The opinions or assertions contained herein are the private views of the authors and are not to be construed as official or as reflecting the views of the Department of the Army or the Department of Defense. This research was performed while the authors Alberto Mu&#241;iz, Ramesh R Kaini, Whitney A Greene and Jae-Hyek Choi held a National Research Council Postdoctoral Research Associateship at the USAISR. This work was supported by U.S. Army Clinical Rehabilitative Medicine Research Program (CRMRP) and Military Operational Medicine Research Program (MOMRP).

1. Preparazione dei reagenti Cultura e piastre di coltura <ol><li> Preparare cellule staminali mezzo di coltura privo di alimentatore aggiungendo 100 ml di integratore senza siero 5x a 400 ml di cellule staminali medio basale. Il medium è stabile a 4 ° C per 2 settimane ed a -20 ° C per 6 mesi. </li><li> Aggiungere 10 mM soluzione di rho-associata, avvolto-coil contenente la proteina chinasi (Rock) inibitore di disponibile in commercio corpo embrioide (EB) di media formazione (Y-27362). </li><li> Preparare medio differenziazione aggiungendo 0,1 mm β-mercaptoetanolo, 0,1 mm aminoacidi non essenziali, 2 mM L-glutammina, il 10% la sostituzione siero knockout (KSR) e 10 mg / ml di gentamicina per Modified Eagle Medium / Nutrient miscela di Dulbecco F-12 (DMEM / F12). </li><li> Preparare iPS-RPE medio aggiungendo 1x N1 supplemento, 0,1 mm aminoacidi non indispensabili, 250 mg / ml taurina, 13 ng sale di sodio / ml triiodo-L-thyronine, 20 ng / ml idrocortisone, 5 mg / ml gentamicina, e il 15% siero fetale bovino (FBS) &lt;sup&gt; 21 per Minimum Essential Media Eagle (MEM). Regolare il pH a 7,4. </li><li> Preparare sodio sale stock soluzione triiodo-L-thyronine. Sciogliere 1 mg di sale sodico triiodo-L-thyronine in 1 N di idrossido di sodio agitando delicatamente. Aggiungere 49 ml di MEM per fare 50 ml di 20 ug / ml di sale sodico triiodo-L-tironina. Preparare aliquote e congelare a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. Utilizzare volume appropriato per raggiungere la concentrazione desiderata in terreno di coltura. </li><li> Preparare soluzione stock idrocortisone. Solubilizzare 1 mg di idrocortisone in 1 ml di etanolo al 100% agitando. Aggiungere 19 ml di MEM per fare 20 ml di 50 mg / ml di idrocortisone soluzione madre. Aliquotare e congelare a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. Utilizzare volume appropriato per raggiungere la concentrazione desiderata nel terreno di coltura. </li><li> Preparare una soluzione di lavoro di dispasi di 1 mg / ml in DMEM / F12. </li><li> Preparazione delle lastre matrici rivestite <ol><li> Preparare matrice proteina estratta da Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) moucellule di sarcoma di Se in DMEM / F12 a 0,08 mg / ml. Coat ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti con 1 ml di soluzione di matrice. Incubare le piastre rivestite a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Dopo l&#39;incubazione 1 ora, aspirare l&#39;eccesso DMEM / F12. Aggiungere 0,5 ml di staminali mezzo di coltura cellulare senza alimentatore per evitare l&#39;essiccazione dei pozzetti. Le piastre rivestite matrice sono pronte per l&#39;uso. </li></ol></li><li> Preparare micropiastra, sciacquando ogni pozzetto con 2 ml di DMEM / F12. Rimuovere DMEM / F12 e aggiungere 0,5 ml di media formazione EB integrato con inibitore Rock a ciascun bene. Centrifugare la piastra a 2000 xg per 5 minuti per rimuovere eventuali bolle d&#39;aria. </li><li> Preparare tampone colorazione FACS mescolando 2% FBS, e il 0,09% di sodio azide in tampone fosfato (PBS). Regolare il buffer a pH 7,4. </li><li> Preparare la soluzione neutralizzante tripsina aggiungendo 10% FBS per DMEM / F12. </li></ol> 2. iPS Cultura <ol><li> Prima della semina delle cellule iPS, caldo staminali coltura cellulare mezzo privo di alimentatore a 37 ° C, e hanno la matrix rivestito piatti pronti. </li><li> Scongelare rapidamente le cellule iPS IMR90-1 in un bagno di 37 ° C dell&#39;acqua. Quindi rimuovere la crio-vial dal bagnomaria e pulire il flacone con il 70% di etanolo. Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 ml usando una pipetta 2 ml per minimizzare rottura dei grumi di cellule. </li><li> Aggiungere 5 ml di caldo cellule staminali mezzo di coltura privo di alimentatore per le cellule goccia a goccia e mescolare delicatamente. Centrifugare le cellule a 300 xg per 5 minuti a RT e rimuovere il surnatante. </li><li> Risospendere attentamente le grumi di cellule in 2 ml di cellule staminali mezzo di coltura privo di alimentatore e seminare i grumi di cellule nei pozzetti della piastra a matrice rivestita. Porre la piastra in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2, 95% di umidità. </li><li> Modificare il terreno di coltura di cellule iPS quotidiana. Osservare colonie indifferenziate cinque a sette giorni dopo la semina. Controllare colonie indifferenziate che sono pronti per il passaggio (colonie con un centro denso) sotto un microscopio ottico. </li></ol> 3. Passaging di cellule iPS <ol><li> Per il passaggio delle cellule iPS prima di iniziare, scaldare la soluzione dispasi, DMEM / F12 e terreno di coltura di cellule staminali senza alimentatore a 37 ° C a bagnomaria. </li><li> Prima passaging cellule iPS, rimuovere le aree di differenziazione raschiando l&#39;area e di aspirazione del mezzo. Lavare accuratamente le cellule iPS con 2 ml DMEM / F12. </li><li> Aggiungere 1 ml di 1 mg / ml dispasi a ciascun pozzetto ed incubare a 37 ° C per 7 minuti. Aspirare il dispasi e lavare delicatamente le colonie di cellule con 2 ml di DMEM / F12 due volte. Dopo il risciacquo, aggiungere 2 ml di terreno di coltura di cellule staminali senza alimentatore di ogni bene. </li><li> Con una pipetta 5 ml raschiare delicatamente le colonie della piastra per formare grumi di cellule. Trasferire i grumi di cellule staccate di un tubo da 15 ml. Aggiungi staminali sufficienti terreno di coltura cellulare senza alimentatore per seminare il prossimo passaggio di cellule. </li></ol> 4. Generazione di EBs Uso micropiastra <ol><li> Preparazione di una sospensione di cellule singole cellule iPS <ol><li> Rimuovere il medium dalle cellule iPS e lavare le cellule iPS con 2 ml di DMEM / F12. Aggiungere 750 ml di accutase alle cellule iPS in ogni pozzetto della piastra 6-bene. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 per permettere alle cellule di staccarsi dalla piastra (circa 5-10 min). </li><li> Utilizzare una pipetta di dissociare delicatamente eventuali cellule residue e di staccare tutte le cellule residue sulla superficie della piastra. Trasferire le cellule in una provetta conica da 50 ml. Lavare la piastra con 5 ml di DMEM / F12 e combinare la sciacquato DMEM / F12 con le cellule nel tubo conico. Passare la sospensione cellulare attraverso un colino cella di 40 micron per eliminare eventuali grumi di cellule residue. </li><li> Centrifugare le cellule a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente per rimuovere l&#39;accutase. Risospendere il pellet di cellule in medium formazione EB in modo che la concentrazione cellulare è di circa 0,5-1,0 x 10 7 cellule / ml. </li><li> Determinare il numero di cellule vitali contando le cellule con Trypan Blue e un emocitometro. </li></ol></li><li> Adjusting densità delle cellule in pozzetti per formare EB dimensioni controllato <ol><li> Regolare il numero di cellule in ciascun pozzetto della micropiastra per generare le dimensioni EB desiderati. Aggiungere le cellule nei pozzetti delle piastre preparate in fase 1.9, Distribuire uniformemente le cellule pipettando delicatamente le cellule più volte. NOTA: Il numero di cellule necessarie per pozzetto = desiderato numero di celle per EB x numero di pozzetti per pozzetto. </li><li> Regolare il medium formazione EB integrato con inibitore Rock in pozzi per un volume finale di 2,0 ml. Ridistribuire le cellule pipettando delicatamente ogni bene. Centrifugare le piastre