zentrifugieren bei 600 · g für 10 Minuten, und entfernen Sie den Überstand. 3 ml FACS Färbepuffer und resuspendieren. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal. Die Zellen in FACS-Färbepuffer bei einer Endkonzentration von 5 x 10 6 Zellen / ml. </li><li> Dann 100 ul der Zellsuspension (0,5 x 10 6 Zellen) in jedes Mikroröhrchen und fügen die empfohlene Volumen des primären Antikörpers. Für Pax6 werden 5 ul PE anti-Pax6 in 100 &amp; mgr; l Zellsuspension. Für MITF werden 5 ul Anti MITF in 100 &amp; mgr; l Zellsuspension. </li><li> Mischen und Inkubation bei Raumtemperatur für 60 min. 3 ml FACS Färbepuffer. Mischen Sie und Zentrifuge bei 600 g für 10 min. Überstand verwerfen und wiederholen 8,16 für zwei weitere Male. </li><li> Für MITF Färbung, Inkubation der Zellen in sekundären Antibody, Ziegen-Anti-Maus-Alexa Fluor 488 bei einer Verdünnung von 1: 2000 für 1 Stunde bei 4 ° C. Für Pax6 Färbung, vermeiden Sie diesen Schritt. </li><li> Die Zellen werden mit 5 ml FACS-Färbung Puffer und Zentrifugieren bei 600 × g für 10 min. Wiederholen Sie den Vorgang für zwei weitere Male. </li><li> Die Zellen in 500 ul FACS Färbepuffer und vortexen, um die Zellpellets zu stören. Die Proben sind bereit für die Durchflusszytometrie. </li></ol> 9. iPS-RPE Isolierung und Kultur <ol><li> Am Tag 29, vorsichtig um die ausgewählten pigmentierte Kolonien von der Kulturplatte unter Verwendung eines 200 &amp; mgr; l-Pipettenspitze geschnitten. Übertragen Sie die schwimmenden Kolonien zu einem 15 ml konischen Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Kolonien bei 600 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur und Überstand. </li><li> Resuspendieren der Zellkolonien in 10 ml DMEM / F12 und zentrifugiert bei 600 g für 10 min. Entfernen Sie den Überstand. </li><li> Vorbereiten einer Einzelzellsuspension durch Inkubation der Kolonien mit 2 ml 0,25% Trypsin bei 37 ° C für 7-10 min. Vortexen Sie vorsichtig die Zellsuspension, die Kolonien zu distanzieren. </li><li> Neutralisieren des Trypsins durch Zugabe von 2 ml von iPS-RPE Medium. Zentrifugieren bei 600 · g für 10 min und den Überstand verwerfen. Resuspendieren der einzelnen Zellen in 2 ml von iPS-RPE Medium. Übertragen der Zellen in einer Proteinmatrix beschichtet 6-Well-Platte und in einen Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2 und 95% Luftfeuchtigkeit. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Um die volle Versprechen der pluripotenten Stammzellen für die Zelltherapie zu realisieren, ist es notwendig, ihre Differenzierung konsistent und reproduzierbar zu regeln. Dieser Bericht beschreibt Protokolle Größe gesteuerte EVGs mit Mikrotiterplatte Technologie bilden, initiieren die Differenzierung in Richtung RPE und identifizieren Protein und Gen-Marker der RPE. Um die in vitro Differenzierung synchronisiert wurden homogene Größen EVG durch eine bekannte Anzahl von iPS-Zellen in Mikrotiterplatten durc...

