Diese Arbeit wurde durch einen Innovations- und Technologieentwicklungspreis des Center for the Development of Therapeutics am Broad Institute of MIT und Harvard unterstützt. Die Autoren danken den Mitgliedern des Senior Leadership Teams und des Review-Komitees für ihre Unterstützung dieser Arbeit.

Alle Proteine wurden in E. coli mit guter Ausbeute und Reinheit (>80%) gemäß den Literaturprotokollen überexprimiert18. Die Biotinylierung wurde mit Hilfe einer BirA-katalysierten Reaktion18 durchgeführt. Alle kleinen Moleküle wurden in 1 mM Stammlösungen in 100% DMSO hergestellt. Die hier beschriebenen Verfahren erfordern keine spezielle Laborsicherheitsausrüstung oder Vorsichtsmaßnahmen. Es sollte Standard-Labor-Schutzausrüstung (PSA) verwendet werden (d. h. Laborkittel, Schutzbrille und Handschuhe).
Die in dieser Studie verwendeten Proteine sind unten aufgeführt: VHL: biotinylierter VHL(53-213)/ElonginB (1-104)/ElonginC(17-112)-Komplex mit Avi-Tag am C-Terminus von ElonginB. Brd4BD2: Nicht markiert Brd4BD2(333-460) CRBN: biotinyliertes CRBN(319-442) mit Avi-Tag am N-Terminus PPM1D: nicht markiertes oder doppeltes His8-markiertes PPM1D(1-420) am N-Terminus
Kleine Moleküle, die in dieser Studie verwendet werden, sind unten aufgeführt: MZ1 (MW = 1002,6 Da): PROTAC, das an VHL und Brd4BD2 bindet BRD-2512 (MW = 841,4 Da): CRBN K D ~3 μM, bindet nicht an PPM1D BRD-5110 (MW = 872,0 Da): CRBN K D ~3 μM, PPM1D KD = 1-2 nM BRD-4761 (MW = 476,6 Da): bindet nicht an CRBN, PPM1D KD = 1-2 nM
1. Methode 1: ITC (isotherme Titrationskalorimetrie)
HINWEIS: Die Titrationen werden mit einem Mikrokalorimeter mit automatischer Injektion durchgeführt.
<ol><li>Puffervorbereitung: Bereiten Sie 3 l Puffer mit 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 7,5 vor.</li>
	<li>Dialyse: Dialysieren Sie VHL und Brd4BD2 (~ 500 μl bei jeweils 150 μM) gegen 1 l des in Schritt 1.1 hergestellten Puffers, 3 mal bei 4 °C, für 4 h, 2 h bzw. ca. 16 h. Bewahren Sie den Puffer nach der letzten Dialyse auf, um ihn in den folgenden Schritten zu verwenden.</li>
	<li>Bereiten Sie die Proben auf einer 96-Well-Platte mit Kunststoffabdeckung vor.<ol><li>Für jede Titration werden 400 μl Lösung für die Zelle, 125 μl für die Spritze und 400 μl Puffer für die Reinigung vorbereitet. Geben Sie Proben in drei aufeinanderfolgende Vertiefungen auf der Platte. Da das zusammengesetzte Material bei 1 mM in 100 % DMSO hergestellt wird, fügen Sie den Proteinlösungen den gleichen Prozentsatz DMSO hinzu, um den passenden Puffer in der Zelle und der Spritze zu gewährleisten. Fügen Sie 2% DMSO zu den endgültigen Lösungen hinzu.<ol><li>Probe für die Titration von VHL in MZ1: Bereiten Sie eine Zelllösung vor, die 392 μl Puffer, 4 μl MZ1 bei 1 mM (10 μM Endkonzentration) und 4 μl 100% DMSO enthält. Bereiten Sie eine Spritzenlösung mit 122,5 μl VHL bei 85,7 μM, 2,5 μl 100% DMSO (84 μM Endkonzentration) vor.</li>
			<li>Proben für die Titration von VHL in den Puffer (die Daten werden für die Hintergrundsubtraktion der aus der Probe 1.3.1.1 generierten Daten verwendet): Bereiten Sie eine Zelllösung mit 392 μl Puffer und 8 μl 100 % DMSO vor. Bereiten Sie eine Spritzenlösung mit 122,5 μl VHL bei 85,7 μM (84 μM Endkonzentration) vor und fügen Sie 2,5 μl 100%iges DMSO hinzu.</li>
			<li>Proben für die Titration von VHL in MZ1 und Brd4 BD2: Bereiten Sie eine Zelllösung vor, die 392 μl 17,1 μM Brd4BD2 (16,8 μM Endkonzentration), 3,36 μl MZ1 bei 1 mM (8,4 μM Endkonzentration) und 4,64 μl 100% DMSO enthält. Bereiten Sie eine Spritzenlösung mit 122,5 μl VHL bei 85,7 μM (84 μM Endkonzentration) und 2,5 μl 100% DMSO vor.</li>
			<li>Proben für die Titration von VHL zu Brd4 BD2 (Hintergrund von 1.3.1.3): Bereiten Sie eine Zelllösung vor, die 392 μl 17,1 μM Brd4BD2 (16,8 μM Endkonzentration) und 8 μl 100% DMSO enthält. Bereiten Sie eine Spritzenlösung mit 122,5 μl VHL bei 85,7 μM (84 μM Endkonzentration) und 2,5 μl 100% DMSO vor.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie alle vier Titrationen auf dem Mikrokalorimeter durch. Jede besteht aus 19 Injektionen von 2 μl Spritzenlösung mit einer Rate von 2 μl/s in Zeitintervallen von 120 s. Nehmen Sie eine erste Injektion von Protein (0,4 μl) vor und verwerfen Sie es während der Datenanalyse. Alle Experimente werden bei 25 °C unter Rühren mit 600 U/min durchgeführt.</li>
