This work received support through grant HA 6136/1-1 from the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) to MH. JAT is supported by Program and Project Grants from the National Health and Medical Research Council of Australia.

HINWEIS: Die Milz wurde aus Mäusen (6-10 Wochen alt) und alle Tierversuche wurden nach den Tierethik Richtlinien der Peter MacCallum Cancer Center (E486) durchgeführt. 1. Vorbereitung der Proben. <ol><li> Herstellung von aktivierten Maus-NK-Zellen. <ol><li> Isolieren Primär naive NK-Zellen von Einzelzellsuspensionen von den Milzen von C57BL / 6 oder B6.GrzmB - / - (GzmB Gen null) Mäusen durch negative Selektion unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Kits. </li><li> Folgen Protokoll der Hersteller. Kurz gesagt, magnetisch zu markieren &quot;nicht-NK&quot; Zellen, wie T- und B-Zellen, dendritischen Zellen, Granulozyten, Makrophagen und Erythrozyten unter Verwendung von Biotin-konjugiertem Antikörper gegen ihre spezifischen Oberflächenmarkern. Verwenden magnetischer Trennung mit Anti-Biotin-Perlen zu &quot;nicht-NK&quot; Zellen abzureichern. </li><li> Kultur isoliert NK-Zellen für 5-7 Tage in Medium, das IL-2 (1.000 U / ml) bei 700000 Zellen / ml in 24-Well-Plattenbei 37 &#160; ° C. </li><li> Alternativ aktiviert Verwendung T-Zellen 19, primäre Antigen-restringierte CTL aus OT1 T-Zell-Rezeptor-transgenen Mäusen 20 erzeugte CTL in gemischten Lymphozyten-Kulturen 21 oder Überständen von aktivierten NK-Zellen, um die Aktivität der sekretierten GzmB 19 bestimmen. </li></ol></li><li> Wartung der menschlichen NK-Zelllinie und Isolierung von primären NK-Zellen. <ol><li> Pflege der menschlichen NK Leukämie (YT-Zellen) in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium mit 10% fötalem Kälberserum ergänzt. Alternativ reinigen primären NK-Zellen aus dem peripheren Blut von gesunden Probanden und für 2-3 Tage in einem Medium anzuregen, das IL-2 bei 100 U / ml, wie zuvor beschrieben 22. </li></ol></li><li> Erzeugung von Zelllysaten. <ol><li> Wash-Zellen dreimal in PBS (pH 7,4), dann in Nonidet P-40 Lysepuffer auszusetzen (0,1% NP-40, 250 mM NaCl, 25 mM Hepes, 2,5 mM EDTA). Idealerweise Lyse von mindestens 5 x 10 6 </sbis&gt; NK-Zellen oder 1 · 10 7 T-Zellen in 100 ul Puffer. Nicht hinzufügen Proteaseinhibitoren, wie viele sind irreversible Inhibitoren von Serinproteasen, insbesondere Tryptasen wie GZMA. Inkubieren auf Eis für 20 min, und dann die Kerne zu pelletieren in einer Mikrozentrifuge bei 15.000 × g für 10 min. Entsorgen Sie die Kernpellet und den Überstand in ein frisches Röhrchen. </li></ol></li><li> Bestimmung der Proteinkonzentration der Lysate. <ol><li> Verwenden Sie ein handelsübliches Protokoll der Wahl, wie Bradford oder Bicinchoninsäure (BCA) und bestimmen Sie die Proteinkonzentration. Sicherzustellen, dass die Konzentration von ~ 2 mg / ml Minimum. Speicher Lysate bei -20 ° C bis zur Verwendung (Granzym-Aktivität ist für viele Monate bei -20 ° C stabil). </li></ol></li></ol> 2. Granzyme B-Aktivitätstest <ol><li> Herstellung der Reagenzien <ol><li> Bereiten Sie eine 10 mM Stamm der Substrate (Boc-AAD-S-Bzl oder Ac-IEPD-pNA) in DMSO (~ 5 mg / ml) und lagern