Name: deriving retinal pigment epithelium (rpe) from induced pluripotent stem (ips) cells by different sizes of embryoid bodies
Uploaded: 2015-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
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The opinions or assertions contained herein are the private views of the authors and are not to be construed as official or as reflecting the views of the Department of the Army or the Department of Defense. This research was performed while the authors Alberto Mu&#241;iz, Ramesh R Kaini, Whitney A Greene and Jae-Hyek Choi held a National Research Council Postdoctoral Research Associateship at the USAISR. This work was supported by U.S. Army Clinical Rehabilitative Medicine Research Program (CRMRP) and Military Operational Medicine Research Program (MOMRP).

문화 시약 및 문화 플레이트 1. 준비 <ol><li> 줄기 세포 기초 배지 400㎖의 5 배의 무 혈청 보충 100 ㎖를 첨가하여 피더없는 줄기 세포 배양 배지를 준비한다. 매체는 최대 2 주 동안 4 ℃에서 6 개월 -20 ° C에서 안정적이다. </li><li> RHO 관련, 코일 코일 포함하는 단백질 키나제 (락) 억제제 (Y-27362)에 시중에서 판매하는 배아 체 (EB) 형성 매체의 10 μm의 솔루션을 추가합니다. </li><li> (둘 베코 변형 이글 보통 / 영양소 혼합물 F-12 0.1 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, 0.1 mM의 비 필수 아미노산, 2 mM L- 글루타민, 10 % 녹아웃 혈청 교체 (KSR) 및 10 ㎍ / ml의 겐타 마이신을 첨가하여 DMEM을 분화 배지를 준비 / F12). </li><li> 1X N1 보충제, 0.1 mM의 비 필수 아미노산, 250 ㎍ / ml의 타우린 13 NG / ㎖ triiodo-L-로닌 나트륨 염, 20 NG / ㎖의 하이드로 코르티손, 5 ㎍ / ml의 겐타 마이신, 및 15 %를 첨가하여 만능-RPE 미디어를 준비 소 태아 혈청 (FBS) &lt;SUP&gt; 최소 필수 중간 이글 (MEM) 21. 7.4 pH를 조정합니다. </li><li> triiodo-L-티 로닌 나트륨 염 주식 솔루션을 준비합니다. 부드럽게 선회하여 1 N 수산화 나트륨에 triiodo-L-로닌 나트륨 염 1mg을 녹인다. MEM 49 ㎖를 triiodo-L-로닌 나트륨 염을 50ml의 20 ㎍ / mL로. 분취 량을 준비하고 필요할 때까지 -20 ° C에서 동결. 최종 배지에서 원하는 농도를 달성하기 위해 적절한 양을 사용한다. </li><li> 하이드로 주식 솔루션을 준비합니다. 교반과 100 % 에탄올 1 ㎖에 1 mg의 하이드로 코르티손을 가용화. MEM 19 ㎖를 20 ㎖ 하이드로 코르티손 원액 ㎍ / ㎖의 (50)을 추가합니다. -20 ° C에서 나누어지는 및 동결이 필요할 때까지. 최종 배양액의 목적하는 농도를 달성하기 위해 적절한 양을 사용한다. </li><li> DMEM / F12 1 ㎎ / ㎖의 디스 파제의 작업 솔루션을 준비합니다. </li><li> 매트릭스 코팅 된 플레이트의 제조 <ol><li> Engelbreth-홀름 - 스웜 (EHS)에서 추출한 단백질 매트릭스 양해 각서 (MOU)를 준비0.08 ㎎ / ㎖에 DMEM / F12에서 자체 육종 세포. 매트릭스 코트 액 1 mL를 6- 웰 플레이트의 각 웰. 1 시간 동안 실온에서 코팅 된 플레이트를 인큐베이션. </li><li> 1 시간 배양 후, 여분의 DMEM / F12를 대기음. 