	<li>Datenanalyse: Passen Sie die Daten an ein Modell mit einer einzigen Bindungsstelle an, um die Stöchiometrie (n), die Dissoziationskonstante (KD) und die Bindungsenthalpie (ΔH) mit der vom Hersteller bereitgestellten Analysesoftware zu erhalten (Abbildung 2).</li>
</ol>2. Methode 2: BLI (Biolayer-Interferometrie)
<ol><li>Durchführung von BLI-Experimenten mit Streptavidin (SA)-beschichteten Sensoren bei Raumtemperatur (RT) mit einer Erfassungsrate von 5 Hz. Stellen Sie während des automatisierten BLI-Experiments sicher, dass die Sensoren innerhalb einer einzelnen Säule stationär sind und sich zwischen verschiedenen Säulen einer schwarzen 96-Well-Platte mit flachem Boden und einem maximalen Well-Volumen von 392 μl bewegen. Füllen Sie jede Vertiefung der im Experiment verwendeten Platte mit 200 μl Lösung. HINWEIS: BLI ist nur nützlich, um Protein-Protein-Wechselwirkungen (d. h. ternäre Komplexbildung) zu erkennen. Es ist nicht empfindlich genug, um Wechselwirkungen zwischen Proteinen und kleinen Molekülen zu erkennen.<ol><li>Puffervorbereitung: Bereiten Sie 100 ml Puffer mit 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 0,05 % P20, pH 7,5 vor.</li>
		<li>Optimierung für den Immobilisierungsschritt: Belastung des Testsensors auf 1-3 nm, wie vom Hersteller empfohlen. Für die hier beschriebenen Verfahren wird eine Belastung von ~1,0 nm verwendet. Um dies zu erreichen, wird der Sensor 80 s lang in eine VHL-haltige Lösung mit 1,5 μg/ml getaucht.</li>
		<li>Führen Sie kinetische BLI-Messungen durch, indem Sie sieben SA-Sensoren in der folgenden Reihenfolge einsetzen:<ol><li>Für die erste Baseline-Phase 60 s lang in den Puffer eintauchen.</li>
			<li>Für die Immobilisierungsphase wird 80 s lang in eine VHL-Lösung mit 1,5 μg/ml getaucht.</li>
			<li>Für die zweite Basisphase 60 s lang in den Puffer eintauchen.</li>
			<li>Für die Assoziationsphase wird eine feste Konzentration von Brd4BD2 bei 2 μM, eine feste Konzentration von DMSO von 2 % und unterschiedliche Konzentrationen von MZ1 bei 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,3 nM, 3,1 nM und 0 nM (Referenzsensor) für 300 s in Lösung getaucht.</li>
			<li>Für die Dissoziationsphase 600 s lang in den Puffer eintauchen.</li>
		</ol></li>
		<li>Führen Sie eine Datenanalyse mit der Software des Herstellers durch. k on, koff und KD werden für die Datenanpassung gemeldet (Abbildung 3).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Methode 3: SPR (Oberflächenplasmonenresonanz)
HINWEIS: Alle SPR-Experimente werden mit Streptavidin (SA) beschichteten Sensorchips bei RT durchgeführt. Obwohl der NTA-Chip für die Detektion zwischen Protein und kleinen Molekülen verwendet wird, ist er mit Vorsicht zu verwenden, wenn er auf den ternären Komplex angewendet wird, da ein viel höherer Hintergrund als der SA-Chip beobachtet wird, möglicherweise aufgrund elektrostatischer Wechselwirkungen zwischen der geladenen Chipoberfläche und dem Protein im Analyten.
<ol><li>SPR für VHL-MZ1-Wechselwirkung<ol><li>Vorbereitung der Puffer.<ol><li>Bereiten Sie einen 1-Liter-Puffer mit 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 0,005 % P20, pH 7,5 vor und leiten Sie ihn durch eine 0,2-μm-Filtereinheit.</li>
			<li>Entfernen Sie 20 ml Puffer für die zukünftige Verwendung (DMSO-freier Puffer) und füllen Sie 20 ml DMSO (2 % DMSO im endgültigen Laufpuffer) nach. Halten Sie DMSO in allen unten beschriebenen Proben bei 2 % (Schritte 3.1 und 3.2)</li>
		</ol></li>
		<li>Aktivieren Sie den SA-Chip gemäß dem Protokoll des Herstellers und immobilisieren Sie VHL auf ~2000 RU (injizieren Sie eine Proteinlösung von 5 μg/ml bei 5 μl/min).</li>