bei -20 &amp; #176; C. Bereiten Sie eine Arbeitsverdünnung frisch und entsorgen Sie nach jedem Tag, als Boc-AAD-S-Bzl teilweise bei der Lagerung in DMSO hydrolysiert. </li><li> Bereiten Sie eine 250 mM Stamm der farbmetrischen Reagenz (5,5&#39;-Dithio-bis (2-nitrobenzoesäure), DTNB) in DMSO (0,09 g / ml) und bei -20 ° C. Bereiten Sie jeden Tag eine neue Arbeitsverdünnung. Dieses Reagenz ist nur für Substrate mit SBzl Indikatorgruppen nicht pNA erforderlich. </li><li> Make-up frischen Puffer (0,1 M HEPES, 0,05 M MgCl 2, pH 7,3), alle 2-3 Wochen. </li></ol></li><li> Bringen DTNB und synthetische Substrate auf Raumtemperatur. Verdünnen Substrate (01.16, zB 100 ul in 1,6 ml Puffer) und DTNB (1: 250, beispielsweise 10 &amp; mgr; l in 2,5 ml Puffer) und gut mischen. </li><li> Verdünne ein Minimum von 100 &amp; mgr; g Protein-Lysat von jeder Probe in einem Puffer, um ein Endvolumen von 160 ul. Mit einer Mehrkanal-Pipette werden 50 ul pro Vertiefung in dreifacher Ausfertigung (~ 33,3 ug / Vertiefung) in einer &#39;&#39; U &#39;&#39; bottom Vinyl Platte mit 96 Vertiefungen.Fügen Sie eine &quot;Puffer-only&quot; Kontrolle (auch in dreifacher Ausfertigung). </li><li> 100 l verdünnt DTNB zu der Proben / Pufferkontrolle (bei der Arbeit mit Ac-IEPD-pNA lassen Sie diesen Schritt. HINWEIS: Die Spaltung von Ac-IEPD-pNA durch GzmB direkt frei fluorogenen pNA (4B). </li><li> Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette um 50 ul verdünnt Substrate auf jeden Satz von dreifach schnell hinzufügen, beginnend mit dem Puffer dann negative Kontrollen und endend mit erwarteten positiven Proben. </li><li> Die Platte wird in der Plattenlesegerät. Messen Asp-ase-Aktivität durch Hydrolyse von Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl / Ac-IEPD-pNA in einem Mikroplatten-Lesegerät bei OD 405 nm. Verwenden Sie eine kinetische Assay-Protokoll, nehmen 25 Lesungen, alle 15 Sekunden (ca. 6 min Gesamtlesezeit). </li><li> Verwenden Sie die Absorptionswerte zu jedem Zeitpunkt erzeugt werden, um manuell berechnen die Geschwindigkeit der Spaltung des Substrats, wenn die Software des Plattenlesegerät kann kein Wert für Vmax zu generieren. </li></ol> 3. Analyse Data Hinweis: die erzeugt wird, wenn die maximale Geschwindigkeit präsentierten Daten, definiert als Veränderung der OD über die Zeit (mOD / min). <ol><li> Um die Daten zu analysieren, zu bestimmen, die maximale Geschwindigkeit der Spaltung des Substrats, die von der Änderungsrate der Extinktion berechnet wird. Tun Sie dies automatisch mit dem Plattenlesegerät-Software, die in der Regel hat diese Option. </li><li> Alternativ nach der Anzeige der kinetischen Grundabsorptionsänderung, die während der kinetischen Assay auf dem Plattenlesegerät erzeugt werden, manuell auswählen, die Datenpunkte, die den steilsten gerade Linie zu geben. Für die meisten Tests wird innerhalb der ersten 2 min des Tests die maximale Rate erreicht. </li><li> Subtrahieren Sie die Anfangs-OD Lesung aus dem höchsten OD-Wert auf dieser geraden Linie und Gefälle durch das Zeitintervall. Übertragen Sie Rohdaten an Microsoft Excel / Graph-Pad für die statistische Analyse und grafische Darstellung. </li></ol>