Pluripotenten Stammzellen (iPS) -Zellen sind eine Art von pluripotenten Stammzellen durch Umprogrammieren erwachsenen Zellen mit extrinsische Faktoren 1 abgeleitet. Demgegenüber embryonale Stammzellen (WSR), eine andere Art von pluripotenten Stammzelle, aus der inneren Zellmasse des Blastozysten 2-3 erzeugt. Trotz ihrer unterschiedlichen Herkunft iPS-Zellen und WSR in ihrer unbegrenzte Fähigkeit, in vitro und in ihrer Fähigkeit, sich in jeden Zelltyp differenzieren 4-5 replizieren vergleichbar. Diese Eigenschaften der iPS-Zellen machen sie zu idealen Kandidaten für Anwendungen in der personalisierten regenerativen Medizin. Neueste Forschungsanstrengungen auf die Entwicklung von robusten Differenzierungsprotokolle zur Herstellung spezialisierten adulten Zellen einschließlich retinalen Pigmentepithel (RPE) 6-11 konzentriert. Für mögliche klinische Anwendungen von iPS-abgeleiteten Zellen, ist eine gerichtete Differenzierung für den spezifischen Zelltyp wesentlich. Es gibt verschiedene Methodenzur gerichteten Differenzierung beider WSR und iPS-Zellen in RPE, die sich stark in ihrer Effizienz 6-7, 12-16 variiert veröffentlicht. Wir wissen noch nicht, viele der molekularen Ereignisse, die die Zell- / Gewebe Schicksal während der Entwicklung oder Differenzierung zu regieren. In den letzten Jahren wurden Anstrengungen unternommen, um das Protokoll, das die Differenzierung der Embryonalentwicklung so viel wie möglich nachahmen kann entwickeln. Während der Blastocysten Phase nicht gebundenen Population von Stammzellen sind zusammen in einer dreidimensionalen Mikroumgebung. So wurden verschiedene Strategien angewandt, um die ESC / iPS-Zellen zusammengebaut machen und wachsen sie in drei Dimensionen. Diese Stammzellaggregate Embryoidkörpern (EVG) genannt. Studien haben gezeigt, dass EB Differenzierung von Stammzellen zu imitieren frühen Stadium der Embryoentwicklung und können spontan entstehen primitive Endoderm auf seiner Außenfläche. Später, als EB Entwicklung fortschreitet, differenziert Zellphänotypen aller drei Keimlinien erscheinen 17-18. Therefore haben EVG basiert Differenzierungsprotokolle viel Aufmerksamkeit für die in vitro Differenzierung von ESC / iPS-Zellen angezogen und sind ein guter Kandidat für RPE-Generation von pluripotenten Stammzellen 13. EVG kann mit verschiedenen Methoden von ESC / iPS-Zellen hergestellt werden. Zunächst wurden EBs durch Abschaben adhärenten Kolonien und ihre Beibehaltung in nicht-haftenden Suspensionskultur gemacht. Dagegen ergibt die dieser Ansatz heterogene Population von EVG, die geringe Reproduzierbarkeit führt. Hängenden Tropfen der Zellkultur und Mikrowell basierend EVG Bildung sind weitere beliebte Techniken zur EVG Formation, die homogene EVG definierter Größen, die in hohem Maße reproduzierbar sind zu erhalten. Weiterhin kann die Mikrowelltechnik Vielzahl von Aggregaten mit weniger Aufwand zu erhalten. Differenzierung von Zellen im EVG durch einen Multiplex von morphogenen Hinweise aus der extra- und intrazellulären Mikro geregelt. Im Gegensatz zur Differenzierung in einem monolayer Format EVG bieten eine Plattform für komplexe Montage von Zellen und interzellulären Signalübertragung auftreten 17. Interessanterweise ist die Anzahl der pluripotenten Stammzellen verwendet, um einzelne EBs machen wurde beobachtet, um das Schicksal von Zellen beeinflussen. Zum Beispiel wird in einer hämatopoetischen Differenzierung Studium menschlicher WSR, wurde beobachtet, daß 500-Zellen EB gefördert Differenzierung gegen myeloider Abstammung wohin 1.000-Zell EB geschoben Richtung Erythroidlinie 20. In einer anderen Studie kleineren EBs begünstigt Endoderm Differenzierung während größere EBs Richtung Neuro Ektoderm Differentiation 11, 17 gefördert. Diese früheren Studien legen nahe, dass die Zahl der verwendet, um einzelne EVG machen ESC / iPS-Zellen beeinflussen die EVG basierte Differenzierung zu allen Zelltypen. Jedoch nach unserer Kenntnis gibt es keine aktuellen Studien, die die Wirkung der EBs Größe in seiner Neigung aufgeklärt haben, auf RPE unterscheiden. Das Ziel dieser Studie ist es, den Einfluss der kennEB Größe für induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) - retinalen Pigmentepithel (iPS-RPE) Differenzierung und um die optimale Anzahl von Zellen, die EVG für gerichtete Differenzierung gegen RPE-Linie machen, zu identifizieren.