micropozzetti a 100 xg per 3 min. Posizionare le piastre in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2 e il 95% di umidità per 24 ore. </li></ol></li><li> EBs raccolta dei micropiastra <ol><li> Harvest EBs da pozzetti pipettando medie pozzo su e giù con un 1 ml micropipettatore per rimuovere la maggior parte EBS. Passare la sospensione EB attraverso una cella di 40 micron invertitofiltro in cima ad una provetta conica da 50 ml per rimuovere le cellule singole. </li><li> Lavare la micropiastra 5 volte con 1 ml di DMEM / F12 per rimuovere tutti i EBs. Raccogliere lavaggi e passare sopra il filtro cellulare invertita. Girare il filtro cella destra fino a un nuovo tubo conico da 50 ml. Raccogliere EBS mediante lavaggio con media formazione EB. Contare EBs per determinare la resa. </li></ol></li></ol> 5. placcatura EBs e avvio di differenziazione <ol><li> Piastra EBS sulla matrice proteica rivestito sei pozzetti (come al punto 1.8.1) con una densità di &lt;1.000 EBs / bene in mezzo formazione EB più inibitore della roccia 10 micron. Incubare EBS a 37 ° C con il 5% di CO 2 e il 95% di umidità per 24 ore. </li><li> 24 ore dopo la placcatura EB, sostituirlo con il mezzo di differenziazione per avviare la differenziazione. Cambiare metà del terreno di differenziamento a giorni fino a quando le cellule vengono raccolte per ulteriori analisi. </li><li> Raccogliere i campioni a giorno 6, 17, 29 e 60 per condurre RT-PCR, immunocytochemistry e FACS di convalidare l&#39;espressione di geni caratteristici RPE e proteine. </li></ol> 6. RNA Estrazione e PCR <ol><li> Estratto RNA da campioni EB secondo le istruzioni fornite nel kit disponibile in commercio. Determinare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro. </li><li> Eseguire la trascrizione inversa a 100 ng di RNA totale secondo disponibile in commercio RNA a cDNA kit trascrizione inversa. </li><li> Eseguire PCR con 10 ng di cDNA utilizzando i seguenti primer (tabella 1) ad una concentrazione di 10 mmol / 10 ng di cDNA. Impostare la PCR come segue: denaturare il DNA a 95 ° C per 5 min, amplificare con 35 cicli a 95 ° C per 15 sec, 60 ° C per 30 sec, 72 ° C per 1 min, seguito da un ciclo finale a 72 ° C per 10 min. Eseguire il prodotto di PCR su un gel di agarosio 1%. </li></ol> 7. Immunocitochimica <ol><li> Lavare EBS con PBS due volte a RT. Fissare EBS a RT in 4% paraformaldehyde per 10 min. Risciacquare una volta con PBS a temperatura ambiente. Conservare i campioni in PBS a 4 ° C fino a quando usati per la colorazione. </li><li> Il giorno colorazione, trattare le cellule fissate con fissaggio e permeabilizzazione reagenti. Incubare i campioni con soluzione bloccante (siero di capra 10% in soluzione permeabilizzazione) per 1 ora a RT. </li><li> Eseguire immunochimica in siero di capra 10% in soluzione permeabilizzazione utilizzando i seguenti anticorpi primari alle diluizioni indicate: anti-Pax6 (1,10), anti-RX (1: 200), anti-MITF (1,30), e anti- ZO1 (1: 100). Incubare i campioni con corrispondenti anticorpi O / N a 4 ° C. </li><li> Il giorno seguente, rimuovere l&#39;anticorpo primario dalle cellule e lavare i campioni tre volte con PBS. Incubare campioni con anticorpi secondari coniugati fluoroforo per 1 ora a RT. </li><li> Rimuovere l&#39;anticorpo secondario dalle cellule e lavare i campioni per tre volte in PBS. Montare il coperchio scivola su vetrini con DAPI contenente mezzo di montaggio e lasciare i campioni per impostare O / N in una camera oscura.Utilizzare un microscopio a fluorescenza per visualizzare la colorazione. </li></ol> 8. colorazione per l&#39;analisi FACS <ol><li> Lavare le EBs coltivate in PBS due volte. Incubare EBS con 0,5 ml di 0,25% tripsina per 5-10 minuti per fare una sospensione singola cella. Neutralizzare la tripsina con soluzione di tripsina neutralizzante (1 ml / pozzetto). </li><li> Trasferire la sospensione singola cella di un tubo da 15 ml e centrifugare a 600 xg per 10 min. </li><li> Eliminare il supernatante e aggiungere 10 ml di