		<li>Bereiten Sie MZ1 in einer 3-fachen, seriellen 8-Punkt-Verdünnung mit der oberen Konzentration bei 10 μM auf einer transluzenten 384-Well-Bodenplatte aus transluzentem Polypropylen mit einem maximalen Volumen von 130 μl vor. Decken Sie die Platte mit selbstklebenden, transparenten Kunststofffolien ab, die mit Polypropylen-Mikrotiterplatten kompatibel sind.<ol><li>Bereiten Sie die oberste Konzentration mit dem DMSO-freien Puffer vor, um sicherzustellen, dass die 2%ige DMSO die Endkonzentration erreicht. Zu 147 μl DMSO-freiem Puffer 1,5 μl MZ1-Stamm mit 1 mM und 1,5 μl 100%igem DMSO hinzufügen.</li>
			<li>Bereiten Sie die 3-fache serielle Verdünnung mit dem laufenden Puffer vor, der 2 % DMSO enthält. Zu 100 μl des laufenden Puffers werden 50 μl Lösung in der in Schritt 3.1.3.1 hergestellten Spitzenkonzentration zugegeben und gut vermischt, um diezweithöchste Konzentration herzustellen.</li>
			<li>Dann werden 50 μl der in Schritt 3.1.3.2 hergestellten Lösung in die nächsten 100 μl des laufenden Puffers überführt, gut gemischt, um diedritthöchste Konzentration herzustellen, und so weiter.</li>
		</ol></li>
		<li>Führen Sie SPR mit dem Multi-Cycle-Setup aus: Modus: High-Performance; Kontaktzeit: 120 s; Dissoziationszeit: 300 s; Durchflussrate: 50 μL/min.</li>
		<li>Führen Sie die Datenanalyse mit der vom Gerätehersteller bereitgestellten Auswertungssoftware durch. Die stationäre Analyse ergab, dass KD = 26 (± 3) nM und Rmax von ~91% (± 5%) Bindung erreicht wurden (Abbildung 4A)</li>
	</ol></li>
	<li>SPR für VHL: MZ1: Brd4BD2 ternärer Komplex<ol><li>Bereiten Sie den Puffer wie in Schritt 3.1.1 beschrieben vor.</li>
		<li>Aktivieren Sie den SA-Chip gemäß dem Protokoll des Herstellers und immobilisieren Sie VHL auf ~100 RU. Injizieren Sie eine Proteinlösung von 0,5 μg/ml VHL mit einer Flussrate von 5 μl/min und einer Kontaktzeit zwischen 1-5 Minuten, bis eine Oberflächendichte von ~100 RU erreicht ist.</li>
		<li>Bereiten Sie die Proben für zwei 5-fache, 5-Punkt-Einzelzyklusinjektionen in einer 96-Well-, durchsichtigen, runden Bodenplatte aus Polystyrol mit einem maximalen Volumen von 323 μl vor und decken Sie sie mit selbstklebenden, transparenten Kunststofffolien ab, die mit Polystyrol-Mikrotiterplatten kompatibel sind, wie in den Schritten 3.2.3.1-3.2.3.2 beschrieben.<ol><li>Negativkontrolle: Der Analyt enthält nur Brd4BD2 .<ol><li>Höchste Konzentration bei 25 μM in laufendem Puffer mit einem Volumen von 200 μl (#A5) vorbereiten</li>
				<li>Geben Sie je 160 μl Brd4BD2 bei 2 μM in den laufenden Puffer in die nächsten 4 Vertiefungen auf der linken Seite (#A1-A4)</li>
				<li>40 μl A5 auf A4 übertragen. Gut mischen.</li>
				<li>40 μl A4 auf A3 übertragen. Gut mischen. Wiederholen Sie dies bis A1.</li>
			</ol></li>
			<li>Ternäre Komplexbildung: Der Analyt enthält MZ1 und Brd4BD2.<ol><li>Die höchste Konzentration wird durch Zugabe von 4 μl MZ1 bei 20 μM in 100%iger DMSO-Lösung zu 196 μl mit 25,5 μM Brd4BD2 in DMSO-freiem Puffer (#B5) hergestellt. Die Endkonzentrationen betragen 25 μM Brd4BD2, 100 nM MZ1 und 2 % DMSO.</li>
				<li>Geben Sie je 160 μl Brd4BD2 bei 2 μM in den laufenden Puffer in die nächsten 4 Vertiefungen auf der linken Seite (#B1-B4)</li>
				<li>40 μl B5 auf B4 übertragen. Gut mischen.</li>
				<li>40 μl B4 auf B3 übertragen. Gut mischen. Wiederholen Sie dies bis B1.</li>
			</ol></li>
		</ol></li>
		<li>Führen Sie SPR mit dem Single-Cycle-Setup durch: Kontaktzeit: 100 s; Dissoziationszeit: 720 s; Durchflussrate: 50 μL/min. Tragen Sie vor jeder Probe drei Injektionen Puffer auf, um einen stabilen Hintergrund zu gewährleisten.</li>
		<li>Datenanalyse: Wenden Sie die dritte Injektion des Puffers als Hintergrund für die Subtraktion an. Als Negativkontrolle ist die SPR-Antwort zwischen VHL und Brd4BD2 vernachlässigbar, wenn MZ1 nicht vorhanden ist. Wenn MZ1 vorhanden ist, zeigt die kinetische Anpassung an, dass die Wechselwirkung zwischen VHL und MZ1-Brd4BD2-Komplex k on = 7,9 (± 1,5) *107 /M/s, koff = 0,014 s-1 und KD = 1 nM hat. (Abbildung 4B)</li>
	</ol></li>
	<li>SPR für CRBN- und niedermolekulare Wechselwirkungen<ol><li>Vorbereitung der Puffer.<ol><li>Bereiten Sie einen 1-Liter-Puffer mit 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl 2, 0,5 mM TCEP, 0,005 % P20, pH 7,5 vor und leiten Sie ihn durch eine 0,2-μm-Filtereinheit.</li>