<table><tbody><tr><td>mTeSR1 media + 5x supplement</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (Rock Inhibitor)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M-7154</td><td></td></tr><tr><td>Non essential amino acids</td><td>Hyclone(Fisher)</td><td>SH30853.01</td><td></td></tr><tr><td>Knockout serum replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>MEM media</td><td>Life Technologies</td><td>10370-021</td><td></td></tr><tr><td>N1 supplement</td><td>Sigma</td><td>N-6530-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>T-8691-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma</td><td>H0888-1G</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Hyclone(Fisher)</td><td>SH3008803HI</td><td></td></tr><tr><td>Triiodo-L-thyronine sodium&amp;nbsp; salt</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Hyclone(Fisher)</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Aggrewell 400 plate</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>27940</td><td></td></tr><tr><td>AggreWell medium</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5893</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-PAX6 antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-RX antibody</td><td>Abcam</td><td>Ab23340</td><td></td></tr><tr><td>Mouse&amp;nbsp; Anti-MITF antibody</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-772-P</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-ZO-1 antibody</td><td>Invitrogen</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy plus mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>PCR master mix</td><td>Promega</td><td>M7502</td><td></td></tr><tr><td>High capacity RNA to cDNA kit</td><td>Life Technologies</td><td>4387406</td><td></td></tr></tbody></table>

deriving retinal pigment epithelium (rpe) from induced pluripotent stem (ips) cells by different sizes of embryoid bodies

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of techniques to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has generated interest and excitement towards the possibility of customized personal regenerative medicine. However, the efficiency of stem cell differentiation towards a desired lineage remains low. The purpose of this study is to describe a protocol to derive retinal pigment epithelium (RPE) from iPS cells (iPS-RPE) by applying a tissue engineering approach to generate homogenous populations of embryoid bodies (EBs), a common intermediate during in vitro differentiation. The protocol applies the formation of specific size of EBs using microwell plate technology. The methods for identifying protein and gene markers of RPE by immunocytochemistry and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) are also explained. Finally, the efficiency of differentiation in different sizes of EBs monitored by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of RPE markers is described. These techniques will facilitate the differentiation of iPS cells into RPE for future applications.

In diesem Experiment wurden iPS-Zellen kultiviert und differenziert in die RPE-Linie von EVG. EVG kontrollierter Größen wurden mit Mikrowell-Platten gebildet. Wie in Abbildung 1 EB Bildung gesehen homogen war in den Mikrotiterplatten. Diese EBs wurden dann gesammelt und auf Platten mit 6 Vertiefungen ausplattiert (Abbildung 2). RPE können durch ihre klassischen hexagonaler Morphologie, Pigmentierung und Expression von RPE-Marker identifiziert werden. Nach...

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Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Das Ziel dieses Berichts ist es, die Protokolle zu beschreiben, um die retinale Pigmentepithel (RPE) von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) mit unterschiedlichen Größen Embryoidkörpern abzuleiten.

Ableiten Retinapigmentepithel (RPE) von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) von verschiedenen Größen von Embryoidkörpern

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

deriving-retinal-pigment-epithelium-rpe-from-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

10.5K Aufrufe.  U.S. Army Institute of Surgical Research.  Das Ziel dieses Berichts ist es, die Protokolle zu beschreiben, um die retinale Pigmentepithel (RPE) von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) mit unterschiedlichen Größen Embryoidkörpern abzuleiten. 

Serie: Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

Effiziente Ableitung von Retinapigmentepithel-Zellen aus Stammzellen

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Schnelle, gezielte Differenzierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen embryonalen oder induzierte pluripotente Stammzellen

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of human-induced pluripotent stem cells (iPSCs) is particularly attractive for neurodegenerative disease studies, including retinal dystrophies, where iPSC-derived retinal cell models mark a major step forward to understand and fight blindness. In this paper, we describe a simple and scalable protocol to generate, mature, and cryopreserve retinal organoids. Based on medium changing, the main advantage of this method is to avoid multiple and time-consuming steps commonly required in a guided differentiation of iPSCs. Mimicking the early phases of retinal development by successive changes of defined media on adherent human iPSC cultures, this protocol allows the simultaneous generation of self-forming neuroretinal structures and retinal pigmented epithelial (RPE) cells in a reproducible and efficient manner in 4 weeks. These structures containing retinal progenitor cells (RPCs) can be easily isolated for further maturation in a floating culture condition enabling the differentiation of RPCs into the seven retinal cell types present in the adult human retina. Additionally, we describe quick methods for the cryopreservation of retinal organoids and RPE cells for long-term storage. Combined together, the methods described here will be useful to produce and bank human iPSC-derived retinal cells or tissues for both basic and clinical research.