DMEM / F12 alle cellule nel tubo. Capovolgere delicatamente per mescolare le cellule. Centrifugare a 600 x g. Dopo centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere le cellule in tampone colorazione FACS. </li><li> Contare il numero totale di cellule. Centrifugare a 600 xg per 10 min. Dopo centrifugazione scarto surnatante. Fissare le cellule immediatamente aggiungendo 0,5 ml di 4% paraformaldeide. Mescolare bene vortexando gentilmente. Incubare le cellule a 4 ° C per 20 min. </li><li> Centrifugare a 600 xg per 10 min e rimuovere lasurnatante. Vortex delicatamente per disturbare il pellet. Permeabilize le cellule aggiungendo 1 ml di soluzione di permeabilizzazione raffreddata. Vortex delicatamente per miscelare e incubare in ghiaccio per 30 min. </li><li> Centrifugare a 600 xg per 10 min e rimuovere il surnatante. Aggiungere 3 ml di FACS buffer di colorazione e risospendere. Ripetere questo passaggio per un&#39;altra volta. Risospendere le cellule in tampone colorazione FACS ad una concentrazione finale di 5 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Trasferire 100 ml di sospensione cellulare (0,5 x 10 6 cellule) per ciascuna tubi microcentrifuga e aggiungere il volume consigliato di anticorpo primario. Per Pax6, aggiungere 5 ml di PE anti-Pax6 in 100 ml di sospensione cellulare. Per MITF, aggiungere 5 ml di anti-MITF in 100 ml di sospensione cellulare. </li><li> Mescolare e incubare a temperatura ambiente per 60 min. Aggiungere 3 ml di tampone colorazione FACS. Mescolare e centrifugare a 600 xg per 10 min. Rimuovere il surnatante e ripetere 8.16 per altre due volte. </li><li> Per MITF colorazione, incubare le cellule in Antibo secondariody, capra anti-topo Alexa Fluor 488 a una diluizione di 1: 2.000 per 1 ora a 4 ° C. Per Pax6 colorazione, evitare questo passaggio. </li><li> Lavare le cellule con 5 ml di tampone FACS colorazione e centrifugare a 600 xg per 10 min. Ripetere la procedura per altre due volte. </li><li> Risospendere le cellule in 500 ml di FACS buffer di colorazione e vortex delicatamente per disturbare il pellet. I campioni sono pronti per l&#39;analisi di citometria di flusso. </li></ol> Isolation 9. iPS-RPE e Cultura <ol><li> Al giorno 29, con attenzione tagliare intorno alle colonie pigmentate selezionati dalla piastra di coltura con un puntale 200 microlitri. Trasferire le colonie galleggianti ad un tubo da 15 ml. Centrifugare le colonie a 600 xg per 10 minuti a RT e rimuovere il surnatante. </li><li> Risospendere le colonie di cellule in 10 ml di DMEM / F12 e centrifugare a 600 xg per 10 min. Rimuovere il surnatante. </li><li> Preparare una sospensione di cellule singole incubando le colonie con 2 ml di 0,25% tripsina a 37 ° C per 7-10 min. Vortice delicatamente la sospensione cellulare dissociare le colonie. </li><li> Neutralizzare la tripsina aggiungendo 2 ml di iPS-RPE medie. Centrifugare a 600 xg per 10 minuti e scartare il surnatante. Risospendere le singole cellule in 2 ml di IPS-RPE medie. Trasferire le cellule in una matrice proteica rivestito 6 pozzetti e posto in un incubatore a 37 ° C, 5% CO 2 e il 95% di umidità. </li></ol>

<ol>
	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures.">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nat Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).</li><li>Reubinoff, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts:+somatic+differentiation+in+vitro.">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.</a> Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li><li>Buchholz, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+functional+retinal+pigmented+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).</li><li>Ukrohne, T. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+small+molecules+and+OCT4+reprogrammed+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4 reprogrammed human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Transl Med. 1 (2), 96-109 (2012).