			<li>Entfernen Sie 20 ml Puffer und füllen Sie 20 ml 100 % DMSO (2 % DMSO im letzten Laufpuffer) nach. Es ist wichtig, DMSO in allen unten beschriebenen Proben bei 2 % zu halten (Schritte 3.3, 3.4 und 3.5).</li>
		</ol></li>
		<li>Aktivieren Sie den SA-Chip gemäß dem Protokoll des Herstellers und immobilisieren Sie CRBN auf ~800 RU.</li>
		<li>Verbindungen werden in 3-facher serieller Verdünnung von 6 pt auf einer 384-Well-Platte mit einer Höchstkonzentration von 30 μM hergestellt, wie in Abschnitt 3.1.3 beschrieben.</li>
		<li>SPR mit dem Multi-Cycle-Setup ausführen: Modus: Hochleistungs, Kontaktzeit: 60 s, Dissoziationszeit: 90 s; Durchflussrate: 50 μL/min. Für dieses System reichen drei Pufferinjektionen aus, um einen stabilen Hintergrund zu erhalten. Bei anderen Assay-Systemen kann es erforderlich sein, zusätzliche Pufferinjektionen durchzuführen.</li>
		<li>Führen Sie eine Datenanalyse mit der Software des Herstellers durch. ANMERKUNG: Die stationäre Analyse zeigt, dass KD von BRD-2512 und BRD-5110 beide bei etwa 3 μM liegt. Die Bindung erreichte jedoch nur ~ 70% Rmax Bindung bei der höchsten Konzentration. Sowohl die schwache Affinität als auch die Form des Sensorgramms deuten darauf hin, dass es bei hohen Konzentrationen wahrscheinlich zu einer Unlöslichkeit der Verbindung kommt. Somit könnte das tatsächliche KD höher als 3 μM sein. BRD-4761, das nicht an CRBN bindet, wurde als Negativkontrolle eingeschlossen.</li>
	</ol></li>
	<li>SPR für PPM1D- und niedermolekulare Wechselwirkungen<ol><li>Bereiten Sie den Puffer wie in Schritt 3.3.1 beschrieben vor. Verwenden Sie einen Sensorchip für Nitriloessigsäure (NTA).</li>
		<li>Wenden Sie den Einzelzyklus an, da der PPM1D-Gefechtskopf ein langsames kan und k aus hat. Regenerieren Sie den NTA-Chip mit dem Standard-Setup des Herstellers und immobilisieren Sie PPM1D nach jeder Verbindungsinjektion auf ~ 1000 RU (Proteinlösung von 5 μg/ml bei 5 μl/min injizieren).</li>
		<li>Verbindungen werden in 3-facher 5-Punkt-Serienverdünnung mit der höchsten Konzentration bei 400 nM hergestellt, wie in Abschnitt 3.1.3 beschrieben.</li>
		<li>Führen Sie SPR mit dem Single-Cycle-Setup aus: Modus: Hochleistungsmodus; Einwirkzeit: 90 s; Dissoziationszeit: 600 s; Durchflussrate: 50 μL/min. Tragen Sie vor jeder Verbindung drei Injektionen Puffer auf, um einen stabilen Hintergrund zu gewährleisten.</li>
		<li>Datenanalyse. Wenden Sie die dritte Injektion des Puffers als Hintergrund für die Subtraktion an. Als Negativkontrolle zeigt BRD-2512 keine Bindung an PPM1D. Für BRD-4761 und BRD-5110 zeigte die kinetische Anpassung an, dass die KD für beide 1-2 nM beträgt.</li>
	</ol></li>
	<li>SPR für CRBN:PROTAC: Ternärer PPM1D-Komplex<ol><li>Bereiten Sie den Puffer wie in Schritt 3.3.1 beschrieben vor.</li>
		<li>Aktivieren Sie den SA-Chip gemäß dem Protokoll des Herstellers und immobilisieren Sie CRBN auf ~35 RU (injizieren Sie eine Proteinlösung von 0,5 μg/ml bei 5 μl/min).</li>
		<li>Drei Verbindungen werden in 3-facher 6-Punkt-Serienverdünnung mit einer Höchstkonzentration von 30 μM hergestellt, während [PPM1D] in allen Proben, einschließlich Leerproben, unter Verwendung der in Schritt 3.2.3 beschriebenen Methode bei 1 μM gehalten wird.</li>
		<li>Führen Sie SPR mit dem Multi-Cycle-Setup aus: Modus: High-Performance; Kontaktzeit: 60 s; Dissoziationszeit: 90 s; Durchflussrate: 50 μL/min.</li>
		<li>Führen Sie eine Datenanalyse mit der Software des Herstellers durch. HINWEIS: Während BRD-2512 und BRD-4761 keine/vernachlässigbare Reaktion zeigen, zeigt BRD-5110 deutlich den "Hook-Effekt" im stationären Zustand mit schneller Ein-/Aus-Kinetik (Abbildung 5A-C). Die experimentelle Bindungsantwort von BRD-5110 (Abbildung 5C) liegt zwischen der vorhergesagten Antwort aus der Simulation, wenn angenommen wird, dass K D (CRBN, cpd) 3 oder 10 μM beträgt (Abbildung 5E), was darauf hindeutet, dass das ternäre KD und das binäre K D sehr ähnlich sind. Es gibt keine offensichtliche Kooperativität von PPM1D: BRD-5110: CRBN-Komplexbildung.</li>
	</ol></li>
</ol>