웰의 건조를 방지하기 위하여 피더없는 줄기 세포 배양액 0.5ml를 추가. 매트릭스 코팅 된 플레이트를 사용할 준비가되었습니다. </li></ol></li><li> DMEM / F12 2 ㎖ 잘 각을 세척하여, 마이크로 웰 플레이트를 준비합니다. DMEM / F12를 제거하고 각 잘하는 락 억제제와 보충 EB 형성 매체의 0.5ml를 추가합니다. 5 분 모든 공기 방울을 제거하기 위해 2000 XG에 플레이트를 원심 분리기. </li><li> 인산 완충 식염수 (PBS)에 아 지드 화 나트륨을 2 % FBS를 혼합하여 FACS 염색 버퍼를 준비하고, 0.09 %. pH가 7.4로 버퍼를 조정합니다. </li><li> DMEM / F12, 10 % FBS를 첨가함으로써 트립신 중화 용액을 준비한다. </li></ol> 2. 만능 문화 <ol><li> 유도 만능 줄기 세포 파종하기 전에 따뜻한 공급 장치가없는 줄기 세포 배양 37 ° C 중간, 그리고 엄마가TRIX 판을 준비 코팅. </li><li> 빠르게 37 ° C의 물을 욕조에 IMR90-1 만능 줄기 세포를 해동. 그런 다음 물을 욕조에서 극저온 유리 병을 제거하고 70 % 에탄올로 유리 병을 닦습니다. 세포 덩어리의 파괴를 최소화하기 위해 2 ㎖의 피펫을 사용하여 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송합니다. </li><li> 적가 따뜻한 피더 세포에 무 줄기 세포 배양 배지 5 ㎖를 첨가하고 부드럽게 혼합한다. RT에서 5 분 300 XG에서 세포를 원심 분리기와 뜨는을 제거합니다. </li><li> 조심 피더없는 줄기 세포 배양 배지 2 ㎖로 세포를 재현 탁하고 덩어리 매트릭스 코팅 플레이트의 웰에 세포 덩어리를 시드. 5 % CO 2, 95 % 습도가 37 ° C를 인큐베이터에 접시를 놓습니다. </li><li> 매일 만능 줄기 세포 배양 배지를 변경합니다. 파종 후 미분화 식민지에게 5-7일을 준수하십시오. 광학 현미경 아래로 (고밀도 센터와 식민지)에 대한 준비가 미분화 식민지를 확인합니다. </li></ol> 유도 만능 줄기 세포의 3과 Passaging <ol><li> 처음으로 통과하기 전의 IPS 세포는 수욕 중에서 37 ° C로 디스 파제 용액, DMEM / F12 및 피더없는 줄기 세포 배양 배지를 가온. </li><li> 유도 만능 줄기 세포를 계대하기 전에 지역을 긁고 매체를 흡입하여 차별화의 영역을 제거합니다. 조심스럽게 2 ml의 DMEM / F12와 유도 만능 줄기 세포를 씻어. </li><li> / ㎖ 디스 파제 각 웰에 1 mg을 1 ㎖를 추가하고 7 분 37 ° C에서 품어. 디스 파제를 대기음 부드럽게 DME​​M / F12 두 배의 2 ml의 세포 식민지를 씻어. 세척 후, 각 웰에 무 피더 줄기 세포 배양액 2 ㎖를 추가한다. </li><li> 5 ㎖의 피펫을 사용하여 부드럽게 세포 덩어리를 형성하기 위해 판의 식민지를 긁어. 15 ML 원뿔 관에 분리 된 세포 덩어리를 전송합니다. 세포의 다음 구절을 시드하는 충분한 공급이없는 줄기 세포 배양 배지를 추가합니다. </li></ol> 마이크로 웰 플레이트를 사용하여 사채의 4 세대 <ol><li> IPS 세포의 단일 세포 현탁액의 제조 <ol><li> mediu 제거유도 만능 줄기 세포로부터 m과 DMEM / F12의 2 ml로 유도 만능 줄기 세포를 씻어. 6 웰 플레이트에서 유도 만능 줄기 세포에 accutase 750 μl를 추가합니다. 셀 플레이트 (약 5-10 분)에서 분리 할 수 있도록 37 ° C, 5 % CO 2에서 세포를 배양한다. </li><li> 부드럽게 남아있는 세포를 해리 피펫을 사용하고 플레이트 표면에 남아있는 세포를 분리. 50 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송합니다. DMEM / F12 5 ㎖와 함께 접시를 씻어 원뿔 튜브에 세포를 세척 DMEM / F12을 결합한다. 가능한 잔여 세포 덩어리를 제거하기 위해 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 전달합니다. </li><li> accutase을 제거하기 위해 RT에서 5 분 동안 300 XG에서 세포를 원심 분리기. 