</li><li>Subba, R. M., Sasikala, M., Nageshwar, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinking+outside+the+liver:+induced+pluripotent+stem+cells+for+hepatic+applications.">Thinking outside the liver: induced pluripotent stem cells for hepatic applications.</a> World J Gastroenterol. 19 (22), 3385-3396 (2013).</li><li>Yoshida, Y., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPS+cells:+a+source+of+cardiac+regeneration.">iPS cells: a source of cardiac regeneration.</a> J Mol Cell Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).</li><li>Mak, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+greatly+improve+conversion+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+to+the+neuronal+lineage.">Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage.</a> Stem Cells Int. 2012, 140427 (2012).</li><li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+human+embryonic+stem+cell+colony+and+aggregate+size+heterogeneity+influences+differentiation+trajectories.">Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories.</a> Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).</li><li>Cour la, M., Tezel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Retinal+Pigment+Epithelium.">The Retinal Pigment Epithelium.</a> Advances in Organ Biology. 10, 253-273 (2006).</li><li>Vaajassari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+defined+and+xeno-free+differentiation+of+functional+human+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelial+cells.">Toward the defined and xeno-free differentiation of functional human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells.</a> Mol Vis. 17, 558-575 (2011).</li><li>Carr, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+human+iPS-derived+retinal+pigment+epithelium+cell+transplantation+in+the+retinal+dystrophic+rat.">Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat.</a> PLoS One. 4 (12), e8152 (2009).</li><li>Muniz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoid+uptake,+processing,+and+secretion+in+human+iPS-RPE+support+the+visual+cycle.">Retinoid uptake, processing, and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (1), 198-209 (2014).</li><li>Meyer, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+early+retinal+development+with+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (39), 16698-16703 (2009).</li><li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+embryoid+body+microenvironment+to+direct+embryonic+stem+cell+differentiation.">Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation.</a> Biotechnol Prog. 25 (1), 43-51 (2009).</li><li>Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+inducing+embryoid+body+formation:+in+vitro+differentiation+system+of+embryonic+stem+cells.">Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells.</a> J Biosci Bioeng. 103 (5), 389-398 (2007).</li><li>Itskovitz-Eldor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+compromising+the+three+embryonic+germ+layers.">Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers.</a> Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).</li><li>Ng, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forced+aggregation+of+defined+numbers+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+fosters+robust,+reproducible+hematopoietic+differentiation.">Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation.</a> Blood. 106 (5), 1601-1603 (2005).</li><li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue.">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Per realizzare pienamente le potenzialità delle cellule staminali pluripotenti per terapia cellulare, è necessario regolare la loro differenziazione in modo coerente e riproducibile. Questo rapporto descrive i protocolli per formare EB dimensioni controllato utilizzando la tecnologia micropiastre, avviare differenziazione verso RPE e identificare proteine ​​e geni marcatori di RPE. Per sincronizzare la differenziazione in vitro, misure omogenee di EBs erano formate da un numero noto di cellule iPS centrif...

