Diese Arbeit wurde von den US National Institutes of Health Grants NS-024572 (RSW) unterstützt.

1. Stain die Zubereitung mit Supravitalfarbstoffe <ol><li> Für die Strumpfbandnatter Dissektion Protokoll sehen Stewart et al. 5 und Teng et al. 6 Reptilien-Gewebe bleibt physiologische für längere Zeit und mit weniger bakterielle Verunreinigung, wenn sie bei niedrigen Temperaturen gehalten (siehe unten). Säugergewebe wird üblicherweise bei Raumtemperatur oder höher gehalten wird. </li><li> Für lysosomale Vitalfarbstoff-Färbung, lösen den Farbstoff in kalten Reptilien Ringer-Lösung 1:5000 (0,2 uM). Inkubieren bei 4 ° C für 15 min. Mehrmals mit kaltem Ringers waschen. Bild so schnell wie möglich. </li><li> Für FM1-43 Färbung mit KCl-Stimulation, verdünnen den Farbstoff in hoher KCl Ringers 1:500 (7 uM). Inkubieren bei 4 ° C für 30-60 Sekunden maximal. Schnell waschen dreimal mit kaltem Ringers, ~ 1 min / Spülung. Bild so schnell wie möglich. </li><li> Für FM1-43 Färbung mit hypertoni (Saccharose) Stimulation, verdünnen den Farbstoff in 0,5 M Saccharose Ringers wie oben. Inkubation bei 4 &amp; #176, C für 2-5 min. Wie in Schritt 1.3 oben mit kaltem Ringers. Bild so schnell wie möglich. </li><li> Für FM1-43-Färbung durch elektrische Stimulation, siehe Teng et al. 6. Kurz gesagt, wird die Herstellung einer Schale mit physiologischer Kochsalzlösung und der Farbstoff gegeben. Der Nerv wird mit einem vorprogrammierten Zug von 200 Mikrosekunden Rechteckimpulse (~ 7 V, 30 Hz, 18 Mikrosekunden) stimuliert. Wie in Schritt 1.3 oben mit kaltem Ringers. Bild so schnell wie möglich. </li></ol> 2. Konfigurieren Sie die Vorbereitung für Imaging <ol><li> Richten Sie die Vorbereitung so, dass die Strukturen von Interesse sind, so nah wie möglich an der Mikroskopobjektiv. </li><li> Wenn ein inverses Mikroskop verwendet wird, nutzen eine Kammer, deren Boden enthält eine dünne runde Deckglas. Typischerweise sollte die Abbildungskammer haben eine dünne Edelstahlboden mit einem Durchmesser von 25 mm Dicke Nr. 1 Deckglas in der Mitte. Wenn ein aufrechtes Mikroskop verwendet wird, wird eine Unterdeck nicht erforderlich, aber ist nützlichBildgebung mit Durchlicht ermöglichen (zB Differentialinterferenzkontrast, DIC), um die Probe zu orientieren und suchen Objekte von Interesse. </li><li> Wählen Sie einen geeigneten Ziel, die höchstmögliche 3D Auflösung zu erhalten. Es gibt Kompromisse zwischen numerischen Apertur (NA), Arbeitsabstand, Vergrößerung und Objektivtyp (trocken, Wasser-und Ölimmersion). Für dünne Präparate wie Gewebekulturen, sind Öl Ziele am besten. Mit einem aufrechten Mikroskop, schweben ein Deckglas auf dem wässrigen Bad, und verwenden Immersionsöl zwischen der Oberseite des Deckglases und dem Ziel. </li><li> Wenn Entfaltungs Software verwendet wird, kann der Verkäufer vorbestimmten Punktbildfunktionen (PSF) für bestimmte Ziele zu liefern. Wenn keine solche Informationen zur Verfügung gestellt, oder wenn eine nicht unterstützte Ziel gewählt wird, bestimmen die PSF durch bildgebende Fluoreszenzmikropunkte oder ähnliche Objekte beugungsbegrenzten 7,8. </li></ol> 3. Stellen Sie die gewünschte Schärfentiefe und Anzahl der Images Wunsch pro Zeitraffer-Rahmen <ol><li> Wählen Sie die Gesamttiefe, so dass die Interaktion bewegt oder Strukturen der Interessen nicht verschwinden oder gehen aus dem Fokus, wie sie in der z-Richtung zu bewegen. Die z-Bereich sollte die vertikale Abmessung der Zelle oder Zellfort abzubildenden leicht übersteigen. Für Wirbelmotorklemmen, ist 15-20 um typisch. </li><li> Berechnen der Z-Achsen-Stufe für jedes Inkrement des Fokus nötig. Auflösung entlang der z-Achse variiert in Abhängigkeit von Eigenschaften des Ziels; es ist etwa ein Viertel der xy-Ebene Auflösung. Wenn entweder konfokale Bildgebung oder Entfaltungs Software verwendet wird, wird der z-Achsenauflösung verbessert. Verbessern endgültige Auflösung durch gezielte Oversampling in der z-Richtung 5, siehe aber auch unter Schritt 3.3. Eine typische Schrittintervall ist im Bereich von 40 nm für 400-1,500-100X Ziele. Licht sollte während jeder z-Schritt-Bildschalt werden. </li><li> Wählen Sie die Anzahl der Bilder pro Z-Stapel, nämlich die gewünschte