세포 농도가 약 0.5 내지 1.0 × 10 7 세포 / ㎖가되도록 EB 형성 매질에서 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 트립 판 블루 및 혈구와 세포를 계수하여 생존 세포의 수를 결정한다. </li></ol></li><li> Adjustin마이크로 웰 g의 셀 밀도는 크기 제어 사채를 형성 <ol><li> EB 원하는 크기를 생성하는 마이크로 웰 플레이트의 각 웰에 셀의 수를 조정한다. 균등 부드럽게 세포를 여러 번 피펫 팅하여 세포를 분산 단계에서 제조 된 1.9 마이크로 웰 플레이트에 셀을 추가한다. 참고 : 잘 당 마이크로 웰의 EB의 X 번호 당 세포의 잘 당 필요한 세포의 수 = 원하는 번호. </li><li> 2.0 ml의 최종 부피로 우물에 바위 억제제와 보충 EB 형성 매체를 조정합니다. 부드럽게 각 피펫 팅 잘하여 세포를 재분배. 3 분 동안 100 XG에서 마이크로 웰 플레이트를 원심 분리기. 5 % CO 2, 24 시간 동안 95 %의 습도가 37 ° C에서 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. </li></ol></li><li> 마이크로 웰 플레이트에서 수확 사채 <ol><li> 잘 사채의 대부분을 제거하는 1 ml의 micropipettor와 상하 매체를 피펫 팅 마이크로 웰에서 수확 사채. 역 40 μm의 세포를 통해 EB 서스펜션 전달50 ML 원뿔 튜브의 상단에 스트레이너는 하나의 세포를 제거합니다. </li><li> 모든 사채를 제거하는 DMEM / F12의 1 ml의 마이크로 웰 플레이트 5 회 반복한다. 세척을 수집하고 반전 셀 스트레이너를 통해 전달합니다. 새로운 50 ML 원뿔 튜브까지 셀 스트레이너 오른쪽으로 돌립니다. EB 형성 매체로 세척하여 사채를 수집합니다. 수율을 결정하기 위해 사채를 계산합니다. </li></ol></li></ol> 5. 도금 사채 및 초기화 차별화 <ol><li> &lt;1000 사채 /의 밀도에 잘 EB 형성 매체 플러스 10 μM 바위 억제제 (단계 1.8.1에서와 같이) 여섯 잘 접시를 코팅 단백질 매트릭스에 사채 플레이트. 5 % CO 2, 24 시간 동안 95 %의 습도가 37 ° C에서 사채를 품어. </li><li> 24 시간 EB 도금 후, 분화를 시작하기 위해 차별화 매체로 교체합니다. 세포가 추가 분석을 위해 수집 될 때까지 매일 분화 매체의 절반을 변경합니다. </li><li> RT-PCR을 수행하기 위해 6 일, 17, 29 및 60 ℃에서 샘플을 수집, IMMunocytochemistry 및 FACS는 특성 RPE 유전자와 단백질의 발현을 확인합니다. </li></ol> 6. RNA 추출 및 PCR <ol><li> 시중에서 판매되는 키트에 제공된 지침에 따라 EB 샘플에서 RNA를 추출합니다. 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도를 측정. </li><li> cDNA를 역 전사 키트 시판 RNA에 따라 총 RNA 100 NG에 역전사를 수행합니다. </li><li> cDNA를 10 μmol / 10 NG의 농도 10ng의 cDNA를 다음의 프라이머를 사용하여 (표 1)로 PCR을 수행한다. 다음과 같이 PCR을 설정 : 5 분 동안 95 ° C에서 DNA를 변성, 72 ℃에서 최종 사이클 뒤에 30 초, 1 분, 72 ° C에 대해 15 초 동안 95 ° C에서 35 사이클과 60 ° C를 증폭 10 분간 C. 1 % 아가로 오스 겔에 PCR 제품을 실행합니다. </li></ol> 7. 면역 세포 화학 <ol><li> RT에서 PBS로 2 회 교환 사채를 씻으십시오. 4 % paraformald에 실온에서 EBS을 (를) 수정10 분 동안 ehyde. RT 한 번 PBS로 씻어. 4 ° C에서 PBS에 보관 샘플 염색에 사용되는 때까지. </li><li> 염색 날, 고정 및 투과성으로 시약 고정 된 세포를 취급합니다. RT에서 1 시간 동안 (투과성으로 용액에 10 % 염소 혈청) 차단 용액과 샘플을 인큐베이션. </li><li> 표시된 희석에서 다음 일차 항체를 사용하여 투과성으로 용액에 10 % 염소 혈청으로 면역 화학을 수행 안티 PAX6을 (1:10), 안티 RX (1 : 200), 안티 MITF (1:30)을 수행하고, 항 - ZO1 (1 : 100). 4 ° C에서 항체 O / N 대응과 샘플을 품어. </li><li> 다음날, 세포로부터 차 항체를 제거하고 PBS로 세 번 샘플을 헹군다. 