<ol>
	<li>Trapani, J. A., Browne, K. A., Dawson, M., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunopurification+of+functional+Asp-ase+(natural+killer+cell+granzyme+B)+using+a+monoclonal+antibody).">Immunopurification of functional Asp-ase (natural killer cell granzyme B) using a monoclonal antibody).</a> Biochem Biophys Res Commun. 195 (2), 910-920 (1993).</li><li>Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quarter+century+of+granzymes.">A quarter century of granzymes.</a> Cell Death Differ. 19 (1), 28-35 (2012).</li><li>Hoves, S., Trapani, J. A., Voskoboinik, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+battlefield+of+perforin/granzyme+cell+death+pathways.">The battlefield of perforin/granzyme cell death pathways.</a> J Leukoc Biol. , (2009).</li><li>Peters, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T+lymphocyte+granules+are+secretory+lysosomes,+containing+both+perforin+and+granzymes.">Cytotoxic T lymphocyte granules are secretory lysosomes, containing both perforin and granzymes.</a> J Exp Med. 173 (5), 1099-1109 (1991).</li><li>Berthou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition+of+granzyme+B+and+Fas+ligand+proteins+by+human+keratinocytes+contributes+to+epidermal+cell+defense.">Acquisition of granzyme B and Fas ligand proteins by human keratinocytes contributes to epidermal cell defense.</a> J Immunol. 159 (11), 5293-5300 (1997).</li><li>Tschopp, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granzyme+B,+a+novel+mediator+of+allergic+inflammation:+its+induction+and+release+in+blood+basophils+and+human+asthma.">Granzyme B, a novel mediator of allergic inflammation: its induction and release in blood basophils and human asthma.</a> Blood. 108 (7), 2290-2299 (2006).</li><li>Strik, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mast+cells+produce+and+release+the+cytotoxic+lymphocyte+associated+protease+granzyme+B+upon+activation.">Human mast cells produce and release the cytotoxic lymphocyte associated protease granzyme B upon activation.</a> Mol Immunol. 44 (14), 3462-3472 (2007).</li><li>Jahrsdorfer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granzyme+B+produced+by+human+plasmacytoid+dendritic+cells+suppresses+T+cell+expansion.">Granzyme B produced by human plasmacytoid dendritic cells suppresses T cell expansion.</a> Blood. , (2009).</li><li>Hagn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+B+cells+secrete+granzyme+B+when+recognizing+viral+antigens+in+the+context+of+the+acute+phase+cytokine+IL-21.">Human B cells secrete granzyme B when recognizing viral antigens in the context of the acute phase cytokine IL-21.</a> J Immunol. 183 (3), 1838-1845 (2009).</li><li>Hagn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+B+cells+differentiate+into+granzyme+B-secreting+cytotoxic+B+lymphocytes+upon+incomplete+T-cell+help.">Human B cells differentiate into granzyme B-secreting cytotoxic B lymphocytes upon incomplete T-cell help.</a> Immunol Cell Biol. 90 (4), 457-467 (2012).</li><li>Froelich, C. J., Pardo, J., Simon, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granule-associated+serine+proteases:+granzymes+might+not+just+be+killer+proteases.">Granule-associated serine proteases: granzymes might not just be killer proteases.</a> Trends Immunol. 30 (3), 117-123 (2009).</li><li>Hagn, M., Jahrsdorfer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+do+human+B+cells+secrete+granzyme+B?+Insights+into+a+novel+B-cell+differentiation+pathway.">Why do human B cells secrete granzyme B? Insights into a novel B-cell differentiation pathway.</a> Oncoimmunology. 1 (8), 1368-1375 (2012).</li><li>Susanto, O., Trapani, J. A., Brasacchio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controversies+in+granzyme+biology.">Controversies in granzyme biology.</a> Tissue Antigens. 80 (6), 477-487 (2012).</li><li>Walch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+cells+kill+intracellular+bacteria+through+granulysin-mediated+delivery+of+granzymes.">Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes.</a> Cell. 157 (6), 1309-1323 (2014).</li><li>Odake, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+and+murine+cytotoxic+T+lymphocyte+serine+proteases:+subsite+mapping+with+peptide+thioester+substrates+and+inhibition+of+enzyme+activity+and+cytolysis+by+isocoumarins.">Human and murine cytotoxic T lymphocyte serine proteases: subsite mapping with peptide thioester substrates and inhibition of enzyme activity and cytolysis by isocoumarins.</a> Biochemistry. 30 (8), 2217-2227 (1991).</li><li>Casciola-Rosen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+and+human+granzyme+B+have+distinct+tetrapeptide+specificities+and+abilities+to+recruit+the+bid+pathway.">Mouse and human granzyme B have distinct tetrapeptide specificities and abilities to recruit the bid pathway.</a> J Biol Chem. 282 (7), 4545-4552 (2007).</li><li>Kaiserman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+human+and+mouse+granzymes+are+structurally+and+functionally+divergent.">The major human and mouse granzymes are structurally and functionally divergent.</a> J Cell Biol. 175 (4), 619-630 (2006).</li><li>Powers, J. C., Kam, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+thioester+substrates+for+serine+peptidases+and+metalloendopeptidases.">Peptide thioester substrates for serine peptidases and metalloendopeptidases.