The opinions or assertions contained herein are the private views of the authors and are not to be construed as official or as reflecting the views of the Department of the Army or the Department of Defense. This research was performed while the authors Alberto Mu&#241;iz, Ramesh R Kaini, Whitney A Greene and Jae-Hyek Choi held a National Research Council Postdoctoral Research Associateship at the USAISR. This work was supported by U.S. Army Clinical Rehabilitative Medicine Research Program (CRMRP) and Military Operational Medicine Research Program (MOMRP).

培養試薬および培養プレートの調製<ol><li>幹細胞基礎培地400 mlに5倍の無血清補充を100mlを添加することにより無フィーダー幹細胞培養培地を準備する。培地は、最大2週間と6ヶ月間、-20℃で、4℃で安定である。 </li><li>市販の胚様体（EB）形成培地にRho関連、コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ（ROCK）阻害剤（Y-27362）の10μMの溶液を加える。 </li><li> （ダルベッコ改変イーグル培地/栄養混合物F-12に0.1 mMのβメルカプトエタノール、0.1mMの非必​​須アミノ酸、2mM L-グルタミン、10％ノックアウト血清代替物（KSR）および10μg/ mlのゲンタマイシンを添加することによりDMEMを分化培地を調製/ F12）。 </li><li> 1×N1サプリメント、0.1mMの非必​​須アミノ酸、250 / mlのタウリン、13 / mlのトリヨードLチロニンナトリウム塩、を20ng / mlのヒドロコルチゾン、5μg/ mlのゲンタマイシン、および15％添加したiPS-RPEの培地を調製ウシ胎児血清（FBS）&lt;SUP&gt;最小必須培地イーグル（MEM）に21。 7.4にpHを調整する。 </li><li>トリヨード-L-チロニンナトリウム塩ストック溶液を準備します。穏やかに回転させることによって1 N水酸化ナトリウムでトリヨード-L-チロニンナトリウム塩1mgを溶解させる。トリヨード-L-チロニンナトリウム塩20μgの/ mlの50ミリリットルを作るために、MEMの49ミリリットルを追加します。アリコートを準備し、必要になるまで-20℃で凍結する。最終培養培地中の所望の濃度を達成するために適切な容量を使用する。 </li><li>ヒドロコルチゾンストック溶液を準備します。穏やかに撹拌し、100％エタノール1ml中ヒドロコルチゾン1mgを可溶化する。 50μg/ mlのヒドロコルチゾンストック溶液20ミリリットルを作るために、MEMの19ミリリットルを追加します。必要になるまで-20℃で小分けして凍結。最終培養培地中の所望の濃度を達成するために適切な容量を使用する。 </li><li> DMEM / F12中1mg / mLのディスパーゼのワーキング溶液を準備します。 </li><li>マトリックスコーティングされたプレートの調製<ol><li> MOUエンゲルブレス·ホルム - スウォーム（EHS）から抽出したタンパク質基質を準備0.08 mg / mlでのDMEM / F12中でそれ自体肉腫細胞。コー​​トマトリックス溶液1mlを6ウェルプレートの各ウェル。室温で1時間コーティングしたプレートをインキュベートします。 </li><li> 1時間のインキュベーション後、過剰のDMEM / F12を吸引する。ウェルの乾燥を防ぐために無フィーダー幹細胞培養培地0.5mlを加える。