실온에서 1 시간 동안 형광 접합 된 이차 항체와 샘플을 품어. </li><li> 세포에서 차 항체를 제거하고 PBS에서 샘플을 세 번 헹군다. 커버가 장착 매체를 포함 DAPI와 유리 슬라이드에 미끄러 져 마운트 및 샘플 어두운 챔버에서 O / N을 설정할 수 있습니다.염색을 시각화하기 위해 형광 현미경을 사용합니다. </li></ol> FACS 분석 8. 염색 <ol><li> PBS에 두 번 배양 사채을 씻으십시오. 단일 세포 현탁액을 5 ~ 10 분 동안 0.25 % 트립신 0.5 mL를 사채를 품어. 트립신 중화 용액 트립신 (1 ㎖ / 웰)을 중화. </li><li> 10 분 동안 600 XG에 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 단일 세포 현탁액을 전송합니다. </li><li> 상층 액을 제거하고 튜브에 세포를 DMEM / F12 10 ㎖를 추가합니다. 부드럽게 세포를 섞어 반전. 600 × g에서 원심 분리기. 원심 분리 후, 상청액을 폐기하고 FACS 염색 버퍼에 세포를 재현 탁. </li><li> 세포의 총 수를 계산. 10 분 동안 600 XG에 원심 분리기. 원심 분리 폐기 뜨는 후. 즉시 4 % 파라 포름 알데히드 0.5ml를 첨가하여 세포를 고정. 부드러운 소용돌이로 교반하여 잘 섞는다. 20 분 동안 4 ° C에서 세포를 품어. </li><li> 10 분 동안 600 XG에 원심 분리기 및 제거상층 액. 소용돌이 부드럽게 세포 펠렛을 방해합니다. 냉장 된 투과성으로 용액 1 ㎖를 첨가하여 세포를 Permeabilize 하시려면. 소용돌이 부드럽게 섞어 30 분 동안 얼음에 품어. </li><li> 10 분 동안 600 XG에서 원심 분리기와 뜨는을 제거합니다. FACS 염색 버퍼에 resuspend 3 ㎖를 추가합니다. 한 번 더에 대해이 단계를 반복합니다. 5 × 106 세포 / ml의 최종 농도 FACS 염색 버퍼에 세포를 재현 탁. </li><li> 각각의 미세 원심 튜브에 세포 현탁액 (0.5 × 10 6 세포)의 100 μl를 전송하고 차 항체의 권장 용량을 추가 할 수 있습니다. PAX6를 들어, 세포 현탁액 100 ㎕에 PE 방지 PAX6의 5 μl를 추가합니다. MITF를 들어, 세포 현탁액 100 ㎕에 방지 MITF의 5 μl를 추가합니다. </li><li> 혼합하고 60 분 동안 실온에서 배양한다. FACS 염색 버퍼의 3 ML을 추가합니다. 10 분 동안 600 XG에서 혼합하고 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 두 개의 추가 회 8.16를 반복합니다. </li><li> MITF 염색의 경우, 보조 antibo에서 세포를 배양DY, 하나의 희석에 염소 항 - 마우스 알렉사 형석 488 : 4 ° C에서 1 시간 동안 2000. PAX6 염색의 경우,이 단계를 피할 수 있습니다. </li><li> 10 분 동안 600 XG에서 FACS 염색 버퍼와 원심 분리기의 5 ml의 세포를 씻으십시오. 두 번 더에 대해이 과정을 반복합니다. </li><li> 세포 펠렛을 방해 부드럽게 FACS 염색 버퍼 및 500 μl의 소용돌이에 세포를 재현 탁. 샘플은 유세포 분석을위한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 9. 만능 줄기-RPE의 분리 및 문화 <ol><li> 하루에 29에서주의 깊게 200 μL 피펫 팁을 사용하여 배양 용기에서 선택한 색소 식민지 주위에 잘라. 15 ML 원뿔 튜브에 떠있는 식민지를 전송합니다. 실온에서 10 분 동안 600 XG에 식민지를 원심 분리기와 뜨는을 제거합니다. </li><li> 10 분 동안 600 XG에 DMEM / F12 원심 10ml에 세포를 재현 탁 콜로니. 상층 액을 제거합니다. </li><li> 7-10 분 동안 37 ℃에서 0.25 % 트립신과 2 ml의 콜로니를 배양하여 단일 세포 현탁액을 제조. 조심스럽게 식민지를 해리 세포 현탁액을 소용돌이. </li><li> 만능-RPE 배지 2 ㎖를 첨가하여 트립신을 중화. 10 분 동안 600 XG에 원심 분리기 상층 액을 버린다. 만능-RPE 배지 2 ㎖로 단일 세포를 재현 탁. 37 ° C, 5 % CO 2 및 95 % 습도 인큐베이터에서 단백질 기질 코팅 6- 웰 플레이트 제자리 세포 이동. </li></ol>

