This work received support through grant HA 6136/1-1 from the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) to MH. JAT is supported by Program and Project Grants from the National Health and Medical Research Council of Australia.

HINWEIS: Die Milz wurde aus Mäusen (6-10 Wochen alt) und alle Tierversuche wurden nach den Tierethik Richtlinien der Peter MacCallum Cancer Center (E486) durchgeführt. 1. Vorbereitung der Proben. <ol><li> Herstellung von aktivierten Maus-NK-Zellen. <ol><li> Isolieren Primär naive NK-Zellen von Einzelzellsuspensionen von den Milzen von C57BL / 6 oder B6.GrzmB - / - (GzmB Gen null) Mäusen durch negative Selektion unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Kits. </li><li> Folgen Protokoll der Hersteller. Kurz gesagt, magnetisch zu markieren &quot;nicht-NK&quot; Zellen, wie T- und B-Zellen, dendritischen Zellen, Granulozyten, Makrophagen und Erythrozyten unter Verwendung von Biotin-konjugiertem Antikörper gegen ihre spezifischen Oberflächenmarkern. Verwenden magnetischer Trennung mit Anti-Biotin-Perlen zu &quot;nicht-NK&quot; Zellen abzureichern. </li><li> Kultur isoliert NK-Zellen für 5-7 Tage in Medium, das IL-2 (1.000 U / ml) bei 700000 Zellen / ml in 24-Well-Plattenbei 37 &#160; ° C. </li><li> Alternativ aktiviert Verwendung T-Zellen 19, primäre Antigen-restringierte CTL aus OT1 T-Zell-Rezeptor-transgenen Mäusen 20 erzeugte CTL in gemischten Lymphozyten-Kulturen 21 oder Überständen von aktivierten NK-Zellen, um die Aktivität der sekretierten GzmB 19 bestimmen. </li></ol></li><li> Wartung der menschlichen NK-Zelllinie und Isolierung von primären NK-Zellen. <ol><li> Pflege der menschlichen NK Leukämie (YT-Zellen) in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium mit 10% fötalem Kälberserum ergänzt. Alternativ reinigen primären NK-Zellen aus dem peripheren Blut von gesunden Probanden und für 2-3 Tage in einem Medium anzuregen, das IL-2 bei 100 U / ml, wie zuvor beschrieben 22. </li></ol></li><li> Erzeugung von Zelllysaten. <ol><li> Wash-Zellen dreimal in PBS (pH 7,4), dann in Nonidet P-40 Lysepuffer auszusetzen (0,1% NP-40, 250 mM NaCl, 25 mM Hepes, 2,5 mM EDTA). Idealerweise Lyse von mindestens 5 x 10 6 </sbis&gt; NK-Zellen oder 1 · 10 7 T-Zellen in 100 ul Puffer. Nicht hinzufügen Proteaseinhibitoren, wie viele sind irreversible Inhibitoren von Serinproteasen, insbesondere Tryptasen wie GZMA. Inkubieren auf Eis für 20 min, und dann die Kerne zu pelletieren in einer Mikrozentrifuge bei 15.000 × g für 10 min. Entsorgen Sie die Kernpellet und den Überstand in ein frisches Röhrchen. </li></ol></li><li> Bestimmung der Proteinkonzentration der Lysate. <ol><li> Verwenden Sie ein handelsübliches Protokoll der Wahl, wie Bradford oder Bicinchoninsäure (BCA) und bestimmen Sie die Proteinkonzentration. Sicherzustellen, dass die Konzentration von ~ 2 mg / ml Minimum. Speicher Lysate bei -20 ° C bis zur Verwendung (Granzym-Aktivität ist für viele Monate bei -20 ° C stabil). </li></ol></li></ol> 2. Granzyme B-Aktivitätstest <ol><li> Herstellung der Reagenzien <ol><li> Bereiten Sie eine 10 mM Stamm der Substrate (Boc-AAD-S-Bzl oder Ac-IEPD-pNA) in DMSO (~ 5 mg / ml) und lagern bei -20 &amp; #176; C. Bereiten Sie eine Arbeitsverdünnung frisch und entsorgen Sie nach jedem Tag, als Boc-AAD-S-Bzl teilweise bei der Lagerung in DMSO hydrolysiert. </li><li> Bereiten Sie eine 250 mM Stamm der farbmetrischen Reagenz (5,5&#39;-Dithio-bis (2-nitrobenzoesäure), DTNB) in