Schärfentiefe geteiltdurch den Schritt Intervall. Zeit, um eine typische Z-Stapel abzuschließen 1-10 sek. Schnell bewegten Objekten (100 nm / s) erscheinen kann in einer 3D-Bildstapel unscharf, da jeder Bildebene entspricht einem etwas anderen Zeitpunkt. Außerdem trägt jede weitere Bild, um Photobleaching und mögliche Phototoxizität (siehe Diskussion). Wenn eine Situation bezieht, wählen Sie eine größere z-Schritt zu weniger Bilder pro Stapel zu sammeln. Kompensieren Sie später mit Bild-Interpolation-Software (Schritt 6.3). </li></ol> 4. Wählen Sie die Zeitraffer-Bildrate Wählen Sie durch Experimentieren eine Rate, die gerade ausreichend ist, um sich mit der Zeit wie Bewegung, Wechselwirkungen oder Fusionsereignisse 9 reibungslos zu lösen. Unter Probenahme von Bewegungsartefakten (Stichprobenfehler) produzieren kann, während Oversampling erhöht unnötigerweise die Belichtung. Sammeln entweder eine einzige lange Sequenz oder mehrerer Wiederholungssequenzen aus der gleichen Zubereitung, die jeweils mit einer relativ kleinen Gesamtzeitintervall ( <em&gt; zB 10 Zeitpunkte x 30 sec Intervall = 5 min). Wenn möglich, zeigen Sie die Vorbereitung mit kontinuierlicher Epifluoreszenz Beleuchtung rund Schätzung Bewegungsgeschwindigkeiten, einschließlich Drift der gesamten Zubereitung, falls vorhanden. 5. Füllen Sie alle Live-Imaging für eine bestimmte Zubereitung Reptilien-Präparate in der Regel robust bleiben für ca. 1-2 Stunden, länger, wenn gekühlt. 6. Analysieren von Daten gemäß der gewünschten Nutzung <ol><li> Bewahren Sie alle Rohdaten-Dateien. Während digitale Speicher ist in der Regel kein Problem ist, ist die Verarbeitungszeit sogar bei schnellen PCs oder Workstations signifikant. Aus diesem Grund Zuschneiden von Bildern in einer Region von Interesse [ROI]. Sicher, dass die gesamte Region von Interesse ist der Anbau Fenster während der gesamten Zeitverlauf. </li><li> Zu entfalten Bildstapeln mit der entsprechenden Software und den richtigen Point-Spread-Funktion. Bestätigen Sie, dass die Auflösung verbessert und dass kein Artefakt ist durch die erzeugte wordenEntfaltungsalgorithmus. 3 zeigt Beispiele. </li><li> Verwenden Sie ein Interpolations-Algorithmus, um z-Achse scheinbare Auflösung erweitern. Ein 6X Expansion von einer tatsächlichen Bild 1,5 um Ebenentrennung zu einer scheinbaren 0,25 um Trennung vorgeschlagen. Alternativ können Sie eine Kombination aus Oversampling (Schritt 3.2) und Interpolation. </li><li> Führen Sie Kontrast, Helligkeit, Rauschfilterung, Bleichen und andere typische Bildverarbeitungs Anpassungen, falls gewünscht. Bildbearbeitungsstandards schreiben vor, dass für die meisten wissenschaftlichen Arbeiten, ist es angebracht, dass die gleichen Korrekturen sowohl innerhalb eines Stapels und zu verschiedenen Zeitpunkten auf alle Bilder angewendet werden. Die Folge einer bestimmten Einstellung sollte unter allen Bildern 9 beurteilt werden. </li><li> Wählen Sie einen bestimmten Anzeigemodus für den Export von Daten. Die einfachste Display ist mit Stereo-Video entweder Rot-Grün oder Rot-Blau-Anaglyphen (Beispiele in Abbildung 3), Stereo-Paare oder abwechselnd links / Rechtt Augenrahmen mit Shutter-Brille. Anaglyphen sind einfarbige begrenzt. Verbessern scheinbare Bildtiefe, wenn gewünscht, um z-Achse visuelle Auflösung zu verbessern. </li><li> Experimentieren Sie mit verschiedenen Filter-und Bildverbesserungstechniken. Zum Beispiel ist Laplace-Filterung nützlich, um den Kontrast von kleinen Strukturen über dem Hintergrund zu erhöhen. Die Helligkeit der Pixel in der Mitte eines Fensters ausgeführt wird verbessert, während die Helligkeit der Umgebung reduziert wird. Beachten Sie, dass einige Filtermethoden nicht gut in Kombination zu arbeiten. </li><li> Bewerben Driftkorrektur, wenn es wesentliche Bewegung der Zubereitung über die Zeit. Diese Bewegung ist in lebenden Muskel häufig, auch mit Drogen gegeben, um Aktionspotentiale und synaptische Potentiale zu unterdrücken. Ein Pixel Registrierungsalgorithmus (z. B.. Imaris, Adobe Aftereffects, TURBOREG Plugin für ImageJ) richtet Zeitraffer-Bilder und kann zu reduzieren, aber in der Regel nicht vollständig beseitigen, wie Bewegung. </li></ol>