</a> Methods Enzymol. 248, 3-18 (1995).</li><li>Hagn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+mouse+B+cells+lack+expression+of+granzyme.">Activated mouse B cells lack expression of granzyme.</a> B. J Immunol. 188 (2), 3886-3892 (2012).</li><li>Konjar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+and+mouse+perforin+are+processed+in+part+through+cleavage+by+the+lysosomal+cysteine+proteinase+cathepsin+L.">Human and mouse perforin are processed in part through cleavage by the lysosomal cysteine proteinase cathepsin L.</a> Immunology. 131 (2), 257-267 (2010).</li><li>Sutton, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+active+granzyme+B+in+cathepsin+C-null+lymphocytes+is+sufficient+for+perforin-dependent+target+cell+apoptosis.">Residual active granzyme B in cathepsin C-null lymphocytes is sufficient for perforin-dependent target cell apoptosis.</a> J Cell Biol. 176 (4), 425-433 (2007).</li><li>Trapani, J. A., Smyth, M. J., Apostolidis, V. A., Dawson, M., Browne, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granule+serine+proteases+are+normal+nuclear+constituents+of+natural+killer+cells.">Granule serine proteases are normal nuclear constituents of natural killer cells.</a> J Biol Chem. 269 (28), 18359-18365 (1994).</li><li>Cullen, S. P., Adrain, C., Luthi, A. U., Duriez, P. J., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+and+murine+granzyme+B+exhibit+divergent+substrate+preferences.">Human and murine granzyme B exhibit divergent substrate preferences.</a> J Cell Biol. 176 (4), 435-444 (2007).</li><li>Thornberry, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+approach+defines+specificities+of+members+of+the+caspase+family+and+granzyme+B.+Functional+relationships+established+for+key+mediators+of+apoptosis.">A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis.</a> J Biol Chem. 272 (29), 17907-17911 (1997).</li><li>Bird, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+regulation+of+apoptosis:+the+cytotoxic+lymphocyte+serpin+proteinase+inhibitor+9+protects+against+granzyme+B-mediated+apoptosis+without+perturbing+the+Fas+cell+death+pathway.">Selective regulation of apoptosis: the cytotoxic lymphocyte serpin proteinase inhibitor 9 protects against granzyme B-mediated apoptosis without perturbing the Fas cell death pathway.</a> Mol Cell Biol. 18 (11), 6387-6398 (1998).</li><li>Bots, M., Medema, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serpins+in+T+cell+immunity.">Serpins in T cell immunity.</a> J Leukoc Biol. 84 (5), 1238-1247 (2008).</li><li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+family+of+10+murine+ovalbumin+serpins+includes+two+homologs+of+proteinase+inhibitor+8+and+two+homologs+of+the+granzyme+B+inhibitor+(proteinase+inhibitor+9).">A new family of 10 murine ovalbumin serpins includes two homologs of proteinase inhibitor 8 and two homologs of the granzyme B inhibitor (proteinase inhibitor 9).</a> J Biol Chem. 272 (24), 15434-15441 (1997).</li><li>Bird, C. H., Hitchen, C., Prescott, M., Harper, I., Bird, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodetection+of+granzyme+B+tissue+distribution+and+cellular+localisation.">Immunodetection of granzyme B tissue distribution and cellular localisation.</a> Methods Mol Biol. 844, 237-250 (2012).</li><li>Jenkins, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+CTL+activity+for+different+CD8++effector+T+cells+supports+the+idea+that+lower+TCR/epitope+avidity+may+be+advantageous+for+target+cell+killing.">Visualizing CTL activity for different CD8+ effector T cells supports the idea that lower TCR/epitope avidity may be advantageous for target cell killing.</a> Cell Death Differ. 16 (4), 537-542 (2009).</li><li>Edwards, K. M., Kam, C. M., Powers, J. C., Trapani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+cytotoxic+T+cell+granule+serine+protease+granzyme+H+has+chymotrypsin-like+(chymase)+activity+and+is+taken+up+into+cytoplasmic+vesicles+reminiscent+of+granzyme+B-containing+endosomes.">The human cytotoxic T cell granule serine protease granzyme H has chymotrypsin-like (chymase) activity and is taken up into cytoplasmic vesicles reminiscent of granzyme B-containing endosomes.</a> J Biol Chem. 274 (43), 30468-30473 (1999).</li><li>Sutton, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+apoptosis+by+granzyme+B+requires+direct+cleavage+of+bid,+but+not+direct+granzyme+B-mediated+caspase+activation.">Initiation of apoptosis by granzyme B requires direct cleavage of bid, but not direct granzyme B-mediated caspase activation.</a> J Exp Med. 192 (10), 1403-1414 (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Historisch die Granzyme wurden als Schlüssel Effektormoleküle zytotoxischer Lymphozyten (CTL und NK-Zellen), die zur Induktion einer schnellen apoptotischen Tod in Zielzellen identifiziert. Dies war vor allem auf die Wirkung von GzmB, das Zielsubstrat Moleküle an Aspartat (D) Reste gespalten und somit konnte die Caspase-Kaskade von beiden spalten pro-Caspasen zu aktivieren, sowie mehrere ihrer nachgelagerten Ziele. Es ist jedoch nun ersichtlich, dass GzmB Expression ist nicht auf lymphoide zytotoxischen Zellen beschr...