DMSO (0,09 g / ml) und bei -20 ° C. Bereiten Sie jeden Tag eine neue Arbeitsverdünnung. Dieses Reagenz ist nur für Substrate mit SBzl Indikatorgruppen nicht pNA erforderlich. </li><li> Make-up frischen Puffer (0,1 M HEPES, 0,05 M MgCl 2, pH 7,3), alle 2-3 Wochen. </li></ol></li><li> Bringen DTNB und synthetische Substrate auf Raumtemperatur. Verdünnen Substrate (01.16, zB 100 ul in 1,6 ml Puffer) und DTNB (1: 250, beispielsweise 10 &amp; mgr; l in 2,5 ml Puffer) und gut mischen. </li><li> Verdünne ein Minimum von 100 &amp; mgr; g Protein-Lysat von jeder Probe in einem Puffer, um ein Endvolumen von 160 ul. Mit einer Mehrkanal-Pipette werden 50 ul pro Vertiefung in dreifacher Ausfertigung (~ 33,3 ug / Vertiefung) in einer &#39;&#39; U &#39;&#39; bottom Vinyl Platte mit 96 Vertiefungen.Fügen Sie eine &quot;Puffer-only&quot; Kontrolle (auch in dreifacher Ausfertigung). </li><li> 100 l verdünnt DTNB zu der Proben / Pufferkontrolle (bei der Arbeit mit Ac-IEPD-pNA lassen Sie diesen Schritt. HINWEIS: Die Spaltung von Ac-IEPD-pNA durch GzmB direkt frei fluorogenen pNA (4B). </li><li> Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette um 50 ul verdünnt Substrate auf jeden Satz von dreifach schnell hinzufügen, beginnend mit dem Puffer dann negative Kontrollen und endend mit erwarteten positiven Proben. </li><li> Die Platte wird in der Plattenlesegerät. Messen Asp-ase-Aktivität durch Hydrolyse von Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl / Ac-IEPD-pNA in einem Mikroplatten-Lesegerät bei OD 405 nm. Verwenden Sie eine kinetische Assay-Protokoll, nehmen 25 Lesungen, alle 15 Sekunden (ca. 6 min Gesamtlesezeit). </li><li> Verwenden Sie die Absorptionswerte zu jedem Zeitpunkt erzeugt werden, um manuell berechnen die Geschwindigkeit der Spaltung des Substrats, wenn die Software des Plattenlesegerät kann kein Wert für Vmax zu generieren. </li></ol> 3. Analyse Data Hinweis: die erzeugt wird, wenn die maximale Geschwindigkeit präsentierten Daten, definiert als Veränderung der OD über die Zeit (mOD / min). <ol><li> Um die Daten zu analysieren, zu bestimmen, die maximale Geschwindigkeit der Spaltung des Substrats, die von der Änderungsrate der Extinktion berechnet wird. Tun Sie dies automatisch mit dem Plattenlesegerät-Software, die in der Regel hat diese Option. </li><li> Alternativ nach der Anzeige der kinetischen Grundabsorptionsänderung, die während der kinetischen Assay auf dem Plattenlesegerät erzeugt werden, manuell auswählen, die Datenpunkte, die den steilsten gerade Linie zu geben. Für die meisten Tests wird innerhalb der ersten 2 min des Tests die maximale Rate erreicht. </li><li> Subtrahieren Sie die Anfangs-OD Lesung aus dem höchsten OD-Wert auf dieser geraden Linie und Gefälle durch das Zeitintervall. Übertragen Sie Rohdaten an Microsoft Excel / Graph-Pad für die statistische Analyse und grafische Darstellung. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Historisch die Granzyme wurden als Schlüssel Effektormoleküle zytotoxischer Lymphozyten (CTL und NK-Zellen), die zur Induktion einer schnellen apoptotischen Tod in Zielzellen identifiziert. Dies war vor allem auf die Wirkung von GzmB, das Zielsubstrat Moleküle an Aspartat (D) Reste gespalten und somit konnte die Caspase-Kaskade von beiden spalten pro-Caspasen zu aktivieren, sowie mehrere ihrer nachgelagerten Ziele. Es ist jedoch nun ersichtlich, dass GzmB Expression ist nicht auf lymphoide zytotoxischen Zellen beschr...