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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forced+aggregation+of+defined+numbers+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+fosters+robust,+reproducible+hematopoietic+differentiation.">Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation.</a> Blood. 106 (5), 1601-1603 (2005).</li><li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue.">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

세포 치료 용 다 능성 줄기 세포의 전체 약속을 실현하기 위해서는, 일관되고 재생 가능한 방법으로 분화를 조절하는 것이 필요하다. 이 보고서는, 마이크로 웰 플레이트 기술을 사용하여 크기 조절 사채를 형성 RPE으로 분화를 시작하고 RPE의 단백질과 유전자 마커를 식별하기 위해 프로토콜을 설명합니다. 체외 분화를 동기화하려면, 사채의 균일 한 크기는 강제로 집계하여 마이크로 웰 플...

유도 된 다 능성 줄기 (IPS) 세포 외적 요인으로 성인 1 셀 재 프로그래밍에 의해 도출 된 다 능성 줄기 세포의 유형이다. 대조적으로, 배아 줄기 세포 (는 ESC), 다 능성 줄기 세포의 다른 유형은, 2-3 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 생성된다. 서로 다른 기원에도 불구하고, 유도 만능 줄기 세포와는 ESC는 체외에서 어떤 세포 유형 4-5로 분화하는 능력에 복제 할 수있는 자신의 무제한 용량의 비교입니다. 유도 만능 줄기 세포의 이러한 특성은 그들에게 개인화 된 재생 의학의 애플리케이션에 이상적 후보를합니다. 최근의 연구 노력은 망막 색소 상피 (RPE) 6-11 포함 전문 성인 세포를 제조하기위한 강력한 분화 프로토콜 개발에 초점을 맞추고있다. 만능 줄기 세포 유래의 잠재적 임상 적용의 경우, 특정 세포 유형에 대한 지시 분화 필수적이다. 여러 가지 방법이 있습니다효율성 6-7, 12-16으로 크게 변화 RPE에 모두는 ESC와 유도 만능 줄기 세포의 직접 분화 발표했다. 우리는 여전히 개발 또는 분화하는 동안 세포 / 조직의 운명을 지배하는 분자 이벤트의 많은 모른다. 최근 몇년 최대한 학적 개발을 모방 할 수 분화 프로토콜을 개발하기위한 노력이 이루어지고있다. 배반포 단계에서 줄기 세포의 커밋되지 않은 인구는 세 가지 차원 미세 환경에서 함께합니다. 따라서, 다양한 전략이 함께 조립 ESC / 만능 줄기 세포를 만들어 입체적으로 그들을 성장에 적용되었다. 이러한 줄기 세포 집합체는 배아 체 (사채)이라고합니다. 연구는 줄기 세포의 분화 EB는 배아 발달의 초기 단계를 모사하고 자발적 외면에 원시 내배엽을 야기 할 수 있음을 보여 주었다. EB 개발이 진행됨에 따라 나중에 세 생식 계통의 분화 된 세포의 표현형은 17 ~ 18이 나타납니다. 목erefore, 사채를 기반으로 차별화 프로토콜은 ESC / 유도 만능 줄기 세포의 체외 분화에 대한 많은 관심을 끌었다 및 다 능성 줄기 세포 (13)에서 RPE 생성을위한 좋은 후보입니다했다. 사채는 ESC / IPS 세포에서 여러 가지 방법을 사용하여 제조 될 수있다. 처음에는 사채가 부착 식민지를 긁어 및 비 부착 서스펜션 문화를 유지함으로써 이루어졌다. 그러나이 방법은 낮은 재현성이 발생 사채의 이기종 인구를 산출한다. 매달려 드롭 세포 배양 및 마이크로 웰 기반 사채 형성은 매우 재현성 정의 크기의 균일 한 사채를 얻을 사채 형성을위한 다른 인기있는 기술이다. 또한, 마이크로 웰 기법은 적은 노력으로 많은 수의 집합체를 얻을 수있다. 사채 내에서 세포의 분화는 세포와 세포 내 미세 환경에서 형태 형성 큐의 멀티 플렉스에 의해 조절된다. 월의 차별화는 대조적으로olayer 형식, 교환 사채는 세포의 복잡한 어셈블리 (17)를 발생하는 세포 간 신호 전달을위한 플랫폼을 제공합니다. 흥미롭게도, 개별 EB를 만드는 데 사용 능성 줄기 세포의 수는 세포의 운명에 영향을 관찰 하였다. 1000 셀 EB는 적혈구 계보 (20)을 향해 밀어 반면 예를 들어, 인간는 ESC의 조혈 분화 연구에서, 그것은 500 셀 EB는 골수 계통으로 분화를 촉진하는 것이 관찰되었다. 또 다른 연구에서, 작은 사채는 신경 외배엽 분화 (11), (17)으로 승진 큰 사채 반면 내배엽 분화를 선호. 이러한 과거의 연구는 개개의 EB를 강하게 만드는 데 사용 ESC / IPS 세포의 수는 임의의 유형의 세포로 분화를 기반에 영향을 사채 제안. 그러나, 우리의 지식, RPE으로 차별화하기 위해 성향에 사채 크기의 영향을 규명 한 전류 연구는 없다. 본 연구의 목표의 영향을 특성화하는 것이다망막 색소 상피 세포 (IPS-RPE) 분화 및 망막 색소 상피 혈통을 지향 차별화 사채을 할 수있는 최적의 세포 수를 확인하는 - 유도 만능 줄기 (IPS) 세포에 EB 크기입니다.

