Dieser in vitro bildgebende Assay ermöglicht es, die Wirkung verschiedener Zellbehandlungen oder verschiedener Genotypen auf die mikrogliale Phagozytose zu quantifizieren. Unter Verwendung von zwei Zelltypen, die für neurodegenerative Erkrankungen relevant sind, verwenden wir tote Neuroblastomzellen für die phagozytäre Ladung, die so vorbereitet werden, dass sie durch große hochauflösende Bildgebungsbildschirme einfach und kostengünstig skaliert werden können. In einer biologischen Sicherheitswerkbank der Klasse 2 dissoziieren Sie SH-SY5Ys durch Absaugen des Mediums.
Fügen Sie 4 ml Zelldissoziationspuffer hinzu und entfernen Sie den Puffer sofort, so dass weniger als 1 ml als dünner Film übrig bleibt, der die Zellen bedeckt. 2 bis 3 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren. Dann bei 10 ml HBSS in den T-75-Kolben.
Und pipette die SH-SY5Ys in ein 15 ml konisches Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 400xG für 5 Minuten. Saugen Sie den Überstand an und suspendieren Sie die Zellen in 2 ml phenolrotfreiem HEPES-gepufferten Medium, um sicherzustellen, dass Klumpen vor der Fixierung aufgebrechen werden.
Fixieren Sie die Zellen, indem Sie 2 ml 4% Power-Formaldehyd in das Röhrchen geben und 10 Minuten bei Raumtemperatur mit gelegentlichem sanftem Rühren inkubieren. Fügen Sie 10 ml HBSS in die Tube hinzu. Dann zentrifugieren Sie bei 1200xG für 7 Minuten.
Saugen Sie den Überstand an und suspendieren Sie das Zellpellet in 2 ml phenolrotfreiem HEPES-gepufferten Medium. Zählen und entfernen Sie 1 Million HS-SY5Y-Zellen in ein 2 ml proteinarmes Röhrchen. Bringen Sie das Gesamtvolumen mit phenolrotfreien HEPES-gepufferten Medien auf 300 bis 500 Mikroliter.
Anschließend die Tube in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad kurz erwärmen. Rekonstituieren Sie den pH-empfindlichen roten Fluoreszenzfarbstoff STP-Ester gemäß den Anweisungen des Herstellers. Dann fügen Sie 12,5 Mikrogramm Farbstoff pro Million SH-SY5Y-Zellen hinzu.
Mischen Sie vorsichtig, indem Sie die Röhre streichen. Und inkubieren Sie die Röhre bei Raumtemperatur für 30 Minuten, geschützt vor Licht. Fügen Sie 1 ml HBSS und Zentrifuge bei 1200xG für 7 Minuten und 4 Grad Celsius hinzu.
Verwerfen Sie den Überstand. Und mit 2 ml HBSS waschen. Suspendieren Sie das Zellpellet in phenolrotfreien Makrophagenmedien auf eine Konzentration von 0,2 bis 1,2 Millionen Zellen pro ml, so dass 50 Mikroliter 10.000 bis 60.000 Zellen enthalten.
Bereiten Sie in einer biologischen Sicherheitswerkbank eine Lösung aus tiefroten fluoreszierenden Zelldurchlässigkeitsstoffen Succinimidylester-reaktiven Farbstoffen in Makrophagenmedien vor. Fügen Sie Hoechst 33342 hinzu und erwärmen Sie die Arbeitslösung in einem Wasserbad auf 37 Grad Celsius. Saugen Sie das iPSC-Makrophagenmedium schonend an, indem Sie den Zellüberstand mit einer Mehrkanalpipette in ein steriles Reservoir pipettieren.
70 Mikroliter pro Vertiefung der Farbstofflösung werden den iPSC-Makrophagen mit einer Mehrkanalpipette hinzugefügt. 1 Stunde bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren. Reparieren Sie experimentelle Behandlungen in phenolrotfreien Makrophagenmedien.
Nach der Inkubation das iPSC-Makrophagenmedium sehr vorsichtig mit einer Mehrkanalpipette absaugen und 100 Mikroliter HBSS pro Vertiefung hinzufügen. HBSS sofort durch sanftes Pipettieren entfernen. Dann fügen Sie 100 Mikroliter phenolrotfreie Makrophagenmedien sowie experimentelle Behandlungen in separaten Vertiefungen hinzu.
10 Minuten bis 1 Stunde bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 50 Mikroliter der markierten SH-SY5Ys pro Vertiefung von den Seiten jeder Vertiefung am Rand der Flüssigkeit hinzuzufügen. Dann bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 3 bis 5 Stunden inkubieren.