Staminali pluripotenti (iPS) cellule indotti sono un tipo di cellule staminali pluripotenti derivate riprogrammando cellule adulte con fattori estrinseci 1. Al contrario, le cellule embrionali staminali (ESC), un altro tipo di cellule staminali pluripotenti, sono generati dalla massa cellulare interna della blastocisti 2-3. Nonostante le loro diverse origini, le cellule iPS e CES sono paragonabili nella loro illimitata capacità di replicare in vitro e nella loro capacità di differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula 4-5. Queste caratteristiche di cellule iPS li rendono candidati ideali per applicazioni in medicina rigenerativa personalizzata. I recenti sforzi di ricerca si concentrano sullo sviluppo di protocolli di differenziazione affidabili per la produzione di cellule adulte specializzate, tra epitelio pigmentato retinico (RPE) 6-11. Per i potenziali applicazioni cliniche delle cellule iPS derivate, una differenziazione diretta di che tipo di cellula specifica indispensabile. Ci sono vari metodipubblicato per la differenziazione diretta di entrambi i CES e iPS cellule in RPE che varia notevolmente nella loro efficienza 6-7, 12-16. Noi ancora non conosciamo molti degli eventi molecolari che governano il destino delle cellule / tessuti durante lo sviluppo o il differenziamento. Negli ultimi anni, sono stati fatti sforzi per sviluppare il protocollo di differenziazione che può imitare lo sviluppo embrionale, per quanto possibile. Durante la fase di blastocisti, la popolazione non impegnati di cellule staminali sono insieme in un microambiente tridimensionale. Così, diverse strategie sono state applicate per rendere le cellule ESC / IPS assemblati insieme e crescere in tre dimensioni. Questi aggregati di cellule staminali sono chiamati corpi embrionali (EBS). Studi hanno dimostrato che EB differenziazione delle cellule staminali imitano fase iniziale di sviluppo dell&#39;embrione e può spontaneamente dar luogo a endoderma primitivo sulla sua superficie esterna. Più tardi, lo sviluppo EB progredisce, fenotipi cellulari differenziate di tutte e tre le linee germinali appaiono 17-18. Therefore, Ebs protocolli di differenziazione basata hanno attirato molta attenzione per la differenziazione in vitro di cellule ESC / IPS e sono un buon candidato per la generazione RPE da cellule staminali pluripotenti 13. EBs possono essere effettuate utilizzando diversi metodi di cellule / iPS ESC. Inizialmente, EBs sono state fatte da raschiando colonie aderenti e il mantenimento in coltura in sospensione non aderente. Tuttavia, questo approccio produce popolazione eterogenea di EB che provoca scarsa riproducibilità. Hanging coltura cellulare goccia e microwell formazione EBs base sono altre tecniche popolari per la formazione EBs che danno EBs omogenee di dimensioni definite che sono altamente riproducibili. Inoltre, la tecnica micropozzetti può produrre gran numero di aggregati con minor sforzo. Differenziazione delle cellule all&#39;interno EBS è regolata da un multiplex di spunti morfogenici dal microambiente extracellulare e intracellulare. A differenza di differenziazione in un monFormato olayer, EBs fornire una piattaforma per complesso insieme di cellule e di segnalazione intercellulare a verificarsi 17. È interessante notare, è stato osservato il numero di cellule staminali pluripotenti utilizzati per realizzare singoli EB influenzare il destino di cellule. Ad esempio, in uno studio differenziazione ematopoietica dei CES umani, è stato osservato che 500 cellule EB promosso differenziamento verso linea mieloide che 1.000 celle EB spinto verso lineage eritroide 20. In un altro studio, EBs piccoli favorito differenziazione endoderma mentre EBs grandi promosse verso neuro-ectoderma differenziazione 11, 17. Questi studi precedenti suggeriscono che il numero di cellule ESC / iPS utilizzati per rendere le singole EB influisce EBS differenziazione in base a qualsiasi tipo di cellule. Tuttavia, a nostra conoscenza, non ci sono studi in corso che hanno chiarito l&#39;impatto di dimensioni EBs nella sua propensione a differenziare verso RPE. L&#39;obiettivo di questo studio è quello di caratterizzare l&#39;influenzaDimensioni EB su indotte pluripotenti staminali (cellule iPS) - retinico pigmentato (iPS-RPE) differenziazione e di individuare il numero di cellulare ottimale per fare EBS per la differenziazione diretta verso RPE lignaggio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="722">
	<tbody>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:239px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:183px;">Company</td>
			<td style="width:140px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:161px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mTeSR1 media + 5X supplement</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y-27632 (Rock Inhibitor)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">M-7154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Non essential amino acids</td>