Charakterisierung der ternären Komplexbildung in PROTACs mit biophysikalischen Assays

<ol>
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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+binding+confers+selectivity+in+ligand-induced+protein+degradation.">Plasticity in binding confers selectivity in ligand-induced protein degradation.</a> Nature Chemical Biology. 14 (7), 706-714 (2018).</li></ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte.

Die biophysikalische Charakterisierung der binären und ternären Wechselwirkungen zwischen PROTAC-Molekülen und ihren Proteinbindungspartnern kann einzigartige und komplementäre Einblicke in weit verbreitete zelluläre Systeme liefern. Das Verständnis der Affinität zwischen den einzelnen Sprengköpfen eines PROTAC-Moleküls und seinen Proteinbindungspartnern kann dazu beitragen, die Bemühungen der medizinischen Chemie zur Optimierung dieser Wechselwirkungen zu lenken. Zuvor veröffentlichte Kristallstrukturen tern?...

Die Polyubiquitinierung von Proteinen in der Zelle ist ein streng regulierter Prozess, an dem Enzyme der Ubiquitin-Ligase-Familie beteiligt sind 1,2. Die terminalen Enzyme im Signalweg sind die E3-Ubiquitin-Ligasen, die Ubiquitin-Moleküle kovalent an ihre Proteinbindungspartner binden3. Die Polyubiquitinierung dieser Proteinbindungspartner zielt auf den proteolytischen Abbau durch das Proteasom4 ab. Dieses System ist Teil des Proteinhomöostase-Prozesses, der therapeutisch genutzt wurde, um den Abbau von Proteinen zu induzieren, die an der Krankheit beteiligt sind5. Kleine Moleküle, die die Wechselwirkung zwischen E3-Ubiquitin-Ligasen induzieren, wie z. B. die Von-Hippel-Lindau-E3-Ligase (VHL) oder Cereblon (CRBN), bestehen typischerweise aus einem E3-Ligase-bindenden Gefechtskopf, der durch einen flexiblen Linker mit einem Gefechtskopf verbunden ist, der an das Protein bindet, das für den Abbau anvisiert wird. Diese heterobifunktionellen Moleküle werden allgemein als Proteolyse bezeichnet, die auf Chimären abzielt, oder PROTACS6.
Bei der Entwicklung von PROTACS wird die Fähigkeit von Molekülen untersucht, den Abbau von Proteinen in Zellen zu induzieren. Es wurden viele zelluläre Assay-Systeme entwickelt, die die induzierte Interaktion zwischen dem Zielprotein und E3-Ligase-Komponenten, wie VHL oder CRBN, bei der Behandlung der Zellen mit einem PROTAC-Molekül überwachen. Ein solcher zellulärer Assay, das nanoluc-Halotag-System7, beinhaltet eine E3-Ligase, die mit dem Halotag-Akzeptor fusioniert ist, und ein Zielprotein, das mit einem nanoluc-Donor markiert ist. Die ternäre Komplexbildung bringt den Nanoluc-Donor und den Halotag-Akzeptor in die Nähe und ermöglicht die Energieübertragung vom Donor zum Akzeptor, was zur Emission von Licht führt. Variationen dieses Systems können verwendet werden, um die zelluläre Permeabilität von PROTACS-Molekülen8 oder Änderungen des relativen Niveaus der Ubiquitinierung des Zielproteins9 zu bewerten. Während diese zellulären Systeme für die Optimierung von PROTACs unerlässlich sind, ist die Bildung von Komplexen zwischen E3-Ligasen und Proteinen, die für den Abbau bestimmt sind, ein mehrstufiger Prozess10,11. Die Kinetik und Thermodynamik der beteiligten binären und ternären Wechselwirkungen tragen zur effizienten Ubiquitinierung und dem daraus resultierenden Abbau des Proteins12,13,14 bei.
Darin werden Protokolle beschrieben, die für die biophysikalische Charakterisierung der durch PROTACS induzierten ternären Komplexbildung unter Verwendung von Oberflächenplasmonenresonanz (SPR), Bioschichtinterferometrie (BLI) und isothermer Titrationskalorimetrie (ITC) angepasst werden können. SPR- und ITC-Protokolle für das MZ1 PROTAC-Molekül, das die Bildung ternärer Komplexe zwischen Brd4,BD2 und VHL induziert, die aus den Literaturberichten13,15 abgeleitet und hier beschrieben wurden, waren in der Lage, die berichteten Ergebnisse mit einigen Modifikationen der berichteten Verfahren zu rekapitulieren, die diskutiert werden. Dieser Bericht enthält eine Beschreibung eines BLI-Assays, der zur Bewertung der ternären Komplexbildung zwischen MZI, Brd4BD2 und VHL verwendet wird. Die Affinitätsmessungen von BLI stimmten mit denen überein, die in SPR und ITC beobachtet wurden. Ein zuvor veröffentlichtes Protokoll, in dem ein SPR-Assay zur Bewertung der PROTAC-induzierten ternären Komplexbildung zwischen PPM1D, einer Ser/Thr-Proteinphosphatase, deren Expression p53-abhängig induziert wird,16, und CRBN entwickelt wurde, wird ebenfalls beschrieben. In diesem Fall hat das PROTAC-Molekül eine nanomolare Affinität zu PPM1D, aber nur eine mikromolare