Granzyme sind eine Familie von Serin-Proteasen, die in den sekretorischen Lysosomen von natürlichen Killerzellen (NK) und zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) 1 gefunden. Fünf verschiedene Granzyme im Menschen vorhanden (A, B, H, K und M), und zehn Mäuse (A - G, K, M und N) 2,3. Granzyme A und Granzyme B (GZMA, GzmB) sind die häufigsten und wurden umfangreich im menschlichen und Nagetier-Einstellung untersucht. Die klassische Funktion GzmB ist die Induktion von Apoptose in Zielzellen in Verbindung mit der porenbildende Protein von Perforin, Granzym, die die an die Zielzelle Cytosol 4 Zugriff ermöglicht ausgeführt. Obwohl GzmB Expression unzweideutig in zytotoxischen Lymphozyten haben neuere Studien wurden zu einer Vielzahl anderer GzmB exprimierenden Zelltypen, einschließlich, aber nicht beschränkt Keratinozyten 5, 6 Basophilen, Mastzellen 7, plasmacytoid dendritischen Zellen 8, 9 und B-Zellen, 10.In diesem Zusammenhang wurden nicht-apoptotischen GzmB Funktionen ergeben, die von der Teilnahme an entzündlichen Prozessen, Gewebeumbau und anderen immunregulatorischen Eigenschaften 14.11. Da eine breitere biologische Rolle für GzmB als bisher vermutet vorgeschlagen, Forschern erfordern zuverlässige und spezifische Werkzeuge für die Erkennung. Von Vorteil ist, GzmB die ausdrückliche Verpflichtung, in der Carboxylseite von Asparaginsäurereste, eine Eigenschaft, einzigartig unter den eukaryotischen Serinproteasen 15 zu spalten. Maus, Ratte und Mensch sind GzmB strukturell sehr ähnlich, aber die erweiterten Substratspezifität der Maus GzmB unterscheidet dezent von der Ratte und Mensch 16, was bedeutet, dass bestimmte allgemeine Substraten mit Asp an der Klemme (P1) effizient durch GzmB gespalten von allen drei Spezies, während andere Substrate mit komplizierteren Sequenzen stromaufwärts von P1 kann stark unterschiedliche Ergebnisse ergeben. In der Vergangenheit und neuere literature hat diese Tatsache erhebliche Verwirrung und Fehlinterpretation der biologische Bedeutung einiger experimenteller Befunde verursacht, obwohl sorgfältig kontrolliert wurden kinetische Untersuchungen versucht, die Lage 17 zu korrigieren. In dieser Arbeit haben wir versucht, diese Punkte unter Verwendung von zwei im Handel erhältliche Substrate, nämlich Boc-Ala-Ala-Asp-SBzl und N-acetyl-Ile-Glu-Pro-Asp-p-Nitroanilid zu illustrieren. Die beiden Reagenzien zu tun erzeugen unterschiedliche reaktive Gruppen nach der Spaltung (eine freie Sulfhydryl gegenüber einer Leuchtstoff kostenlos Paranitroanilid), aber dies berührt in keiner Weise auf die proteolytische Spaltung. Das beschriebene Protokoll ist eine moderne Adaption eines sehr alten Protokoll 18, sollte aber helfen Forschern, die verschiedenen GzmB Substrate angemessen zu nutzen, sondern schafft auch einen methodischen Rahmen zur Erfassung der Aktivität von anderen Granzyme wie GZMA und GzmH.

<table><tbody><tr><td>Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl</td><td>SM Biochemicals LLC, CA</td><td>SMSB05</td><td>Granzyme B substrate (mouse and human)</td></tr><tr><td>Ac-IEPD-pNA&amp;nbsp;</td><td>SM Biochemicals LLC, CA</td><td>SMPNA009</td><td>Granzyme B substrate (only human)</td></tr><tr><td>N-&amp;#945;-CBZ-L-lysine-S-Bzl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3647</td><td>Granzyme A substrate</td></tr><tr><td>Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl</td><td>SM Biochemicals LLC, CA</td><td>SB025</td><td>Granzyme H substrate</td></tr><tr><td>5,5&amp;rsquo;-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8130</td><td>DTNB, Ellman&amp;rsquo;s Reagent</td></tr><tr><td>NK cell isolation kit II mouse</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-096-892</td><td>negative selection kit</td></tr><tr><td>NK cell isolation kit human</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-092-657</td><td>negative selection kit</td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>Biorad iMark</td><td></td><td>Biorad Microplate Manager Software Version MPM6.3</td></tr><tr><td>Serocluster U-bottom vinyl 96-well plate</td><td>Corning, MA, USA</td><td>2797</td><td></td></tr></tbody></table>

a colorimetric assay that specifically measures granzyme b proteolytic activity: hydrolysis of boc-ala-ala-asp-s-bzl