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	<li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy-tips+and+tools.">Live-cell microscopy-tips and tools.</a> J. Cell Sci. 122 (6), 753-767 (2009).</li><li>Tinevez, J. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+method+for+measuring+phototoxicity+of+a+live+cell+imaging+microscope.">A quantitative method for measuring phototoxicity of a live cell imaging microscope.</a> Meth. Enzymol. 506, 291-309 (2012).</li><li>Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+evaluating+colocalization+in+biological+microscopy.">A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, (2011).</li><li>Snapp, E. L., Hegde, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+and+evaluation+of+FRETexperiments+to+measure+proteinproximities+in+cells.">Rational design and evaluation of FRETexperiments to measure proteinproximities in cells.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. 17, (2006).</li><li>Stewart, R. S., Teng, H., Wilkinson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late"+macroendosomes+and+acidic+endosomes+in+vertebrate+motor+nerve+terminals.">Late" macroendosomes and acidic endosomes in vertebrate motor nerve terminals.</a> J. Comp. Neurol. 520, 4275-4293 (2012).</li><li>Teng, H., Lin, M. Y., Wilkinson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macroendocytosis+and+endosome+processing+in+snake+motor+boutons.">Macroendocytosis and endosome processing in snake motor boutons.</a> J. Physiol. 582, 243-262 (2007).</li><li>McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+by+deconvolution+microscopy.">Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy.</a> Methods. 19, 373-385 (1999).</li><li>Swedlow, J. R., Platani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+using+wide-field+microscopy+and+deconvolution.">Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution.</a> Cell Struct. Funct. 27, 335-341 (2002).</li><li>Cromey, D. W., Taatjes, D. J., Roth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+images+are+data:+and+should+be+treated+as+such.">Digital images are data: and should be treated as such.</a> Methods Mol. Biol. 931, 1-27 (2013).</li><li>Teng, H., Wilkinson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin-mediated+endocytosis+near+active+zones+in+snake+motor+terminals.">Clathrin-mediated endocytosis near active zones in snake motor terminals.</a> J. Neurosci. 20 (21), 7986-7993 (2000).</li><li>Teng, H., Cole, J. C., Roberts, R. L., Wilkinson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+active+zones:+hot+spots+for+endocytosis+in+vertebrate+nerve+terminals.">Endocytic active zones: hot spots for endocytosis in vertebrate nerve terminals.</a> J. Neurosci. 19 (12), 4855-4866 (1999).</li><li>Tan, T. T. T., Khaw, C., Ng, M. M. L., Mendez-Vilas, A., Diaz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+recent+advances+in+live+cell+bioimaging.">Challenges and recent advances in live cell bioimaging.</a> Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. , 1495-1505 (2010).</li><li>Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+C.+elegans+embryos+using+an+epifluorescent+microscope+and+open+source+software.">Imaging C. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software.</a> J. Vis. Exp. (49), (2011).</li></ol>

Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Der wichtigste Aspekt der 4D-Bildgebung ist das Management von der Dauer und Intensität der Lichteinwirkung. Photobleichen abnimmt Bildsignal-zu-Rausch-Verhältnis und kann problematisch oder nicht in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren, einschließlich der Auswahl der Fluorophore sein. Unspezifische Schäden an lebendem Gewebe (Phototoxizität) auf Photobleaching bezogen, und kann manchmal mit Fluoreszenzsonden für die Zwecke 2,12 oder durch Prüfung der Morphologie mit geeigneten Hell Optik, wie Diff...