Affinität zu CRBN. In diesem Fall ist die Bindung des PROTAC-Moleküls an CRBN nicht sättigbar, was zu dem häufig beobachteten "Hook-Effekt" führt. Der Hook-Effekt ist eine Eigenschaft von drei Körpersystemen, in denen es zwei Spezies gibt, die einen heterotrimeren Komplex bilden können, wenn beide an ein Brückenmolekül gebunden sind (Abbildung 1)17. Der Hakeneffekt wird beobachtet, wenn die brückenbildende Spezies im Vergleich zu den beiden anderen Spezies eine Überkonzentration aufweist. Der resultierende Zustand ist einer, in dem die binären Wechselwirkungen die ternären Wechselwirkungen übertreffen. Die Systeme, bei denen der Hakeneffekt beobachtet wird, erfordern spezifische Überlegungen zur Versuchsplanung, die in diesem Bericht erörtert werden. Es werden allgemeine Konzepte und Reagenzienanforderungen für die Evaluierung des Einsatzes biophysikalischer Assays zur Bewertung der Bildung von PROTAC-induzierten ternären Komplexen bereitgestellt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655076</td>
			<td>flat-bottom, black plates used In BLI experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>73520-120</td>
			<td>Plate use for ITC sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>650101</td>
			<td>Plate used to prepare samples for SPR experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto iTC200 micro-calorimeter</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biacore S200</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29136649</td>
			<td>Instrument used to perform SPR experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MZ1</td>
			<td>ProbeChem</td>
			<td>PC-60099</td>
			<td>PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA sensor chip</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>BR100532</td>
			<td>SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet Red-384</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate cover</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>PQA0001</td>
			<td>Cover for Nunc 96-well plate (73520-120)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate cover</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28975816</td>
			<td>Plate cover for Greiner plate (650101)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series S SA sensor chip</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>BR100531</td>
			<td>SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>18-509</td>
			<td>Coated sensors used in BLI experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the development and application of biophysical assays for evaluating ternary complex formation induced by proteolysis targeting chimeras (protacs)

E3-Ligasen und Proteine, die auf den Abbau abzielen, können durch heterobifunktionelle Moleküle in einem mehrstufigen Prozess dazu gebracht werden, Komplexe zu bilden. Die Kinetik und Thermodynamik der beteiligten Wechselwirkungen tragen zur Effizienz der Ubiquitinierung und des daraus resultierenden Abbaus des Proteins bei. Biophysikalische Techniken wie die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR), die Bioschichtinterferometrie (BLI) und die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) liefern wertvolle Informationen, die bei der Optimierung dieser Wechselwirkungen verwendet werden können. Unter Verwendung von zwei Modellsystemen wurde ein biophysikalischer Assay-Toolkit zum Verständnis der Kooperativität der ternären Komplexbildung und des Einflusses des "Hook-Effekts" auf die Bindungskinetik entwickelt. In einem Fall wurde ein Proteolyse-Targeting-Chimären-Molekül (PROTAC) untersucht, das die ternäre Komplexbildung zwischen Brd4BD2 und VHL induziert. Das heterobifunktionelle Molekül MZ1 hat nM-Affinitäten sowohl für das Brd4-BD2-Protein (SPR K D = 1 nM, ITC K D = 4 nM) als auch für den VHL-Komplex (SPR K D = 29 nM, ITC K D = 66 nM). Für dieses System wurden robuste SPR-, BLI- und ITC-Assays entwickelt, die veröffentlichte Ergebnisse reproduzierten, die die Kooperativität der ternären Komplexbildung demonstrieren. Im anderen Fall wurde ein Molekül untersucht, das ternäre Komplexe zwischen einem 46,0 kDa-Protein, PPM1D, und Cereblon [CRBN (319-442)] induziert. Das heterobifunktionelle Molekül BRD-5110 hat eine SPR K D = 1 nM für PPM1D, aber eine viel schwächere Bindung gegen den verkürzten CRBN (319-442)-Komplex (SPR KD = ~ 3 μM). In diesem Fall war die Bindung für CRBN in SPR nicht sättigbar, was zu einem "Hook-Effekt" führte. Der Durchsatz- und Reagenzienbedarf für SPR, BLI und ITC wurde evaluiert und allgemeine Empfehlungen für deren Anwendung auf PROTAC-Projekte gegeben.