The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is the most studied granzyme in humans and mice and therefore, researchers need specific and reliable tools to study its function and role in pathophysiology. This especially necessitates assays that do not recognize proteases such as caspases or other granzymes that are structurally or functionally related. Here, we apply GzmB&#8217;s preference for cleavage after aspartic acid residues in a colorimetric assay using the peptide thioester Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. GzmB is the only mammalian serine protease capable of cleaving this substrate. The substrate is cleaved with similar efficiency by human, mouse and rat GzmB, a property not shared by other commercially available peptide substrates, even some that are advertised as being suitable for this purpose. This protocol is demonstrated using unfractionated lysates from activated NK cells or CTL and is also suitable for recombinant proteases generated in a variety of prokaryotic and eukaryotic systems, provided the correct controls are used. This assay is a highly specific method to ascertain the potential pro-apoptotic activity of cytotoxic molecules in mammalian lymphocytes, and of their recombinant counterparts expressed by a variety of methodologies.

Die Boc-AAD-S-Bzl Substrat spezifisch für GzmB Die Serinprotease GzmB ist ein Hauptbestandteil von zytotoxischen Lymphozyten (CTL und NK-Zellen) und vorwiegend zur Induzierung schnelle apoptotischen Tod in Zielzellen, wie virusinfizierte oder transformierten Zellen verantwortlich. Dies ist vor allem aufgrund der Substratpräferenz für die Spaltung nach bestimmten Aspartatreste in ausgewählten Proteinen geteilt ein Attribut mit den Caspasen, die auch nach der Aspartatreste...

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A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

We describe a simple, quantitative colorimetric assay that specifically measures the proteolytic activity of human, mouse or rat Granzyme B (GzmB). This protocol can be easily adapted for determining protease activity of other granule serine proteases by the hydrolysis of other synthetic peptide substrates with an appropriate recognition sequence.

Ein Farbtest, die speziell Maßnahmen Granzyme B Proteolytische Aktivität: Hydrolyse von Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is ...

a-colorimetric-assay-that-specifically-measures-granzyme-b

Research

JoVE Journal

Chemistry

13.0K Aufrufe.  Peter MacCallum Cancer Centre. We describe a simple, quantitative colorimetric assay that specifically measures the proteolytic activity of human, mouse or rat Granzyme B (GzmB). This protocol can be easily adapted for determining protease activity of other granule serine proteases by the hydrolysis of other synthetic peptide substrates with an appropriate recognition sequence.

Serie: A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using electrophoresis through a resolving gel embedded with a degradable substrate. This method differs from traditional gel zymography in that a quenched fluorogenic peptide is covalently incorporated into the resolving gel instead of full length proteins, such as gelatin or casein. Use of the fluorogenic peptides enables direct detection of proteolytic activity without additional staining steps. Enzymes within the biological samples cleave the quenched fluorogenic peptide, resulting in an increase in fluorescence. The fluorescent signal in the gels is then imaged with a standard fluorescent gel scanner and quantified using densitometry. The use of peptides as the degradable substrate greatly expands the possible proteases detectable with zymographic techniques.

Here, we present a detailed protocol for a modified zymographic technique in which fluorescent peptides are used as the degradable substrate in place of native proteins. Electrophoresis of biological samples in fluorescent peptide zymograms enables detection of a wider range of proteases than previous zymographic techniques.