Granzyme sind eine Familie von Serin-Proteasen, die in den sekretorischen Lysosomen von natürlichen Killerzellen (NK) und zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) 1 gefunden. Fünf verschiedene Granzyme im Menschen vorhanden (A, B, H, K und M), und zehn Mäuse (A - G, K, M und N) 2,3. Granzyme A und Granzyme B (GZMA, GzmB) sind die häufigsten und wurden umfangreich im menschlichen und Nagetier-Einstellung untersucht. Die klassische Funktion GzmB ist die Induktion von Apoptose in Zielzellen in Verbindung mit der porenbildende Protein von Perforin, Granzym, die die an die Zielzelle Cytosol 4 Zugriff ermöglicht ausgeführt. Obwohl GzmB Expression unzweideutig in zytotoxischen Lymphozyten haben neuere Studien wurden zu einer Vielzahl anderer GzmB exprimierenden Zelltypen, einschließlich, aber nicht beschränkt Keratinozyten 5, 6 Basophilen, Mastzellen 7, plasmacytoid dendritischen Zellen 8, 9 und B-Zellen, 10.In diesem Zusammenhang wurden nicht-apoptotischen GzmB Funktionen ergeben, die von der Teilnahme an entzündlichen Prozessen, Gewebeumbau und anderen immunregulatorischen Eigenschaften 14.11. Da eine breitere biologische Rolle für GzmB als bisher vermutet vorgeschlagen, Forschern erfordern zuverlässige und spezifische Werkzeuge für die Erkennung. Von Vorteil ist, GzmB die ausdrückliche Verpflichtung, in der Carboxylseite von Asparaginsäurereste, eine Eigenschaft, einzigartig unter den eukaryotischen Serinproteasen 15 zu spalten. Maus, Ratte und Mensch sind GzmB strukturell sehr ähnlich, aber die erweiterten Substratspezifität der Maus GzmB unterscheidet dezent von der Ratte und Mensch 16, was bedeutet, dass bestimmte allgemeine Substraten mit Asp an der Klemme (P1) effizient durch GzmB gespalten von allen drei Spezies, während andere Substrate mit komplizierteren Sequenzen stromaufwärts von P1 kann stark unterschiedliche Ergebnisse ergeben. In der Vergangenheit und neuere literature hat diese Tatsache erhebliche Verwirrung und Fehlinterpretation der biologische Bedeutung einiger experimenteller Befunde verursacht, obwohl sorgfältig kontrolliert wurden kinetische Untersuchungen versucht, die Lage 17 zu korrigieren. In dieser Arbeit haben wir versucht, diese Punkte unter Verwendung von zwei im Handel erhältliche Substrate, nämlich Boc-Ala-Ala-Asp-SBzl und N-acetyl-Ile-Glu-Pro-Asp-p-Nitroanilid zu illustrieren. Die beiden Reagenzien zu tun erzeugen unterschiedliche reaktive Gruppen nach der Spaltung (eine freie Sulfhydryl gegenüber einer Leuchtstoff kostenlos Paranitroanilid), aber dies berührt in keiner Weise auf die proteolytische Spaltung. Das beschriebene Protokoll ist eine moderne Adaption eines sehr alten Protokoll 18, sollte aber helfen Forschern, die verschiedenen GzmB Substrate angemessen zu nutzen, sondern schafft auch einen methodischen Rahmen zur Erfassung der Aktivität von anderen Granzyme wie GZMA und GzmH.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1133">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Product</td>
			<td style="width:241px;">Company</td>
			<td style="width:181px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:427px;">Comment/description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl</td>
			<td>SM Biochemicals LLC, CA</td>
			<td>SMSB05</td>
			<td>Granzyme B substrate (mouse and human)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ac-IEPD-pNA&#160;</td>
			<td>SM Biochemicals LLC, CA</td>
			<td>SMPNA009</td>
			<td>Granzyme B substrate (only human)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-a-CBZ-L-lysine-S-Bzl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3647</td>
			<td>Granzyme A substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl</td>
			<td>SM Biochemicals LLC, CA</td>
			<td>SB025</td>
			<td>Granzyme H substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5,5&#8217;-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8130</td>
			<td>&#160;DTNB, Ellman&#8217;s Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NK cell isolation kit II mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td style="width:181px;">130-096-892</td>
			<td style="width:427px;">negative selection kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NK cell isolation kit human</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-092-657</td>
			<td style="width:427px;">negative selection kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate reader</td>
			<td>Biorad iMark</td>
			<td></td>
			<td>Biorad Microplate Manager Software Version MPM6.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Serocluster U-bottom vinyl 96-well plate</td>
			<td>Corning, MA, USA</td>
			<td>2797</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a colorimetric assay that specifically measures granzyme b proteolytic activity: hydrolysis of boc-ala-ala-asp-s-bzl