Zeitraffer-Bildgebung von lebenden Gewebe bietet visuelle Zugriff auf dynamische Struktur-Funktions-Beziehungen, die nicht in festen Zubereitungen oder leben in einem einzigen Punkt in der Zeit abgebildet geschätzt werden kann. Oft aber der Kompromiss für den Zugriff auf Zeitinformation ist eine Abnahme der optischen Auflösung. Hoher numerischer Apertur Öl-Immersionsobjektive sind unpraktisch in lebendem Gewebe wegen ihrer engen Bereich der Schwerpunkt, so dass Eintauchen in Wasser oder Trocken Ziele als die einzigen Alternativen. Darüber hinaus kann die erhöhte Auflösung durch konfokale Optik lieferte in einigen Lebens Vorbereitungen durch Phototoxizität von dem relativ hohen Niveau der Beleuchtung erforderlich 1,2 verwendet werden. Schließlich, während mehrere Echtzeit oder Zeitraffer-optische Techniken zur Verfügung, die eine verbesserte Auflösung bieten, ihre Anwendbarkeit auf Zubereitungen, für die Strukturen von Interesse nur wenige hundert Nanometer von der Ziel-1 positioniert werden beschränkt. Das beschriebene Verfahrenmacht von relativ kostengünstigen Ausrüstung ist vielseitig und bietet dennoch eine verbesserte Auflösung im Vergleich zu gebräuchlicheren Zeitraffertechniken. Es ist für den Einsatz in einzelnen Labors sowie Imaging-Einrichtungen vorgesehen. Das Verfahren verwendet herkömmliche Epifluoreszenzmikroskopie, kombiniert mit einer empfindlichen digitalen Kamera und mit Hardware zur schnellen Sätze von Bildern erfassen mit leicht unterschiedlichen Brennebenen (Z-Stapel). Jedes Z-Stapel wird digital entfaltet, um die Auflösung zu erhöhen. Ein Merkmal der 3D Zeitraffer (4D)-Bildgebung ist präzise Verfolgung bewegter Organellen oder anderen Strukturen. Wenn richtig eingerichtet ist, nicht abgebildeten Strukturen nicht aus dem Fokus zu gehen, und die Bewegung in allen drei Richtungen beobachtet und quantifiziert werden. So ist es unmöglich für einen Bunt Struktur, um über eine oder mehrere Zeitraffer-Frames nur durch Driften über oder unter einem schmalen Brennebene verschwinden. Das Verfahren dient auch als empfindlich für die Beurteilung der Wechselwirkungen und mögliche fusion von kleinen Strukturen. Konventionelle Epifluoreszenz oder konfokale Bilder von Strukturen in der Nähe der Beugungsgrenze (ein paar hundert nm) nicht bestätigen Fusion zusammengeführt, auch wenn Bilder zeigen Überlappung der jeweiligen Etiketten 3. Fusion vorgeschlagen, aber es weiterhin möglich, dass die Objekte horizontal oder vertikal um eine Distanz, die unterhalb der Beugungsgrenze ist, abgetrennt. Drei-oder vierdimensionalen Abbildung, dagegen ermöglicht die Anzeige der Objekte in jeder der drei orthogonalen Richtungen. Das Aussehen der Fusion in allen drei Ansichten erhöht den Grad der Gewissheit. Und in einigen Lebensmittel, gerichtet oder Brownsche Bewegung der vermeintlich abgesichert Objekte ist ein weiterer Beweis, wenn beide Etiketten in der Zeit zusammen zu bewegen. Natürlich, wenn in der Nähe der Beugungsgrenze das Niveau der Sicherheit in anspruchsvollen Strukturen von Hintergrund oder zeigen, dass sie zwei Farbstoffe (Fusion) enthalten, ist nicht absolut. Ggf. spezielle Techniken, wie Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET)4, sind besser geeignet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:720px;" width="720">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:180px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:180px;">Company</td>
			<td style="width:180px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:180px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Reagents:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SGC5</td>
			<td>Biotium [Hayward, CA]</td>
			<td>70057</td>
			<td>Final conc:10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FM1-43FX</td>
			<td>Invitrogen [Carlsbad, CA]</td>
			<td>F35335</td>
			<td>Final conc:7 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LysoTracker Red</td>
			<td>Invitrogen [Carlsbad, CA]</td>
			<td>L7528</td>
			<td>Final conc:0.2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Solutions:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reptilian Ringers pH 7.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>145 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>2.5&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>3.6&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td>1.8&#160; mM</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">KH2PO4 (Dibasic)</td>
			<td>1.0&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>5.0&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="height:21px;">High KCL Reptilian Ringers pH 7.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>&#160;86&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>&#160;60&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>3.6&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td>1.8&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">KH2PO4 (Dibasic)</td>
			<td>1.0&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>5.0&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="height:21px;">High Sucrose Ringers pH 7.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>145 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>2. 5 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>3.6&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td>1.8&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">KH2PO4 (Dibasic)</td>
			<td>1.0&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>5.0&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td>0.5 M (17.1 gm/50 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Equipment:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Comments</td>
			<td>Comments(website)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Axioplan 200 inverted microscope</td>
			<td colspan="2">Carl Zeiss [Thornwood, NY]</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4mm&#160;</td>
			<td colspan="2">Carl Zeiss [Thornwood, NY]</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher</td>
			<td>Sutter instruments [Novato, CA]</td>
			<td>175W Xenon arc lamp</td>
			<td><a href="http://www.sutter.com/">www.sutter.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Lambda 10-2&#160; emission filterwheel switcher</td>
			<td colspan="2">Sutter instruments [Novato, CA]</td>
			<td><a href="http://www.sutter.com/">www.sutter.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sensicam CCD camera</td>
			<td colspan="2">Cooke Instruments [Tonawanda, NY]</td>
			<td><a href="http://www.cookecorp.com/">www.cookecorp.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cascade 512 CCD camera</td>
			<td colspan="2">Photometrics [Tucson, AZ]</td>
			<td><a href="http://www.photometrics.com/">www.photometrics.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;">Imaging dishes- made in-house-11cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Software:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Comments</td>
			<td>Comments(website)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slidebook 5.0</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations [Denver, CO]</td>
			<td>Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation</td>
			<td><a href="http://www.intelligent-imaging.com/">www.intelligent-imaging.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IMARIS 7.5.2</td>
			<td>Bitplane [South Windsor, CT]</td>
			<td>Drift correction; 3D and 4D data presentation</td>
			<td><a href="http://www.bitplane.com/">www.bitplane.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AfterEffects CS6</td>
			<td>Adobe [San Jose, CA]</td>
			<td>Drift correction</td>
			<td><a href="http://www.adobe.com/">www.adobe.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ 1.46</td>
			<td>National Institutes of Health [Bethesda, MD]</td>
			<td>Multiple plugins available;Stereo pair construction</td>
			<td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij">http://rsbweb.nih.gov/ij</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeiss LSM</td>
			<td>Carl Zeiss [Thornwood, NY]</td>
			<td>Stereo pair construction</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of endosome dynamics in living nerve terminals with four-dimensional fluorescence imaging