The production of specialized retinal cells from pluripotent stem cells is a turning point in the development of stem cell-based therapy for retinal diseases. The present paper describes a simple method for an efficient generation of retinal organoids and retinal pigmented epithelium for basic, translational, and clinical research.

Definierten Xeno-frei und Feeder-freie Kulturbedingungen für die Generation der menschlichen iPSC-abgeleitete Retinal Zellmodellen

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms of retinitis pigmentosa (RP) and age-related macular degeneration (AMD). Cell therapy is one of the most promising therapeutic strategies proposed to cure these diseases, with already encouraging preliminary results in humans. However, the method of preparation of the graft has a significant impact on its functional outcomes in vivo. Indeed, RPE cells grafted as a cell suspension are less functional than the same cells transplanted as a retinal tissue. Herein, we describe a simple and reproducible method to engineer RPE tissue and its preparation for an in vivo implantation. RPE cells derived from human pluripotent stem cells are seeded on a biological support, the human amniotic membrane (hAM). Compared to artificial scaffolds, this support has the advantage of having a basement membrane that is close to the Bruch&#39;s membrane where endogenous RPE cells are attached. However, its manipulation is not easy, and we developed several strategies for its proper culturing and preparation for grafting in vivo.

We describe a method to engineer a retinal tissue composed of retinal pigment epithelial cells derived from human pluripotent stem cells cultured on top of human amniotic membranes and its preparation for grafting in animal models.

Engineering-Transplantation geeignet retinalen Pigment Epithel Gewebe abgeleitet aus humanen embryonalen Stammzellen

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE provide critical support for photoreceptors and death or dysfunction of RPE cells is characteristic of age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in people age 55 and older. While no cure for AMD has been identified, implantation of healthy RPE in diseased eyes may prove to be an effective treatment, and large numbers of RPE cells can be readily generated from pluripotent stem cells. Several interesting questions regarding the safety and efficacy of RPE cell delivery can still be examined in animal models, and well-accepted protocols used to inject RPE have been developed. The technique described here has been used by multiple groups in various studies and involves first creating a hole in the eye with a sharp needle. Then a syringe with a blunt needle loaded with cells is inserted through the hole and passed through the vitreous until it gently touches the RPE. Using this injection method, which is relatively simple and requires minimal equipment, we achieve consistent and efficient integration of stem cell-derived RPE cells in between the host RPE that prevents significant amount of photoreceptor degeneration in animal models. While not part of the actual protocol, we also describe how to determine the extent of the trauma induced by the injection, and how to verify that the cells were injected into the subretinal space using in vivo imaging modalities. Finally, the use of this protocol is not limited to RPE cells; it may be used to inject any compound or cell into the subretinal space.

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

Darstellende Subretinale Injektionen in Nagetiere zu retinalen Pigmentepithelzellen in Suspension liefern

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Medizin

Generation of Retinal Organoids from Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Pluripotent stem cells can generate complex tissue organoids that are useful for in vitro disease modeling studies and for developing regenerative therapies. This protocol describes a simpler, robust, and stepwise method of generating retinal organoids in a hybrid culture system consisting of adherent monolayer cultures during the first 4 weeks of retinal differentiation till the emergence of distinct, self-organized eye field primordial clusters (EFPs). Further, the doughnut-shaped, circular, and translucent neuro-retinal islands within each EFP are manually picked and cultured under suspension using non-adherent culture dishes in a retinal differentiation medium for 1-2 weeks to generate multilayered 3D optic cups (OC-1M). These immature retinal organoids contain PAX6+ and ChX10+ proliferating, multipotent retinal precursors. The precursor cells are linearly self-assembled within the organoids and appear as distinct radial striations. At 4 weeks after suspension culture, the retinal progenitors undergo post-mitotic arrest and lineage differentiation to form mature retinal organoids (OC-2M). The photoreceptor lineage committed precursors develop within the outermost layers of retinal organoids. These CRX+ and RCVRN+ photoreceptor cells morphologically mature to display inner segment-like extensions. This method can be adopted for generating retinal organoids using human embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs). All steps and procedures are clearly explained and demonstrated to ensure replicability and for wider applications in basic science and translational research.