Erkennung von Protease-Aktivität durch fluoreszierende Peptid Zymography

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Forschung

Krebsforschung

Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex

Extrinsic apoptosis is mediated by the activation of death receptors (DRs) such as CD95/Fas/APO-1 or tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)-receptor 1/receptor 2 (TRAIL-R1/R2). Stimulation of these receptors with their cognate ligands leads to the assembly of the death-inducing signaling complex (DISC). DISC comprises DR, the adaptor protein Fas-associated protein with death domain (FADD), procaspases-8/-10, and cellular FADD-like interleukin (IL)-1&#946;-converting enzyme-inhibitory proteins (c-FLIPs). The DISC serves as a platform for procaspase-8 processing and activation. The latter occurs via its dimerization/oligomerization in the death effector domain (DED) filaments assembled at the DISC. 
Activation of procaspase-8 is followed by its processing, which occurs in several steps. In this work, an established experimental workflow is described that allows the measurement of DISC formation and the processing of procaspase-8 in this complex. The workflow is based on immunoprecipitation techniques supported by western blot analysis. This workflow allows careful monitoring of different steps of procaspase-8 recruitment to the DISC and its processing and is highly relevant for investigating molecular mechanisms of extrinsic apoptosis.

Here, an experimental workflow is presented that enables the detection of caspase-8 processing directly at the death-inducing signaling complex (DISC) and determines the composition of this complex. This methodology has broad applications, from unraveling the molecular mechanisms of cell death pathways to the dynamic modeling of apoptosis networks.

Messung der Zusammensetzung von CD95 Death-Inducing Signaling Complex und Verarbeitung von Procaspase-8 in diesem Komplex

Extrinsic apoptosis is mediated by the activation of death receptors (DRs) such as CD95/Fas/APO-1 or tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ...

Biochemie

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Qualitative und quantitative Assays zur Detektion und Charakterisierung von Protein Antimikrobielle

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Immunologie und Infektion

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators and executioners of apoptosis, the most studied form of programmed cell death. Apoptosis occurs during developmental processes and is a necessary event in tissue homeostasis. Pyroptosis is another form of cell death that utilizes caspases and is a critical process in activating the immune system through the activation of the inflammasome, which results in the release of members of the interleukin-1 (IL-1) family. To assess caspase activity, target substrates can be assessed. However, sensitivity can be an issue when examining single cells or low-level activity. We demonstrate how a fluorogenic substrate can be used with a population-based assay or single-cell assay by flow cytometry. With proper controls, different amino acid sequences can be used to identify which caspases are active. Using these assays, the simultaneous loss of the inhibitors of apoptosis proteins upon tumor necrosis factor (TNF) stimulation has been identified, which primarily induces apoptosis in macrophages rather than other forms of cell death.

The present protocol describes two methods to measure caspase activity through a fluorogenic substrate using flow cytometry or a spectrofluorometer.

Messung der Caspase-Aktivität mit einem fluorometrischen Assay oder einer Durchflusszytometrie

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...

Charakterisierung der ternären Komplexbildung in PROTACs mit biophysikalischen Assays

The Development and Application of Biophysical Assays for Evaluating Ternary Complex Formation Induced by Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACS)

E3 ligases and proteins targeted for degradation can be induced to form complexes by heterobifunctional molecules in a multi-step process. The kinetics and thermodynamics of the interactions involved contribute to efficiency of ubiquitination and resulting degradation of the protein. Biophysical techniques such as surface plasmon resonance (SPR), biolayer interferometry (BLI), and isothermal titration calorimetry (ITC) provide valuable information that can be used in the optimization of those interactions. Using two model systems, a biophysical assay tool kit for understanding the cooperativity of ternary complex formation and the impact of the &#39;hook effect&#39; on binding kinetics was established. In one case, a proteolysis targeting chimera (PROTAC) molecule that induced ternary complex formation between Brd4BD2 and VHL was evaluated. The heterobifunctional molecule, MZ1, has nM affinities for both the Brd4BD2 protein (SPR KD = 1 nM, ITC KD = 4 nM) and the VHL complex (SPR KD = 29 nM, ITC KD = 66 nM). For this system, robust SPR, BLI, and ITC assays were developed that reproduced published results demonstrating the cooperativity of ternary complex formation. In the other case, a molecule that induced ternary complexes between a 46.0 kDa protein, PPM1D, and cereblon [CRBN (319-442)] was studied. The heterobifunctional molecule, BRD-5110, has an SPR KD = 1 nM for PPM1D but much weaker binding against the truncated CRBN (319-442) complex (SPR KD= ~ 3 &#181;M). In that case, the binding for CRBN in SPR was not saturable, resulting in a &#34;hook-effect&#34;. Throughput and reagent requirements for SPR, BLI, and ITC were evaluated, and general recommendations for their application to PROTAC projects were provided.