Vierdimensionalen (4D)-Bildgebung Licht verwendet wurde, um das Verhalten von Kleinstrukturen im motorischen Nervenenden der dünnen trans studieren abdominis des Strumpfbandnatter. Raw-Daten umfasst Zeitraffer-Sequenzen von 3D-z-Stacks. Jeder Stapel enthält 4-20 Bilder mit Epifluoreszenz Optik bei Brennebenen von 400-1,500 nm getrennt erworben. Schritte bei der Erfassung von Bildstapeln, wie beispielsweise die Einstellung des Fokus, Schalten der Anregungswellenlängen, und der Betrieb der Digitalkamera, so weit wie möglich, die Bildrate zu maximieren und Gewebeschäden durch Lichteinwirkung zu minimieren automatisiert. Nach der Übernahme wird ein Satz von Bildstapeln entfaltet, um räumliche Auflösung zu verbessern, umgerechnet auf die gewünschte 3D-Format und verwendet, um ein 4D &quot;-Film,&quot; dass ist geeignet für eine Vielzahl von computerbasierten Analysen, je nach den experimentellen Daten gesucht erstellen. Eine Anwendung ist das Studium der Dynamik von zwei Klassen von Endosomen in den Nervenenden-macroendosomes gefunden (MES)und saure Endosomen (AES), deren Größen (200-800 nm für beide Typen) sind an oder nahe der Beugungsgrenze. Zugriff auf 3D-Informationen zu jedem Zeitpunkt bietet mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Zeitraffer-Bildgebung. Insbesondere, Größe und Geschwindigkeit der Bewegung der Strukturen über die Zeit ohne Verlust von Schärfe quantifiziert werden. Beispiele für Daten aus 4D-Bildgebung zeigen, dass KU nähern sich der Plasmamembran und verschwinden, was darauf hindeutet, dass sie eher als exocytosed einfach vertikal bewegt weg von einer Ebene des Fokus. Auch offenbart ist putative Fusions MES und AES, durch Visualisierung der Überlappung zwischen den beiden Farbstoff-enthaltenden Strukturen, wie in je drei orthogonalen Projektionen angesehen.