マトリックスでコーティングしたプレートを使用する準備ができている。 </li></ol></li><li> DMEM / F12の2ミリリットルで、各ウェルをすすぐことによって、マイクロウェルプレートを準備します。 DMEM / F12を除去し、各ウェルにROCK阻害剤を補充したEB形成培地の0.5ミリリットルを追加します。 5分間の気泡を除去するために2,000×gでプレートを遠心する。 </li><li>リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中でアジ化ナトリウムを2％FBSを混合することによって、FACS染色緩衝液を調製し、0.09％。 pH7.4にバッファを調整します。 </li><li> DMEM / F12に10％FBSを添加することによりトリプシン中和溶液を調製する。 </li></ol> 2.のiPS文化<ol><li> iPS細胞播種、3​​7°C​​まで暖かい無フィーダー幹細胞培地に先立ち、及びミリアンペアを持つ準備がコーティングされたプレートをTRIX。 </li><li>すぐに37℃の水浴中でIMR90-1 iPS細胞を解凍する。水浴からクリオバイアルを除去し、70％エタノールでバイアルを拭く。細胞塊の破壊を最小限にするために2ミリリットルピペットを用いて15ミリリットルコニカルチューブに細胞を移す。 </li><li>滴下細胞に暖かい無フィーダー幹細胞培養培地5mlを加え、穏やかに混合する。 RTで5分間300×gで細胞を遠心し、上清を除去します。 </li><li>慎重に無フィーダー幹細胞培地2mlの細胞塊を再懸濁し、基質でコーティングされたプレートのウェル中の細胞塊をシード。 5％CO 2、湿度95％で37℃のインキュベーターにプレートを置きます。 </li><li>毎日のiPS細胞培養培地を変更します。五から七日播種後の未分化コロニーを観察します。光学顕微鏡下で通過させるための準備ができている未分化コロニー（密集中心としたコロニー）を確認してください。 </li></ol> iPS細胞の3継代<ol><li>通路の開始前に、iPS細胞、ディスパーゼ溶液を、DMEM / F12、水浴中で37℃に無フィーダー幹細胞培養培地を温める。 </li><li> iPS細胞を継代する前に、領域をこすると培地を吸引することによって分化のいずれかの領域を除去する。慎重に2ミリリットルのDMEM / F12でiPS細胞をすすいでください。 </li><li> / mlのディスパーゼ各ウェルに1 MGの1ミリリットルを加え、7分間37℃でインキュベートする。吸引しディスパーゼ、ゆっくりとDMEM / F12の2ミリリットルで2回細胞コロニーをすすぐ。すすいだ後、各ウェルに無フィーダー幹細胞培養培地2mlを加える。 </li><li>を5mlのピペットを使用して、穏やかに細胞塊を形成するために、プレートのコロニーをこすり。 15ミリリットルコニカルチューブに取り外した細胞塊を転送します。細胞の次の継代をシードするのに十分な無フィーダー幹細胞培養培地を加える。 </li></ol>マイクロウェルプレートを使用したEBの4世代<ol><li> iPS細胞の単一細胞懸濁液の調製<ol><li> mediuを削除iPS細胞からmおよびDMEM / F12の2mlでiPS細胞をすすぐ。 6ウェルプレートの各ウェルでのiPS細胞にACCUTASE750μlのを追加します。細胞がプレート（約5〜10分）から分離することを可能にするために37℃、5％CO 2で細胞をインキュベートする。 </li><li>優しく残りの細胞を解離するために、プレート表面に残った細胞を剥離するためにピペットを使用してください。 50ミリリットルコニカルチューブに細胞を移す。 DMEM / F12の5ミリリットルでプレートをすすぎ、コニカルチューブ内の細胞ですすぎDMEM / F12を兼ね備えています。すべての可能な残余の細胞塊を除去するために40μmのセルストレーナーを通して細胞懸濁液を渡します。 </li><li> ACCUTASEを削除するには、室温で5分間300×gで細胞を遠心します。細胞濃度が約0.5〜1.0×10 7細胞/ mlになるようにEB形成培地中で細胞ペレットを再懸濁する。 </li><li>トリパンブルーと血球計数器を用いて細胞を計数することにより生存細胞の数を決定します。 </li></ol></li><li> Adjustin整粒したEBを形成するためのマイクロウェル内gの細胞密度<ol><li>所望のEBのサイズを生成するためにマイクロウェルプレートの各ウェルに細胞数を調整する。均等に優しく細胞を数回ピペッティングして細胞を配布、ステップ1.9で作成プレートのマイクロウェルに細胞を追加します。 注：ウェル当たりマイクロウェルのEBのx個当たりのセルのウェルあたり必要な細胞の数=所望の数。 </li><li> 2.0ミリリットルの最終容量にウェル中のROCK阻害剤を補充したEB形成培地を調整します。静かに各ウェルにピペッティングして細胞を再配布。遠心分離機3分間100×gでマイクロウェルプレートは24時間、5％CO 2、95％湿度で37℃のインキュベーターでプレートを置きます。 </li></ol></li><li>マイクロウェルプレートから収穫したEB <ol><li>よくEBの大部分を除去するための1ミリリットルピペットで上下に培地をピペットによってマイクロウェルから収穫したEB。反転した40μmのセルを介してのEBサスペンションを渡す単一細胞を除去するために50mlコニカルチューブの上にストレーナー。 </li><li>すべてのEBを削除するにはDMEM / F12 1mlのマイクロウェルプレートを5回洗浄する。回の洗浄を収集し、反転したセルストレーナーを通過。新しい50ミリリットルコニカルチューブにアップセルストレーナー右サイドに回します。 EB形成培地で洗浄することによりEBを収集します。収量を決定するために、EBをカウント。 </li></ol></li></ol> 5.めっきしたEBと開始分化<ol><li>タンパク質マトリックス上にプレートEBは、EB形成培地+10μMのROCK阻害剤で千のEB /ウェル&lt;の密度で（ステップ1.8.1のように）6ウェルプレートをコーティングした。 24時間、5％CO 2、95％湿度、37℃でのEBをインキュベートする。 </li><li> 24時間のEBめっき後、分化を開始するために分化培地と交換してください。細胞は、さらなる分析のために収集されるまで、一日おきに分化培地の半分を変更します。 </li><li> RT-PCR、immにを実施する日にサンプル6、17、29及び60を収集特徴的なRPE遺伝子およびタンパク質の発現を検証するunocytochemistryおよびFACS。 </li></ol> 6. RNA抽出およびPCR <ol><li>市販のキットで提供される指示に従って、EBサンプルからRNAを抽出します。分光光度計を使用してRNA濃度を決定します。 </li><li> cDNAを逆転写キットに市販のRNAによると、全RNA 100ngのに逆転写を行います。 </li><li> cDNAの10マイクロモル/ 10 NGの濃度でのcDNAの10 ngの以下のプライマーを用いた（ 表1）を用いてPCRを行います。次のようにPCRを設定：72℃での最終サイクルに続いて、1分間、30秒間、72℃で、5分間、95℃でDNAを変性15秒間95℃、35サイクルで増幅し、60°C 10分間、C。 1％アガロースゲルでPCR産物を実行します。 </li></ol> 7.免疫細胞化学<ol><li> RTでPBSで2回のEBを洗ってください。 4％paraformaldにRTでのEBを修正10分間ehyde。 RTでPBSで一度すすぐ。 PBSで保管してサンプルを4℃で染色に使用するまで。 </li><li>染色日には、固定および透過試薬で固定した細胞を扱う。 RTで1時間（透過処理溶液中の10％ヤギ血清）をブロッキング溶液でサンプルをインキュベートする。 </li><li>抗Pax6の（1:10）、抗RX（1：200）で示される希釈度以下の一次抗体を使用して透過処理溶液中の10％ヤギ血清で免疫化学を実行し、抗MITF（1:30）、および抗ZO1（1：100）。 4℃で対応する抗体O / Nを有するサンプルをインキュベートする。 </li><li>翌日、細胞からの一次抗体を除去し、PBSでサンプルを3回すすいでください。 RTで1時間フォア結合二次抗体とサンプルをインキュベートする。 </li><li>細胞から二次抗体を除去し、PBS中のサンプルを3回すすいでください。カバーが封入剤を含むDAPIをガラススライド上にスリップマウントサンプルは暗室でO / Nを設定することを可能にする。染色を可視化する蛍光顕微鏡を使用してください。 </li></ol> FACS分析のために8染色<ol><li> PBS中で培養したEBを2回洗浄します。単一細胞懸濁液を作製するために5〜10分間0.25％トリプシンを0.5mlとしたEBをインキュベートする。トリプシン中和溶液（1ml /ウェル）でトリプシンを中和する。 </li><li> 10分間、600×gでの15mlコニカルチューブと遠心分離機に単一細胞懸濁液を移す。 </li><li>上清を捨て、チューブ中の細胞にDMEM / F12の10ミリリットルを追加します。穏やかに細胞を混合することが反転。 600×gで遠心分離する。遠心分離後、上清を廃棄し、FACS染色緩衝液中で細胞を再懸濁する。 </li><li>細胞の総数を数えます。 10分間600×gで遠心分離する。遠心分離廃棄上清の後。すぐに4％パラホルムアルデヒドの0.5ミリリットルを添加して細胞を固定します。穏やかにボルテックスでよく混ぜる。 20分間、4℃で細胞をインキュベート。 </li><li> 10分間600×gで遠心分離し、削除する上清。渦穏やかに細胞ペレットを破壊する。冷却された透過化溶液1mlを添加して細胞を透過性。ボルテックスは穏やかに混合し、30分間氷上でインキュベートする。 </li><li> 10分間600×gで遠心分離し、上清を除去します。 FACS染色バッファーに再懸濁の3ミリリットルを追加します。 1より多くの時間のために、この手順を繰り返します。 5×10 6細胞/ mlの最終濃度でFACS染色緩衝液中で細胞を再懸濁。 </li><li>各マイクロチューブに100μlの細胞懸濁液（0.5×10 6細胞）を転送し、一次抗体の推奨されるボリュームを追加。 Pax6のために、細胞懸濁液を100μlのPE抗Pax6のの5μlを添加する。 MITFのために、細胞懸濁液を100μlの抗MITFの5μlを添加する。 </li><li>混合し、60分間RTでインキュベートする。 FACS染色バッファーの3ミリリットルを追加します。 10分間600×gで混合し、遠心。上清を除去し、さらに2回のために8.16を繰り返します。 </li><li> MITF染色のために、二次antiboで細胞をインキュベートdyは、1の希釈でヤギ抗マウスアレクサフルオロ488：4°Cで1時間、2000。 Pax6の染色のために、このステップを回避する。 </li><li> 10分間600×gでのFACS染色バッファーと遠心機の5ミリリットルで細胞を洗浄。 2回以上のプロセスを繰り返します。 </li><li>細胞ペレットを破壊する優しくFACS染色バッファーと渦の500μlの細胞を再懸濁。サンプルは、フローサイトメトリー分析のために準備ができている。 </li></ol> 9. IPS-RPEの単離および培養<ol><li> 29日目に、慎重に200μlのピペットチップを用いて培養プレートから選択着色されたコロニーの周囲に切断した。 15ミリリットルコニカルチューブに浮動コロニーを転送します。 RTで10分間600×gでコロニーを遠心し、上清を除去します。 </li><li> 10分間600×gでDMEM / F12と遠心機の10ミリリットルで細胞コロニーを懸濁します。上清を取り除きます。 </li><li> 7-10分間37℃で0.25％トリプシン2mlを有するコロニーをインキュベートすることによって、単一細胞懸濁液を調製。穏やかにコロニーを解離細胞懸濁液をボルテックス。 </li><li>のiPS-RPE培地2mlを添加することによりトリプシンを中和する。 10分間600×gで遠心分離し、上清を捨てる。のiPS-RPE培地2ml中で単一細胞を再懸濁する。 37℃、5％CO 2および湿度95％のインキュベーター内タンパク質マトリックスコートした6ウェルプレートを所定の位置に細胞を移す。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