<table><tbody><tr><td>mTeSR1 media + 5x supplement</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (Rock Inhibitor)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M-7154</td><td></td></tr><tr><td>Non essential amino acids</td><td>Hyclone(Fisher)</td><td>SH30853.01</td><td></td></tr><tr><td>Knockout serum replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>MEM media</td><td>Life Technologies</td><td>10370-021</td><td></td></tr><tr><td>N1 supplement</td><td>Sigma</td><td>N-6530-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>T-8691-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma</td><td>H0888-1G</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Hyclone(Fisher)</td><td>SH3008803HI</td><td></td></tr><tr><td>Triiodo-L-thyronine sodium&amp;nbsp; salt</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Hyclone(Fisher)</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Aggrewell 400 plate</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>27940</td><td></td></tr><tr><td>AggreWell medium</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5893</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-PAX6 antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-RX antibody</td><td>Abcam</td><td>Ab23340</td><td></td></tr><tr><td>Mouse&amp;nbsp; Anti-MITF antibody</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-772-P</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-ZO-1 antibody</td><td>Invitrogen</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy plus mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>PCR master mix</td><td>Promega</td><td>M7502</td><td></td></tr><tr><td>High capacity RNA to cDNA kit</td><td>Life Technologies</td><td>4387406</td><td></td></tr></tbody></table>

deriving retinal pigment epithelium (rpe) from induced pluripotent stem (ips) cells by different sizes of embryoid bodies

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of techniques to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has generated interest and excitement towards the possibility of customized personal regenerative medicine. However, the efficiency of stem cell differentiation towards a desired lineage remains low. The purpose of this study is to describe a protocol to derive retinal pigment epithelium (RPE) from iPS cells (iPS-RPE) by applying a tissue engineering approach to generate homogenous populations of embryoid bodies (EBs), a common intermediate during in vitro differentiation. The protocol applies the formation of specific size of EBs using microwell plate technology. The methods for identifying protein and gene markers of RPE by immunocytochemistry and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) are also explained. Finally, the efficiency of differentiation in different sizes of EBs monitored by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of RPE markers is described. These techniques will facilitate the differentiation of iPS cells into RPE for future applications.

이 실험에서, 유도 만능 줄기 세포는 배양 및 사채의 망막 색소 상피 계보로 분화. 제어 된 크기의 마이크로 웰 플레이트는 EB를 이용하여 형성 하였다. 도 1 EB 형성에서 보이는 바와 같이 마이크로 웰 플레이트에서 균일했다. 이러한 사채 후 (도 2)를 수집하고, 6 웰 플레이트에 플레이 팅 하였다. RPE는 RPE 마커들은 고전 육각 형태, 착색 및 발현에 의해...

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Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

이 보고서의 목적은 배아 체의 다른 크기를 이용하여 유도 된 다 능성 줄기 (IPS) 세포로부터 망막 색소 상피 (RPE)를 도출하는 프로토콜을 기술한다.

배아의 몸의 다른 크기에 의해 유도 다 능성 줄기에서 망막 색소 상피 세포 (RPE)를 도출 (IPS) 세포

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

deriving-retinal-pigment-epithelium-rpe-from-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

10.5K 조회수.  U.S. Army Institute of Surgical Research.  이 보고서의 목적은 배아 체의 다른 크기를 이용하여 유도 된 다 능성 줄기 (IPS) 세포로부터 망막 색소 상피 (RPE)를 도출하는 프로토콜을 기술한다. 