Die dargestellten Daten sind aus Schlangenneuromuskuläre Terminals (siehe niedriger und hoher Vergrößerung Blick in Abbildung 3, die endozytischen Farbstoff (FM1-43)-Aufnahme erzeugt eine Trübung, die jeden bouton füllt) und insbesondere macroendosomes (MES) und sauren Endosomen (AEs) innerhalb dieser Klemmen 5. KU werden von Groß Endozytose neuronale Aktivität während 10 erstellt, und ihre Zahl sinkt exponentiell mit der Zeit nach Aktivität 6 eingestellt. Verwe...

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Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Vierdimensionalen (4D)-Bildgebung verwendet werden, um das Verhalten und die Interaktionen zwischen den zwei Arten von Endosomen in lebenden Wirbeltier-Nervenenden zu studieren. Bewegung dieser kleinen Strukturen in drei Dimensionen gekennzeichnet, wodurch Bestätigung von Veranstaltungen wie Endosomen Fusion und Exozytose.

Visualisierung der Endosomen Dynamics in lebenden Nerven Klemmen mit Vier-dimensionale Fluoreszenz-Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

visualization-endosome-dynamics-living-nerve-terminals-with-four

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.9K Aufrufe.  Washington University School of Medicine.  Vierdimensionalen (4D)-Bildgebung verwendet werden, um das Verhalten und die Interaktionen zwischen den zwei Arten von Endosomen in lebenden Wirbeltier-Nervenenden zu studieren. Bewegung dieser kleinen Strukturen in drei Dimensionen gekennzeichnet, wodurch Bestätigung von Veranstaltungen wie Endosomen Fusion und Exozytose. 

Serie: Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Preparation of Living Isolated Vertebrate Photoreceptor Cells for Fluorescence Imaging

In the vertebrate retina, phototransduction, the conversion of light to an electrical signal, is carried out by the rod and cone photoreceptor cells1-4. Rod photoreceptors are responsible for vision in dim light, cones in bright light. Phototransduction takes place in the outer segment of the photoreceptor cell, a specialized compartment that contains a high concentration of visual pigment, the primary light detector. The visual pigment is composed of a chromophore, 11-cis retinal, attached to a protein, opsin. A photon absorbed by the visual pigment isomerizes the chromophore from 11-cis to all-trans. This photoisomerization brings about a conformational change in the visual pigment that 
initiates a cascade of reactions culminating in a change in membrane potential, and bringing about the transduction of the light stimulus to an electrical signal. The 
recovery of the cell from light stimulation involves the deactivation of the intermediates activated by light, and the reestablishment of the membrane potential. Ca2+ modulates the activity of several of the enzymes involved in phototransduction, and its concentration is reduced upon light stimulation. In this way, Ca2+ plays an important role in the recovery of the cell from light stimulation and its adaptation to background light.
Another essential part of the recovery process is the regeneration of the visual pigment that has been destroyed during light-detection by the 
photoisomerization of its 11-cis chromophore to all-trans5-7. This regeneration begins with the release of all-trans retinal by 
the photoactivated pigment, leaving behind the apo-protein opsin. The released all-trans retinal is rapidly reduced in a reaction utilizing NADPH to all-
trans retinol, and opsin combines with fresh 11-cis retinal brought into the outer segment to reform the visual pigment. All-trans retinol is 
then transferred out of the outer segment and into neighboring cells by the specialized carrier Interphotoreceptor Retinoid Binding Protein (IRBP).
Fluorescence imaging of single photoreceptor cells can be used to study their physiology and cell biology. Ca2+-sensitive fluorescent dyes can be used to examine in detail the interplay between outer 
segment Ca2+ changes and response to light8-12 as well as the role of inner segment Ca2+ stores in Ca2+ homeostasis13,14. 
Fluorescent dyes can also be used for measuring Mg2+ concentration15, pH, and as tracers of aqueous and membrane compartments16. 
Finally, the intrinsic fluorescence of all-trans retinol (vitamin A) can be used to monitor the kinetics of its formation and removal in single 
photoreceptor cells17-19.