The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is the most studied granzyme in humans and mice and therefore, researchers need specific and reliable tools to study its function and role in pathophysiology. This especially necessitates assays that do not recognize proteases such as caspases or other granzymes that are structurally or functionally related. Here, we apply GzmB&#8217;s preference for cleavage after aspartic acid residues in a colorimetric assay using the peptide thioester Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. GzmB is the only mammalian serine protease capable of cleaving this substrate. The substrate is cleaved with similar efficiency by human, mouse and rat GzmB, a property not shared by other commercially available peptide substrates, even some that are advertised as being suitable for this purpose. This protocol is demonstrated using unfractionated lysates from activated NK cells or CTL and is also suitable for recombinant proteases generated in a variety of prokaryotic and eukaryotic systems, provided the correct controls are used. This assay is a highly specific method to ascertain the potential pro-apoptotic activity of cytotoxic molecules in mammalian lymphocytes, and of their recombinant counterparts expressed by a variety of methodologies.

Die Boc-AAD-S-Bzl Substrat spezifisch für GzmB Die Serinprotease GzmB ist ein Hauptbestandteil von zytotoxischen Lymphozyten (CTL und NK-Zellen) und vorwiegend zur Induzierung schnelle apoptotischen Tod in Zielzellen, wie virusinfizierte oder transformierten Zellen verantwortlich. Dies ist vor allem aufgrund der Substratpräferenz für die Spaltung nach bestimmten Aspartatreste in ausgewählten Proteinen geteilt ein Attribut mit den Caspasen, die auch nach der Aspartatreste...

Watch this Scientific Journal Video about A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl at JoVE.com

A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

We describe a simple, quantitative colorimetric assay that specifically measures the proteolytic activity of human, mouse or rat Granzyme B (GzmB). This protocol can be easily adapted for determining protease activity of other granule serine proteases by the hydrolysis of other synthetic peptide substrates with an appropriate recognition sequence.

Ein Farbtest, die speziell Maßnahmen Granzyme B Proteolytische Aktivität: Hydrolyse von Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is ...

a-colorimetric-assay-that-specifically-measures-granzyme-b

Research

JoVE Journal

Chemistry

12.9K Aufrufe.  Peter MacCallum Cancer Centre. We describe a simple, quantitative colorimetric assay that specifically measures the proteolytic activity of human, mouse or rat Granzyme B (GzmB). This protocol can be easily adapted for determining protease activity of other granule serine proteases by the hydrolysis of other synthetic peptide substrates with an appropriate recognition sequence.