細胞療法のための多能性幹細胞の完全な約束を実現するためには、一貫して再現可能な方法でそれらの分化を調節することが必要である。このレポートでは、マイクロウェルプレート技術を使用してサイズ制御したEBを形成RPEに向かって分化を開始し、RPEのタンパク質と遺伝子マーカーを同定するためのプロトコルについて説明します。 インビトロ分化を同期させるために、EBの均一?...

人工多能性幹（iPS）細胞は、外因性因子1成体細胞を再プログラミングすることによって誘導される多能性幹細胞の一種である。対照的に、胚性幹細胞（ESC）、多能性幹細胞の別の型は、胚盤2-3の内部細胞塊から生成される。それらの異なる起源にもかかわらず、iPS細胞およびESCをインビトロおよび任意の細胞型4-5に分化する能力において複製するそれらの無制限の容量が同程度である。 iPS細胞のこれらの特徴は、彼らにパーソナライズされた再生医療への応用のための理想的な候補を作る。最近の研究努力は、網膜色素上皮（RPE）6-11を含む特殊な成体細胞を製造するための堅牢な分化プロトコールを開発することに焦点を当てている。 のiPS由来細胞の潜在的な臨床用途のために、その特定の細胞型に向かう分化が不可欠である。様々な方法があるその効率6-7、12-16で大きく変化したRPEに両方のESCとのiPS細胞の監督分化のために公開。我々はまだ開発または分化中の細胞/組織の運命を支配する分子事象の多くは知らない。近年では、努力は、できる限り胎生発育を模倣することができる分化プロトコルを開発する試みがなされてきた。胚盤胞段階の間に、幹細胞のコミットされていない集団の三次元微小環境で一緒にいる。そのように、様々な戦略を組み立てESC / iPS細胞を作成し、三次元でそれらを成長させるために適用した。これらの幹細胞集合体は、胚様体（EB）と呼ばれている。研究は、幹細胞のEBの分化は胚発生の初期段階を模倣し、自発的にその外面に原始内胚葉を生じ得ることを示した。 EBの開発が進むにつれてその後、3つのすべての生殖系列の分化細胞の表現型は17-18が表示されます。目erefore、EBをベース分化プロトコルは、ESC / iPS細胞のin vitroでの分化のために多くの注目を集め多能性幹細胞13からRPE生成のための良い候補であるしている。 EBは、ESC / iPS細胞からのいくつかの方法を用いて製造することができる。最初に、EBを付着コロニーを掻き非接着懸濁培養でそれらを維持することによって作製した。しかし、このアプローチは、低い再現性を引き起こすEBの不均一な集団を生じる。ハンギングドロップ細胞培養およびマイクロウェルベースの​​EB形成が非常に再現性が定義された大きさの均一なEBをを得たEB形成のための他の一般的な技術である。さらに、マイクロ技術は少ない労力で凝集体の大多数を得ることができる。 のEB内の細胞の分化は、細胞外および細胞内微小環境から形態形成の合図の多重によって調節される。月における分化とは対照的にフォーマットolayer、EBは、17を発生する細胞と細胞間シグナル伝達の複雑なアセンブリのためのプラットフォームを提供する。興味深いことに、個々のEBを作製するために使用される多能性幹細胞の数は、細胞の運命に影響を与えることが観察された。 1000セルEBは赤血球系統20に向けてプッシュされ、一方、例えば、ヒトESCの造血分化の研究では、500セルEBは骨髄系統への分化を促進したことが観察された。別の研究では、より小さなEBは、神経外胚葉分化11、17に向けて推進し、より大きなEBを、一方、内胚葉分化を支持した。 これらの過去の研究は強く個々のEBを作製するために使用されるESC / iPS細胞の数は、任意の細胞型への分化に基づいたEBに影響を与えることを示唆している。しかし、我々の知る限り、RPEに分化するために、その傾向にEBをサイズの影響を解明した電流の研究はありません。本研究の目的は、影響を特徴付けることである網膜色素上皮（のiPS-RPE）分化およびRPE系統に向かって方向付け分化したEBを作るための最適な細胞数を識別するために - 人工多能性幹（iPS）細胞へのEBの大きさ。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="722">
	<tbody>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:239px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:183px;">Company</td>
			<td style="width:140px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:161px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mTeSR1 media + 5X supplement</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y-27632 (Rock Inhibitor)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">M-7154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Non essential amino acids</td>
			<td style="width:183px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>SH30853.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Knockout serum replacement</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Gentamicin&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">MEM media</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">10370-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">N1 supplement</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">N-6530-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Taurine</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">T-8691-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">H0888-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:183px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>SH3008803HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triiodo-l-thyronine sodium&#160; salt</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Dispase</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td>17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Matrigel</td>
			<td style="width:183px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:140px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:183px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Aggrewell 400 plate</td>
			<td style="width:183px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td>27940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">AggreWell medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Accutase</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Mouse Anti-PAX6 antibody</td>
			<td colspan="2">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Rabbit Anti- RX antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab23340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Mouse&#160; Anti-MITF antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MS-772-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Rabbit Anti-ZO-1 antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>40-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">RNeasy plus mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">PCR master mix</td>
			<td>promega</td>
			<td>M7502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">High capacity RNA to c DNA kit</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td>4387406</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deriving retinal pigment epithelium (rpe) from induced pluripotent stem (ips) cells by different sizes of embryoid bodies