The polyubiquitination of proteins in the cell is a tightly regulated process that involves enzymes in the Ubiquitin Ligase family1,2. The terminal enzymes in the pathway are the E3 ubiquitin ligases that covalently attach ubiquitin molecules to their protein-binding partners3. The polyubiquitination of those protein binding partners targets them for proteolytic degradation by the proteasome4. This system is part of the protein homeostasis process that has been therapeutically leveraged to induce the degradation of proteins involved in disease5. Small molecules that induce the interaction between E3 ubiquitin ligases, such as Von Hippel-Lindau E3 ligase (VHL) or cereblon (CRBN), are typically composed of an E3 ligase binding warhead connected by a flexible linker to a warhead that binds to the protein being targeted for degradation. These heterobifunctional molecules are commonly referred to as proteolysis targeting chimeras or PROTACS6.
The development of PROTACS involves evaluating the ability of molecules to induce the degradation of proteins in cells. Many cellular assay systems have been developed that monitor the induced interaction between the target protein and E3 ligase components, such as VHL or CRBN, upon treatment of the cells with a PROTAC molecule. One such cellular assay, the nanoluc-Halotag system7, involves an E3 ligase fused to the Halotag acceptor and a target protein tagged with a nanoluc donor. Ternary complex formation brings the nanoluc donor and Halotag acceptor into proximity allowing the transfer of energy from the donor to the acceptor resulting in the emission of light. Variations of this system can be used to assess the cellular permeability of PROTACS molecules8 or changes in the relative level of target protein ubiquitination9. While these cellular systems are essential for driving the optimization of PROTACS, the formation of complexes between E3 ligases and proteins targeted for degradation is a multi-step process10,11. The kinetics and thermodynamics of the binary and ternary interactions involved contribute to efficiency ubiquitination and resulting degradation of the protein12,13,14.
Herein are described protocols that can be adapted for the biophysical characterization of ternary complex formation induced by PROTACS using surface plasmon resonance (SPR), biolayer interferometry (BLI), and isothermal titration calorimetry (ITC). SPR and ITC protocols for the MZ1 PROTAC molecule that induces ternary complex formation between Brd4BD2 and VHL derived from literature reports13,15 and described here were able to recapitulate the reported results with some modification of the reported procedures, which will be discussed. A description of a BLI assay used to evaluate ternary complex formation between MZI, Brd4BD2, and VHL is included in this report. Affinity measurements from BLI were consistent with those observed in SPR and ITC. A previously published protocol in which an SPR assay was developed for assessing the PROTAC-induced ternary complex formation between PPM1D, a Ser/Thr protein phosphatase whose expression is induced in a p53-dependent manner16, and CRBN is also described. In this instance, the PROTAC molecule has a nanomolar affinity for PPM1D but only a micromolar affinity for CRBN. In this case, the binding of the PROTAC molecule to CRBN is not saturable, resulting in the commonly observed &#34;hook effect&#34;. The hook effect is a property of three body systems in which there are two species that can form a heterotrimeric complex when both are bound to a bridging molecule (Figure 1)17. The hook effect is observed when the bridging species is in excess concentration relative to the two other species. The resulting state is one in which the binary interactions outcompete the ternary interactions. The systems where the hook effect is observed require specific experimental design considerations discussed in this report. General concepts and reagent requirements for evaluating the utilization of biophysical assays for the evaluation of PROTAC-induced ternary complex formation are provided.

Autor im Rampenlicht: Evaluierung biophysikalischer Assays zur Charakterisierung ternärer PROTACS-Komplexe 

Entwicklung und Anwendung biophysikalischer Assays zur Evaluierung der Bildung ternärer Komplexe, die durch Proteolyse-Targeting-Chimären (PROTACS) induziert werden

Our research focuses on replicating established model systems, validating them through additional assays and adapting these methodologies to suit our specific research context. We aim to demonstrate a versatile approach that can be applied to various projects. The current experimental challenge, licensing strategically selecting the appropriate assay format and conditions based on project specific requirements and existing knowledge gaps.This is essential for achieving efficient and accurate answers in our experiments. Our protocol provides a streamlined approach for seamless adaption to various ProTech systems. Furthermore, we conduct a thorough evaluation of each method, highlighting their respective pros and cons.We offer informed instructions on choosing the most suitable format based on specific conditions.