Autor im Rampenlicht: Evaluierung biophysikalischer Assays zur Charakterisierung ternärer PROTACS-Komplexe 

Here we describe protocols for the biophysical characterization of ternary complex formation induced by proteolysis targeting chimeras (PROTACS) that involve the ubiquitin ligases Von Hippel-Lindau E3 ligase (VHL) and Cereblon (CRBN). Biophysical methods illustrated herein include surface plasmon resonance (SPR), biolayer interferometry (BLI), and isothermal titration calorimetry (ITC).

Entwicklung und Anwendung biophysikalischer Assays zur Evaluierung der Bildung ternärer Komplexe, die durch Proteolyse-Targeting-Chimären (PROTACS) induziert werden

E3 ligases and proteins targeted for degradation can be induced to form complexes by heterobifunctional molecules in a multi-step process. The kinetics ...

<meta charset="utf8"></head><body>Messung der Elastase-Modulation: Ein kolorimetrischer Assay für therapeutische Erkenntnisse

Quantifying the Modulation of Elastase Enzyme Activity Through Colorimetric Analysis

Elastase, a serine protease, plays an essential role in elastin degradation. Elastin is an extracellular protein that helps maintain tissue elasticity in the lungs, skin, and blood vessels. Tight regulation of elastase activity is crucial for tissue homeostasis, as dysregulation can contribute to pathologies such as emphysema, wrinkles, and atherosclerosis. Some compounds, such as naturally occurring phytochemicals, have shown potential for therapeutic intervention and have attracted significant interest. Elucidating the modulatory effects of different compounds on elastase, whether inhibitory or stimulatory, is crucial for developing novel therapeutic and cosmetic strategies targeting elastase-associated disorders. A widely accepted method for measuring elastase activity is the colorimetric elastase assay. In this assay, a specific substrate is used to break down elastase, releasing a detectable yellow compound, p-nitroaniline (pNA). The amount of pNA produced reflects elastase activity in the sample and can be measured by colorimetry. This assay offers several benefits, including simplicity, high sensitivity, rapid results, and adaptability to various research needs. The colorimetric elastase assay remains a valuable tool for studying how compounds impact elastase activity. Due to its ease of use and effectiveness, this assay is a cornerstone of research in this field.

<meta charset="utf8"></head><body>Quantifizierung der Modulation der Elastase-Enzymaktivität durch kolorimetrische Analyse

This protocol describes the development of a colorimetric assay method for determining the ability of compounds to inhibit or activate elastase activity.

Quantifizierung der Modulation der Elastase-Enzymaktivität durch kolorimetrische Analyse

Elastase, a serine protease, plays an essential role in elastin degradation. Elastin is an extracellular protein that helps maintain tissue elasticity in ...

Ein Farbtest, die speziell Maßnahmen Granzyme B Proteolytische Aktivität: Hydrolyse von Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Erkennung von Protease-Aktivität durch fluoreszierende Peptid Zymography

Messung der Zusammensetzung von CD95 Death-Inducing Signaling Complex und Verarbeitung von Procaspase-8 in diesem Komplex

Qualitative und quantitative Assays zur Detektion und Charakterisierung von Protein Antimikrobielle

Messung der Caspase-Aktivität mit einem fluorometrischen Assay oder einer Durchflusszytometrie

Entwicklung und Anwendung biophysikalischer Assays zur Evaluierung der Bildung ternärer Komplexe, die durch Proteolyse-Targeting-Chimären (PROTACS) induziert werden

Entwicklung und Anwendung biophysikalischer Assays zur Evaluierung der Bildung ternärer Komplexe, die durch Proteolyse-Targeting-Chimären (PROTACS) induziert werden

Entwicklung und Anwendung biophysikalischer Assays zur Evaluierung der Bildung ternärer Komplexe, die durch Proteolyse-Targeting-Chimären (PROTACS) induziert werden

Quantifizierung der Modulation der Elastase-Enzymaktivität durch kolorimetrische Analyse

Quantifizierung der Modulation der Elastase-Enzymaktivität durch kolorimetrische Analyse

Quantifizierung der Modulation der Elastase-Enzymaktivität durch kolorimetrische Analyse