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of techniques to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has generated interest and excitement towards the possibility of customized personal regenerative medicine. However, the efficiency of stem cell differentiation towards a desired lineage remains low. The purpose of this study is to describe a protocol to derive retinal pigment epithelium (RPE) from iPS cells (iPS-RPE) by applying a tissue engineering approach to generate homogenous populations of embryoid bodies (EBs), a common intermediate during in vitro differentiation. The protocol applies the formation of specific size of EBs using microwell plate technology. The methods for identifying protein and gene markers of RPE by immunocytochemistry and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) are also explained. Finally, the efficiency of differentiation in different sizes of EBs monitored by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of RPE markers is described. These techniques will facilitate the differentiation of iPS cells into RPE for future applications.

この実験では、iPS細胞を培養したEBからRPE細胞系統に分化した。制御されたサイズのEBをマイクロウェルプレートを用いて形成された。 図1 EBの形成に見られるように、マイクロウェルプレート中で均質であった。これらのEBは、次いで（ 図2）を回収し、6ウェルプレート上にプレーティングした。 RPEは、古典的な六角形の形態、色素沈着、およ?...

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Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

このレポートの目的は、胚様体の異なるサイズを使用して人工多能性幹（iPS）細胞から網膜色素上皮（RPE）を導出するためのプロトコルを記述することである。

胚様体の異なるサイズによって人工多能性幹（iPS）細胞から網膜色素上皮（RPE）の導出

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

deriving-retinal-pigment-epithelium-rpe-from-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

10.5K ビュー.  U.S. Army Institute of Surgical Research. このレポートの目的は、胚様体の異なるサイズを使用して人工多能性幹（iPS）細胞から網膜色素上皮（RPE）を導出するためのプロトコルを記述することである。 

ビデオ: Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

幹細胞から網膜色素上皮細胞の効率的な導出

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

発生生物学

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets of patients with metastatic melanoma. Major obstacles of this approach are the reduced viability of transferred T cells, caused by telomere shortening, and the limited number of TILs obtained from patients. Less-differentiated T cells with long telomeres would be an ideal T cell subset for adoptive T cell therapy;however, generating large numbers of these less-differentiated T cells is problematic. This limitation of adoptive T cell therapy can be theoretically overcome by using induced pluripotent stem cells (iPSCs) that self-renew, maintain pluripotency, have elongated telomeres, and provide an unlimited source of autologous T cells for immunotherapy. Here, we present a protocol to generate iPSCs using Sendai virus vectors for the transduction of reprogramming factors into TILs. This protocol generates fully reprogrammed, vector-free clones. These TIL-derived iPSCs might be able to generate less-differentiated patient- and tumor-specific T cells for adoptive T cell therapy.

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

ヒトメラノーマ腫瘍浸潤リンパ球から誘導多能性幹細胞の生成

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

2および3次元の胚様体中のマウス胚性幹細胞のレチノイン酸誘発神経分化の分析

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

末梢血由来ヒト誘導多能性幹細胞からの軟骨細胞の分化

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. Currently, efforts are being made to regenerate damaged cartilage with ex vivo expanded chondrocytes or bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs). However, the restricted viability and instability of these cells limit their application in cartilage reconstruction. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have received scientific attention as a new alternative for regenerative applications. With unlimited self-renewal ability and multipotency, hiPSCs have been highlighted as a new replacement cell source for cartilage repair. However, obtaining a high quantity of high-quality chondrogenic pellets is a major challenge to their clinical application. In this study, we used embryoid body (EB)-derived outgrowth cells for chondrogenic differentiation. Successful chondrogenesis was confirmed by PCR and staining with alcian blue, toluidine blue, and antibodies against collagen types I and II (COL1A1 and COL2A1, respectively). We provide a detailed method for the differentiation of cord blood mononuclear cell-derived iPSCs (CBMC-hiPSCs) into chondrogenic pellets.

Here, we propose a protocol for chondrogenic differentiation from cord blood mononuclear cell-derived human induced pluripotent stem cells.

臍帯血由来誘導多能性幹細胞からの軟骨形成ペレット形成

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

人間の胚または誘導多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の急速な監督の分化

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms of retinitis pigmentosa (RP) and age-related macular degeneration (AMD). Cell therapy is one of the most promising therapeutic strategies proposed to cure these diseases, with already encouraging preliminary results in humans. However, the method of preparation of the graft has a significant impact on its functional outcomes in vivo. Indeed, RPE cells grafted as a cell suspension are less functional than the same cells transplanted as a retinal tissue. Herein, we describe a simple and reproducible method to engineer RPE tissue and its preparation for an in vivo implantation. RPE cells derived from human pluripotent stem cells are seeded on a biological support, the human amniotic membrane (hAM). Compared to artificial scaffolds, this support has the advantage of having a basement membrane that is close to the Bruch&#39;s membrane where endogenous RPE cells are attached. However, its manipulation is not easy, and we developed several strategies for its proper culturing and preparation for grafting in vivo.