Die Charakterisierung des binären VHL:MZ1-Komplexes und des ternären VHL:MZ1:Brd4-BD2-Komplexes ist in Abbildung 2 (ITC), Abbildung 3 (BLI) und Abbildung 4 (SPR) unter Verwendung eines sehr ähnlichen Puffers zu finden. Die aus orthogonalen Assays extrahiertenK-D-Werte sind konsistent. Die Kooperativität kann durch K D (binär) / KD (ternär) berechnet werden, was sehr positiv ist (15 v...

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In dieser Arbeit beschreiben wir Protokolle zur biophysikalischen Charakterisierung der ternären Komplexbildung, die durch Proteolyse-Targeting-Chimären (PROTACS) induziert wird, an denen die Ubiquitin-Ligasen Von-Hippel-Lindau E3-Ligase (VHL) und Cereblon (CRBN) beteiligt sind. Zu den hier dargestellten biophysikalischen Methoden gehören die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR), die Bioschichtinterferometrie (BLI) und die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC).

E3 ligases and proteins targeted for degradation can be induced to form complexes by heterobifunctional molecules in a multi-step process. The kinetics ...

Unsere Forschung konzentriert sich darauf, etablierte Modellsysteme zu replizieren, sie durch zusätzliche Assays zu validieren und diese Methoden an unseren spezifischen Forschungskontext anzupassen. Unser Ziel ist es, einen vielseitigen Ansatz zu demonstrieren, der auf verschiedene Projekte angewendet werden kann. Die aktuelle experimentelle Herausforderung ist die strategische Auswahl des geeigneten Assay-Formats und der geeigneten Bedingungen auf der Grundlage projektspezifischer Anforderungen und bestehender Wissenslücken.Dies ist unerlässlich, um in unseren Experimenten effiziente und genaue Antworten zu erhalten. Unser Protokoll bietet einen optimierten Ansatz für die nahtlose Anpassung an verschiedene ProTech-Systeme. Darüber hinaus führen wir eine gründliche Bewertung jeder Methode durch und heben ihre jeweiligen Vor- und Nachteile hervor.Wir bieten fundierte Anweisungen zur Auswahl des am besten geeigneten Formats auf der Grundlage spezifischer Bedingungen.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

The Development and Application of Biophysical Assays for Evaluating Ternary Complex Formation Induced by Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACS)

2.3K Aufrufe.  The Broad Institute of MIT and Harvard. Unsere Forschung konzentriert sich darauf, etablierte Modellsysteme zu replizieren, sie durch zusätzliche Assays zu validieren und diese Methoden an unseren spezifischen Forschungskontext anzupassen. Unser Ziel ist es, einen vielseitigen Ansatz zu demonstrieren, der auf verschiedene Projekte angewendet werden kann. Die aktuelle experimentelle Herausforderung ist die strategische Auswahl des geeigneten Assay-Formats und der geeigneten Bedingungen auf der Grundlage projektspezifischer Anforder...

Serie: Autor im Rampenlicht: Evaluierung biophysikalischer Assays zur Charakterisierung ternärer PROTACS-Komplexe 

E3 ligases and proteins targeted for degradation can be induced to form complexes by heterobifunctional molecules in a multi-step process. The kinetics and thermodynamics of the interactions involved contribute to efficiency of ubiquitination and resulting degradation of the protein. Biophysical techniques such as surface plasmon resonance (SPR), biolayer interferometry (BLI), and isothermal titration calorimetry (ITC) provide valuable information that can be used in the optimization of those interactions. Using two model systems, a biophysical assay tool kit for understanding the cooperativity of ternary complex formation and the impact of the &#39;hook effect&#39; on binding kinetics was established. In one case, a proteolysis targeting chimera (PROTAC) molecule that induced ternary complex formation between Brd4BD2 and VHL was evaluated. The heterobifunctional molecule, MZ1, has nM affinities for both the Brd4BD2 protein (SPR KD = 1 nM, ITC KD = 4 nM) and the VHL complex (SPR KD = 29 nM, ITC KD = 66 nM). For this system, robust SPR, BLI, and ITC assays were developed that reproduced published results demonstrating the cooperativity of ternary complex formation. In the other case, a molecule that induced ternary complexes between a 46.0 kDa protein, PPM1D, and cereblon [CRBN (319-442)] was studied. The heterobifunctional molecule, BRD-5110, has an SPR KD = 1 nM for PPM1D but much weaker binding against the truncated CRBN (319-442) complex (SPR KD= ~ 3 &#181;M). In that case, the binding for CRBN in SPR was not saturable, resulting in a &#34;hook-effect&#34;. Throughput and reagent requirements for SPR, BLI, and ITC were evaluated, and general recommendations for their application to PROTAC projects were provided.

Here we describe protocols for the biophysical characterization of ternary complex formation induced by proteolysis targeting chimeras (PROTACS) that involve the ubiquitin ligases Von Hippel-Lindau E3 ligase (VHL) and Cereblon (CRBN). Biophysical methods illustrated herein include surface plasmon resonance (SPR), biolayer interferometry (BLI), and isothermal titration calorimetry (ITC).