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Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포의 효율적인 유도

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

연구

발생학

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of human-induced pluripotent stem cells (iPSCs) is particularly attractive for neurodegenerative disease studies, including retinal dystrophies, where iPSC-derived retinal cell models mark a major step forward to understand and fight blindness. In this paper, we describe a simple and scalable protocol to generate, mature, and cryopreserve retinal organoids. Based on medium changing, the main advantage of this method is to avoid multiple and time-consuming steps commonly required in a guided differentiation of iPSCs. Mimicking the early phases of retinal development by successive changes of defined media on adherent human iPSC cultures, this protocol allows the simultaneous generation of self-forming neuroretinal structures and retinal pigmented epithelial (RPE) cells in a reproducible and efficient manner in 4 weeks. These structures containing retinal progenitor cells (RPCs) can be easily isolated for further maturation in a floating culture condition enabling the differentiation of RPCs into the seven retinal cell types present in the adult human retina. Additionally, we describe quick methods for the cryopreservation of retinal organoids and RPE cells for long-term storage. Combined together, the methods described here will be useful to produce and bank human iPSC-derived retinal cells or tissues for both basic and clinical research.

The production of specialized retinal cells from pluripotent stem cells is a turning point in the development of stem cell-based therapy for retinal diseases. The present paper describes a simple method for an efficient generation of retinal organoids and retinal pigmented epithelium for basic, translational, and clinical research.

정의 된 이종 무료 및 급지대 무료 문화 세대의 인간 iPSC 파생 된 망막 세포 모델에 대 한

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms of retinitis pigmentosa (RP) and age-related macular degeneration (AMD). Cell therapy is one of the most promising therapeutic strategies proposed to cure these diseases, with already encouraging preliminary results in humans. However, the method of preparation of the graft has a significant impact on its functional outcomes in vivo. Indeed, RPE cells grafted as a cell suspension are less functional than the same cells transplanted as a retinal tissue. Herein, we describe a simple and reproducible method to engineer RPE tissue and its preparation for an in vivo implantation. RPE cells derived from human pluripotent stem cells are seeded on a biological support, the human amniotic membrane (hAM). Compared to artificial scaffolds, this support has the advantage of having a basement membrane that is close to the Bruch&#39;s membrane where endogenous RPE cells are attached. However, its manipulation is not easy, and we developed several strategies for its proper culturing and preparation for grafting in vivo.

We describe a method to engineer a retinal tissue composed of retinal pigment epithelial cells derived from human pluripotent stem cells cultured on top of human amniotic membranes and its preparation for grafting in animal models.

인간 배아 줄기 세포에서 파생 된 이식 적합 한 망막 색소 상피 조직 공학

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE provide critical support for photoreceptors and death or dysfunction of RPE cells is characteristic of age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in people age 55 and older. While no cure for AMD has been identified, implantation of healthy RPE in diseased eyes may prove to be an effective treatment, and large numbers of RPE cells can be readily generated from pluripotent stem cells. Several interesting questions regarding the safety and efficacy of RPE cell delivery can still be examined in animal models, and well-accepted protocols used to inject RPE have been developed. The technique described here has been used by multiple groups in various studies and involves first creating a hole in the eye with a sharp needle. Then a syringe with a blunt needle loaded with cells is inserted through the hole and passed through the vitreous until it gently touches the RPE. Using this injection method, which is relatively simple and requires minimal equipment, we achieve consistent and efficient integration of stem cell-derived RPE cells in between the host RPE that prevents significant amount of photoreceptor degeneration in animal models. While not part of the actual protocol, we also describe how to determine the extent of the trauma induced by the injection, and how to verify that the cells were injected into the subretinal space using in vivo imaging modalities. Finally, the use of this protocol is not limited to RPE cells; it may be used to inject any compound or cell into the subretinal space.