A method is described for the preparation of single living photoreceptor cells from different vertebrate species for fluorescence imaging. The method can be used to image the fluorescence of endogenous fluorophores, such as NADH or vitamin A, or that of exogenously added fluorescent dyes sensitive to Ca2+ or other factors.

Vorbereitung der Lebens-Isolated Vertebrate Sehzellen für Fluoreszenz-Imaging

In the vertebrate retina, phototransduction, the conversion of light to an electrical signal, is carried out by the rod and cone photoreceptor cells1-4.  ...

Forschung

Neurowissenschaften

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

Patch-Clamp Kapazitätsmessungen und Ca 2 + Imaging bei Single Nervenendigungen in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualisierung von Propriozeptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Puppen

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for using blood oxygen level dependent (BOLD) functional magnetic resonance imaging (fMRI) to image rodents with simultaneous DBS. DBS fMRI presents a number of technical challenges, including accuracy of electrode implantation, MR artifacts created by the electrode, choice of anesthesia and paralytic to minimize any neuronal effects while simultaneously eliminating animal motion, and maintenance of physiological parameters, deviation from which can confound the BOLD signal.&#160;Our laboratory has developed a set of procedures that are capable of overcoming most of these possible issues. For electrical stimulation, a homemade tungsten bipolar microelectrode is used, inserted stereotactically at the stimulation site in the anesthetized subject. In preparation for imaging, rodents are fixed on a plastic headpiece and transferred to the magnet bore. For sedation and paralysis during scanning, a cocktail of dexmedetomidine and pancuronium is continuously infused, along with a minimal dose of isoflurane; this preparation minimizes the BOLD ceiling effect of volatile anesthetics. In this example experiment, stimulation of the subthalamic nucleus (STN) produces BOLD responses which are observed primarily in ipsilateral cortical regions, centered in motor cortex. Simultaneous DBS and fMRI allows the unambiguous modulation of neural circuits dependent on stimulation location and stimulation parameters, and permits observation of neuronal modulations free of regional bias. This technique may be used to explore the downstream effects of modulating neural circuitry at nearly any brain region, with implications for both experimental and clinical DBS.

This protocol describes a standard method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and deep brain stimulation in the rodent. The combined use of these experimental tools allows for the exploration of global downstream activity in response to electrical stimulation at virtually any brain target.

Deep Brain Stimulation mit gleichzeitiger fMRT in Nagetiere

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and postsynaptic projections to the visual cortex. Based on its distinct anatomical structure and convenient accessibility, it has become the favored structure for studies on neuronal survival, axonal regeneration, and synaptic plasticity. Recent advancements in MR imaging have enabled the in vivo visualization of the retino-tectal part of this projection using manganese mediated contrast enhancement (MEMRI). Here, we present a MEMRI protocol for illustration of the visual projection in mice, by which resolutions of (200 &#181;m)3 can be achieved using common 3 Tesla scanners. We demonstrate how intravitreal injection of a single dosage of 15 nmol MnCl2 leads to a saturated enhancement of the intact projection within 24 hr. With exception of the retina, changes in signal intensity are independent of coincided visual stimulation or physiological aging. We further apply this technique to longitudinally monitor axonal degeneration in response to acute optic nerve injury, a paradigm by which Mn2+ transport completely arrests at the lesion site. Conversely, active Mn2+ transport is quantitatively proportionate to the viability, number, and electrical activity of axon fibers. For such an analysis, we exemplify Mn2+ transport kinetics along the visual path in a transgenic mouse model (NF-&#954;B p50KO) displaying spontaneous atrophy of sensory, including visual, projections. In these mice, MEMRI indicates reduced but not delayed Mn2+ transport as compared to wild type mice, thus revealing signs of structural and/or functional impairments by NF-&#954;B mutations.
In summary, MEMRI conveniently bridges in vivo assays and post mortem histology for the characterization of nerve fiber integrity and activity. It is highly useful for longitudinal studies on axonal degeneration and regeneration, and investigations of mutant mice for genuine or inducible phenotypes.

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

This video illustrates a method, using a clinical 3 T scanner, for contrast-enhanced MR imaging of the na&#239;ve mouse visual projection and for repetitive and longitudinal in vivo studies of optic nerve degeneration associated with acute optic nerve crush injury and chronic optic nerve degeneration in knock-out mice (p50KO).