Nach der Phagozytose-Inkubation Zellüberstände durch Pipettieren mit einer Mehrkanalpipette vorsichtig absaugen und entsorgen. Einmal mit 100 Mikrolitern PBS waschen. Dann fixieren Sie die Zellen, indem Sie 100 Mikroliter 2% Power-Formaldehyd hinzufügen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Saugen Sie Vertiefungen an und fügen Sie 100 Mikroliter PBS hinzu. Fahren Sie entweder direkt mit der Bildgebung mit dem Hochgehaltsmikroskop fort oder decken Sie sie mit Plattenversiegelung und Folie ab und lagern Sie die Platte bei 4 Grad Celsius, bis sie erforderlich ist. Schalten Sie das hochauflösende Bildgebungsmikroskop ein und öffnen Sie die Bilderfassungssoftware.
Laden Sie die Assay-Platte in das Mikroskop, indem Sie auf das LOAD"-Symbol oben auf dem Bildschirm klicken. Wählen Sie die Registerkarte SETUP". Wählen Sie in den Dropdown-Menüs oben links den entsprechenden Plattentyp aus.
Die Autofokus-Option:zwei Spitze"Das Objektiv:40x Wasser, NA 1.1"Konfokale"Modus und Binning von 1. Spülen Sie das 40x Wasserobjektiv vor Gebrauch über das Einstellungsmenü. Verwenden Sie im Kanalauswahlfeld das Plussymbol, um die Kanäle DAPI, Alexa 647 und Alexa 568 hinzuzufügen.
Stellen Sie diese so ein, dass sie auf einer einzigen Ebene von einem Mikrometer messen. Optimieren Sie die Zeit- und Leistungseinstellungen für die Färbeeffizienz der Assay-Platte. Stellen Sie sicher, dass die Kanäle nicht gleichzeitig gemessen werden, indem Sie auf Kanalsequenz klicken, um die Kanäle zu trennen.
Wählen Sie unter Navigation und Layout definieren die Messbohrungen und 9 bis 12 Felder pro Vertiefung aus. Klicken Sie während der Einrichtung auf ein repräsentatives Feld auf der Plattenkarte. Und überprüfen Sie jeden Messkanal nacheinander, um sicherzustellen, dass die Flecken vorhanden sind und dass die Bilder durch Anpassen des Kanalversatzs fokussiert werden.
Um die Daten zur Fernanalyse auf einen Server hochzuladen, klicken Sie auf das Feld "Online-Jobs" und den entsprechenden Bildschirmnamen. Speichern Sie das Assay-Protokoll, indem Sie auf die Schaltfläche "Speichern" klicken und oben auf die Registerkarte "Experiment ausführen" klicken. Nennen Sie die Experimentplatte, dann klicken Sie auf Start"Ein Phagozytose-Assay zeigte, dass mit 10.000 SH-SY5Ys pro Vertiefung die Anzahl der Phagozytosepartikel pro Zelle linear mit der Zeit anstieg und durch Cytochalasin D um etwa 50% gehemmt wurde.Bei höheren Mengen an SH-SY5Ys pro Vertiefung zeigte die Phagozytose eine schlechte Linearität, wahrscheinlich aufgrund einer schlechten Segmentierung von iPSC. Makrophagen und SH-SY5Ys in einem überfüllten Sichtfeld.
Die folgenden Ergebnisse wurden durch die Durchführung einer festzelligen Bildgebung mit hohem Gehalt, einschließlich dieses repräsentativen Bildes der Phagozytose, erzielt. Die Erhöhung der Menge an SH-SY5Ys führte zu einer höheren Anzahl von phagozytierten Partikeln pro Zelle. Der Phagozytose-Assay wurde mit mehreren Phagozytose-Inhibitoren validiert.
Cytochalasin D und Jasplakinolid hemmten die Phagozytose signifikant um 91 bzw. 90 Prozent. Und Bafilomycin A1 reduzierte die Phagozytose signifikant um 31%, wenn es 1 Stunde vor der Phagozytose vorinkubiert wurde. Die Zugabe von rekombinantem Annexin 5 reduzierte die Phagozytose signifikant um 30%, wenn sie den Vertiefungen unmittelbar vor der SH-SY5Y-Zugabe zugesetzt wurde.
Fix SH-SY5Ys wir haben bestätigt, Phosphatidylserin mit einer fluoreszierenden Annexin 5-Sonde freizulegen. Während lebende SH-SY5Ys für die Färbung nach Anhang 5 negativ waren. Mehrere Längen der Phagozytosedauer, von 1 bis 5 Stunden, wurden mit gestaffelter Zugabe von phagozytischer Ladung getestet.
Die Gesamtlänge dieses Protocalls kann verkürzt werden, indem die phagozytische Ladung vorbereitet und die iPSC-Makrophagen parallel gefärbt werden. Wenn Sie dies tun möchten, erarbeiten Sie die Timings im Voraus und verwenden Sie Ihre Inkubationen, um Lösungen für die zukünftigen Schritte vorzubereiten.