			<td style="width:183px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>SH30853.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Knockout serum replacement</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Gentamicin&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">MEM media</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">10370-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">N1 supplement</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">N-6530-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Taurine</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">T-8691-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">H0888-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:183px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>SH3008803HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triiodo-l-thyronine sodium&#160; salt</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Dispase</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td>17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Matrigel</td>
			<td style="width:183px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:140px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:183px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Aggrewell 400 plate</td>
			<td style="width:183px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td>27940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">AggreWell medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Accutase</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Mouse Anti-PAX6 antibody</td>
			<td colspan="2">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Rabbit Anti- RX antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab23340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Mouse&#160; Anti-MITF antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MS-772-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Rabbit Anti-ZO-1 antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>40-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">RNeasy plus mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">PCR master mix</td>
			<td>promega</td>
			<td>M7502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">High capacity RNA to c DNA kit</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td>4387406</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deriving retinal pigment epithelium (rpe) from induced pluripotent stem (ips) cells by different sizes of embryoid bodies

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of techniques to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has generated interest and excitement towards the possibility of customized personal regenerative medicine. However, the efficiency of stem cell differentiation towards a desired lineage remains low. The purpose of this study is to describe a protocol to derive retinal pigment epithelium (RPE) from iPS cells (iPS-RPE) by applying a tissue engineering approach to generate homogenous populations of embryoid bodies (EBs), a common intermediate during in vitro differentiation. The protocol applies the formation of specific size of EBs using microwell plate technology. The methods for identifying protein and gene markers of RPE by immunocytochemistry and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) are also explained. Finally, the efficiency of differentiation in different sizes of EBs monitored by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of RPE markers is described. These techniques will facilitate the differentiation of iPS cells into RPE for future applications.

In questo esperimento, le cellule iPS sono state coltivate e differenziate nel lignaggio RPE da EBS. EBs di dimensioni controllati, sono stati formati utilizzando micropiastra. Come si vede nella figura 1 formazione EB era omogeneo nelle micropiastre. Questi EBs stati poi raccolti e piastrate su piastre da 6 pozzetti (Figura 2). RPE può essere identificato con la loro classica esagonale morfologia, pigmentazione, e l&#39;espressione di marcatori RPE. Dopo 1...

Watch this Scientific Journal Video about Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies at JoVE.com

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

L&#39;obiettivo di questa relazione è quello di descrivere i protocolli per derivare l&#39;epitelio pigmentato retinico (RPE) da staminali pluripotenti indotte (iPS), le cellule con diverse dimensioni di corpi embrionali.

Derivazione retina epitelio pigmentato (RPE) da pluripotenti indotte (IPS) Stem Cells dalle diverse dimensioni delle corpi embrionali

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

deriving-retinal-pigment-epithelium-rpe-from-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

10.5K Views.  U.S. Army Institute of Surgical Research.  L'obiettivo di questa relazione è quello di descrivere i protocolli per derivare l'epitelio pigmentato retinico (RPE) da staminali pluripotenti indotte (iPS), le cellule con diverse dimensioni di corpi embrionali. 