In-vivo-Imaging von Optic Nerve Fiber Integrität von Contrast-Enhanced MRI in Mäuse

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamik in Cone Photorezeptor Axonterminalen des Maus-Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles in the skin of the mouse pinna. The preparation is simple and relatively fast, reliably yielding extensive regions of multiple labeled units of living nerve terminals to study uptake and release of styryl pyridinium dyes extensively used in studies of vesicle recycling. Subdividing the preparations before labeling allows test vs. control comparisons in the same ear from a single individual. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the labeling and the imaging parameters. This new system is suitable for assaying pharmacologically and mechanically-induced uptake and release of these vital dyes in lanceolate terminals in both wild-type and genetically modified animals. Examples of modulatory influences on labeling intensity are given.

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

Optische Überwachung der Lebensnervenendigung Beschriften in Haarfollikel Lanceolate Endigungen der<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Maus-Ohr-Haut

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into extracellular plaques of the brain. The A&#946; peptides, composed of 40 amino acids, are generated from amyloid precursor proteins (APP) by &#946;- and &#947;-secretases. A&#946; is deposited not only in cerebral parenchyma but also in leptomeningeal and cerebral vessel walls, known as cerebral amyloid angiopathy (CAA). While a variety of A&#946; peptides were identified, the detailed production and distribution of individual A&#946; peptides in pathological tissues of AD and CAA have not been fully addressed. Here, we develop a protocol of matrix-assisted laser desorption/ionization-based imaging mass spectrometry (MALDI-IMS) on human autopsy brain tissues to obtain comprehensive protein mapping. For this purpose, human cortical specimens were obtained from the Brain Bank at the Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology. Frozen cryosections are cut and transferred to indium-tin-oxide (ITO)-coated glass slides. Spectra are acquired using the MALDI system with a spatial resolution up to 20 &#181;m. Sinapinic acid (SA) is uniformly deposited on the slide using either an automatic or a manual sprayer. With the current technical advantages of MALDI-IMS, a typical data set of various A&#946; species within the same sections of human autopsied brains can be obtained without specific probes. Furthermore, high-resolution (20 &#181;m) imaging of an AD brain and severe CAA sample clearly shows that A&#946;1-36 to A&#946;1-41 were deposited into leptomeningeal vessels, while A&#946;1-42 and A&#946;1-43 were deposited in cerebral parenchyma as senile plaque (SP). It is feasible to adopt MALDI-IMS as a standard approach in combination with clinical, genetic, and pathological observations in understanding the pathology of AD, CAA, and other neurological diseases based on the current strategy.

Visualization of Amyloid &amp;#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Molecular imaging with matrix-assisted laser desorption/ionization-based imaging mass spectrometry (MALDI-IMS) allows the simultaneous mapping of multiple analytes in biological samples. Here, we present a protocol for the detection and visualization of amyloid &#946; protein on brain tissues of Alzheimer&#39;s disease and cerebral amyloid angiopathy samples using MALDI-IMS.

Visualisierung von Amyloid-β-Einlagen in das menschliche Gehirn mit Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung bildgebende Massenspektrometrie

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into ...

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial organization of synaptic vesicles. In order to obtain high-quality electron micrographs that can yield the degree of morphological detail necessary for quantitative analysis of pre-synaptic vesicle distribution, optimal specimen preparation is critical. Chemical fixation is the first step in the process of specimen preparation, and of utmost importance to preserve fine ultrastructure. Vascular fixation with a glutaraldehyde-formaldehyde solution, followed by treatment of vibratome-sectioned specimens with osmium tetroxide, stabilizes the maximum number of molecules, especially proteins and lipids, and results in superior conservation of ultrastructure. Tissue is then processed with counterstaining, sequential dehydration and resin-embedding. En bloc staining with uranyl acetate (i.e., staining of vibratome-sectioned tissue before resin embedding) enhances endogenous contrast and stabilizes cell components against extraction during specimen processing. Contrast can be further increased by applying uranyl acetate as a post-stain on ultrathin sections. Double-staining of ultrathin sections with lead citrate after uranyl acetate treatment also improves image resolution, by intensifying electron-opacity of nucleic acid-containing structures through selective binding of lead to uranyl acetate. Transmission electron microscopy is a powerful tool for characterization of the morphological details of synaptic vesicles and quantification of their size and spatial organization in the terminal bouton. However, because it uses fixed tissue, transmission electron microscopy can only provide indirect information regarding living or evolving processes. Therefore, other techniques should be considered when the main objective is to study dynamic or functional aspects of synaptic vesicle trafficking and exocytosis.

We describe procedures for processing newborn rat brain tissue to obtain high-resolution electron micrographs for morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals. The micrographs obtained with these methods can also be used to study the morphology of a number of other cellular components and their dimensional structural relationships.