We describe a method to engineer a retinal tissue composed of retinal pigment epithelial cells derived from human pluripotent stem cells cultured on top of human amniotic membranes and its preparation for grafting in animal models.

ヒト胚性幹細胞に由来する移植適切な網膜色素上皮組織をエンジニア リング

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent epiblast cells by orchestrated exposures to cytokines, including bone morphogenetic protein 4 (Bmp4). In human embryos, the earliest PGCs have been identified on the endodermal wall of yolk sac around the end of the 3rd week of gestation, but little is known about the process of human PGC specification and their early development. To circumvent the technical and ethical barriers of studying human embryonic PGCs, surrogate cell culture models have been recently generated from pluripotent stem cells. Here, we describe a 13-day protocol for robust production of human PGC-Like Cells (hPGCLCs). Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) maintained in the primed pluripotency state are incubated in the 4i na&#239;ve reprogramming medium for 48 hours, dissociated to single cells, and packed into microwells. Prolonged maintenance of hiPSCs in the na&#239;ve pluripotency state causes significant chromosomal aberrations and should be avoided. hiPSCs in the microwells are maintained for an additional 24 hours in the 4i medium to form embryoid bodies (EBs), which are then cultured in low-adherence plasticware under a rocking condition in the hPGCLC induction medium containing a high concentration of recombinant human BMP4. EBs are further cultured for up to 8 days in the rocking, non-adherent condition to obtain maximum yields of hPGCLCs. By immunohistochemistry, hPGCLCs are readily detected as cells strongly expressing OCT4 in almost all EBs exclusively on their surface. When EBs are enzymatically dissociated and subjected to FACS enrichment, hPGCLCs can be collected as CD38+ cells with up to 40-45% yield.

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of both sperm and eggs. Human embryonic PGCs are specified from pluripotent epiblast cells through interactions of cytokines. Here, we describe a 13-day protocol of inducing human cells transcriptomally resembling PGCs at the surface of embryoid bodies from primed-pluripotency induced pluripotent stem cells.

プライミング多能性胚様体の表面で人間の始原生殖細胞のような細胞の生成誘導多能性幹細胞

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

臍帯血由来から 3 D 肌 Organoid の生成誘導多能性幹細胞

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

体節誘導体誘導される人間からの体外世代多能性幹細胞します。

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

胚様体の異なるサイズによって人工多能性幹（iPS）細胞から網膜色素上皮（RPE）の導出

要約

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幹細胞から網膜色素上皮細胞の効率的な導出

ヒトメラノーマ腫瘍浸潤リンパ球から誘導多能性幹細胞の生成

2および3次元の胚様体中のマウス胚性幹細胞のレチノイン酸誘発神経分化の分析

末梢血由来ヒト誘導多能性幹細胞からの軟骨細胞の分化

臍帯血由来誘導多能性幹細胞からの軟骨形成ペレット形成

人間の胚または誘導多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の急速な監督の分化

ヒト胚性幹細胞に由来する移植適切な網膜色素上皮組織をエンジニアリング

プライミング多能性胚様体の表面で人間の始原生殖細胞のような細胞の生成誘導多能性幹細胞

臍帯血由来から 3 D 肌 Organoid の生成誘導多能性幹細胞

体節誘導体誘導される人間からの体外世代多能性幹細胞します。

胚様体の異なるサイズによって人工多能性幹（iPS）細胞から網膜色素上皮（RPE）の導出

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幹細胞から網膜色素上皮細胞の効率的な導出

ヒトメラノーマ腫瘍浸潤リンパ球から誘導多能性幹細胞の生成

2および3次元の胚様体中のマウス胚性幹細胞のレチノイン酸誘発神経分化の分析

末梢血由来ヒト誘導多能性幹細胞からの軟骨細胞の分化

臍帯血由来誘導多能性幹細胞からの軟骨形成ペレット形成

人間の胚または誘導多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の急速な監督の分化

ヒト胚性幹細胞に由来する移植適切な網膜色素上皮組織をエンジニア リング

プライミング多能性胚様体の表面で人間の始原生殖細胞のような細胞の生成誘導多能性幹細胞

臍帯血由来から 3 D 肌 Organoid の生成誘導多能性幹細胞

体節誘導体誘導される人間からの体外世代多能性幹細胞します。

ヒト胚性幹細胞に由来する移植適切な網膜色素上皮組織をエンジニアリング