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

서스펜션에 망막 색소 상피 세포를 제공하기 위해 설치류에서 망막 주사를 수행

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

의학

Generation of Retinal Organoids from Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Pluripotent stem cells can generate complex tissue organoids that are useful for in vitro disease modeling studies and for developing regenerative therapies. This protocol describes a simpler, robust, and stepwise method of generating retinal organoids in a hybrid culture system consisting of adherent monolayer cultures during the first 4 weeks of retinal differentiation till the emergence of distinct, self-organized eye field primordial clusters (EFPs). Further, the doughnut-shaped, circular, and translucent neuro-retinal islands within each EFP are manually picked and cultured under suspension using non-adherent culture dishes in a retinal differentiation medium for 1-2 weeks to generate multilayered 3D optic cups (OC-1M). These immature retinal organoids contain PAX6+ and ChX10+ proliferating, multipotent retinal precursors. The precursor cells are linearly self-assembled within the organoids and appear as distinct radial striations. At 4 weeks after suspension culture, the retinal progenitors undergo post-mitotic arrest and lineage differentiation to form mature retinal organoids (OC-2M). The photoreceptor lineage committed precursors develop within the outermost layers of retinal organoids. These CRX+ and RCVRN+ photoreceptor cells morphologically mature to display inner segment-like extensions. This method can be adopted for generating retinal organoids using human embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs). All steps and procedures are clearly explained and demonstrated to ensure replicability and for wider applications in basic science and translational research.

This protocol describes an efficient method of differentiating hiPSCs into eye field clusters and generating neuro-retinal organoids using simplified culture conditions involving both adherent and suspension culture systems. Other ocular cell types, such as the RPE and corneal epithelium, can also be isolated from mature eye fields in retinal cultures.

Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells에서 망막 오가노이드 생성

Pluripotent stem cells can generate complex tissue organoids that are useful for in vitro disease modeling studies and for developing regenerative ...

인간 배아 줄기 세포에서 향상된 3D 신경 망막 분화

Generating Neural Retina from Human Pluripotent Stem Cells

Retinopathy is one of the main causes of blindness worldwide. Investigating its pathogenesis is essential for the early diagnosis and timely treatment of retinopathy. Unfortunately, ethical barriers hinder the collection of evidence from humans. Recently, numerous studies have shown that human pluripotent stem cells (PSCs) can be differentiated into retinal organoids (ROs) using different induction protocols, which have enormous potential in retinopathy for disease modeling, drug screening, and stem cell-based therapies. This study describes an optimized induction protocol to generate neural retina (NR) that significantly reduces the probability of vesiculation and fusion, increasing the success rate of production until day 60. Based on the ability of PSCs to self-reorganize after dissociation, combined with certain complementary factors, this new method can specifically drive NR differentiation. Furthermore, the approach is uncomplicated, cost-effective, exhibits notable repeatability and efficiency, presents encouraging prospects for personalized models of retinal diseases, and supplies a plentiful cell reservoir for applications such as cell therapy, drug screening, and gene therapy testing.

저자 스포트라이트: 질병 모델링을 위한 간단하고 효율적인 신경 망막 오가노이드 생산

The present protocol describes an optimized 3D neural retina induction system that reduces the adhesion and fusion of retinal organoids with high repeatability and efficiency.

인간 만능 줄기세포에서 신경 망막 생성

Retinopathy is one of the main causes of blindness worldwide. Investigating its pathogenesis is essential for the early diagnosis and timely treatment of ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human iPS cells (iPS-RPE), and fetal RPE. The protocols include collection of RNA for analysis by microarray, and the analysis of microarray data to identify miRNAs that are differentially expressed among three cell types. The methods for culture of iPS cells and fetal RPE are explained. The protocol used for differentiation of RPE from human iPS is also described. The RNA extraction technique we describe was selected to allow maximal recovery of very small RNA for use in a miRNA microarray. Finally, cellular pathway and network analysis of microarray data is explained. These techniques will facilitate the comparison of the miRNA profiles of three different cell types.

The microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human induced-pluripotent stem (iPS) cells (iPS-RPE), and fetal RPE, were compared.

인간 iPS 세포의 마이크로 RNA 발현 프로파일, IP의 유래 망막 색소 상피 세포, 태아의 망막 색소 상피

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

배아의 몸의 다른 크기에 의해 유도 다 능성 줄기에서 망막 색소 상피 세포 (RPE)를 도출 (IPS) 세포

요약

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줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포의 효율적인 유도

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

정의 된 이종 무료 및 급지대 무료 문화 세대의 인간 iPSC 파생 된 망막 세포 모델에 대 한

인간 배아 줄기 세포에서 파생 된 이식 적합 한 망막 색소 상피 조직 공학

서스펜션에 망막 색소 상피 세포를 제공하기 위해 설치류에서 망막 주사를 수행

Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells에서 망막 오가노이드 생성

인간 만능 줄기세포에서 신경 망막 생성

인간 만능 줄기세포에서 신경 망막 생성

인간 만능 줄기세포에서 신경 망막 생성

인간 iPS 세포의 마이크로 RNA 발현 프로파일, IP의 유래 망막 색소 상피 세포, 태아의 망막 색소 상피