This protocol describes an efficient method of differentiating hiPSCs into eye field clusters and generating neuro-retinal organoids using simplified culture conditions involving both adherent and suspension culture systems. Other ocular cell types, such as the RPE and corneal epithelium, can also be isolated from mature eye fields in retinal cultures.

Erzeugung retinaler Organoide aus gesunden und netzhautspezifischen, human-induzierten pluripotenten Stammzellen

Pluripotent stem cells can generate complex tissue organoids that are useful for in vitro disease modeling studies and for developing regenerative ...

Verbesserte 3D-Differenzierung der neuronalen Netzhaut von menschlichen embryonalen Stammzellen

Generating Neural Retina from Human Pluripotent Stem Cells

Retinopathy is one of the main causes of blindness worldwide. Investigating its pathogenesis is essential for the early diagnosis and timely treatment of retinopathy. Unfortunately, ethical barriers hinder the collection of evidence from humans. Recently, numerous studies have shown that human pluripotent stem cells (PSCs) can be differentiated into retinal organoids (ROs) using different induction protocols, which have enormous potential in retinopathy for disease modeling, drug screening, and stem cell-based therapies. This study describes an optimized induction protocol to generate neural retina (NR) that significantly reduces the probability of vesiculation and fusion, increasing the success rate of production until day 60. Based on the ability of PSCs to self-reorganize after dissociation, combined with certain complementary factors, this new method can specifically drive NR differentiation. Furthermore, the approach is uncomplicated, cost-effective, exhibits notable repeatability and efficiency, presents encouraging prospects for personalized models of retinal diseases, and supplies a plentiful cell reservoir for applications such as cell therapy, drug screening, and gene therapy testing.

Autor im Rampenlicht: Einfache und effiziente Produktion von neuronalen Netzhaut-Organoiden für die Modellierung von Krankheiten

The present protocol describes an optimized 3D neural retina induction system that reduces the adhesion and fusion of retinal organoids with high repeatability and efficiency.

Erzeugung neuronaler Netzhaut aus humanen pluripotenten Stammzellen

Retinopathy is one of the main causes of blindness worldwide. Investigating its pathogenesis is essential for the early diagnosis and timely treatment of ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human iPS cells (iPS-RPE), and fetal RPE. The protocols include collection of RNA for analysis by microarray, and the analysis of microarray data to identify miRNAs that are differentially expressed among three cell types. The methods for culture of iPS cells and fetal RPE are explained. The protocol used for differentiation of RPE from human iPS is also described. The RNA extraction technique we describe was selected to allow maximal recovery of very small RNA for use in a miRNA microarray. Finally, cellular pathway and network analysis of microarray data is explained. These techniques will facilitate the comparison of the miRNA profiles of three different cell types.

The microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human induced-pluripotent stem (iPS) cells (iPS-RPE), and fetal RPE, were compared.

MicroRNA Expressionsprofile der Menschen iPS-Zellen, Retinapigmentepithel Abgeleitet aus iPS und Fetal Retinapigmentepithel

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Ableiten Retinapigmentepithel (RPE) von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) von verschiedenen Größen von Embryoidkörpern

Zusammenfassung

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Effiziente Ableitung von Retinapigmentepithel-Zellen aus Stammzellen

Schnelle, gezielte Differenzierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen embryonalen oder induzierte pluripotente Stammzellen

Definierten Xeno-frei und Feeder-freie Kulturbedingungen für die Generation der menschlichen iPSC-abgeleitete Retinal Zellmodellen

Engineering-Transplantation geeignet retinalen Pigment Epithel Gewebe abgeleitet aus humanen embryonalen Stammzellen

Darstellende Subretinale Injektionen in Nagetiere zu retinalen Pigmentepithelzellen in Suspension liefern

Erzeugung retinaler Organoide aus gesunden und netzhautspezifischen, human-induzierten pluripotenten Stammzellen

Erzeugung neuronaler Netzhaut aus humanen pluripotenten Stammzellen

Erzeugung neuronaler Netzhaut aus humanen pluripotenten Stammzellen

Erzeugung neuronaler Netzhaut aus humanen pluripotenten Stammzellen

MicroRNA Expressionsprofile der Menschen iPS-Zellen, Retinapigmentepithel Abgeleitet aus iPS und Fetal Retinapigmentepithel