Aktuelle zymographische Techniken erkennen eine begrenzte Anzahl von Proteasen. Die fluoreszierende Peptidzymographie verwendet fluoreszierende Peptide als abbaubares Substrat, das die Messung einer größeren Anzahl von Proteasen ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser Methode ist ihr modulares Design.
Die Sequenz des fluoreszierenden Peptids bestimmt, welche Proteasen detektiert werden und das fluoreszierende Peptid kann leicht mit einem Peptid einer anderen Sequenz getauscht werden, eine Fähigkeit, andere Proteasen zu erkennen. Diese Technik kann dazu beitragen, die Entwicklung der Verwendung von Peptiden als abbaubare Verknüpfungsmittel in technischen Biomaterialien, wie sie für die Arzneimittelabgabe oder Gewebetechnik verwendet werden, zu unterstützen. Die Einbeziehung dieses Peptids in diese Technik kann gewebesekrete Proteasen identifizieren, die für den Abbau des Biomaterials verantwortlich sind.
Die Demonstration dieser Technik ist wichtig, um den mehrschichtigen Ansatz zu visualisieren, der im Vergleich zu anderen Zymographietechniken einzigartig ist. Diese Technik zu demonstrieren, wird Ameya Deshmukh, eine Studentin aus meinem Labor sein. Bereiten Sie zunächst eine 10%Polyacrylamid-Auflösungsgellösung vor, wie in Tabelle 1 des Textprotokolls beschrieben.
Unmittelbar vor dem Gießen des Gels fügen Sie die TEMED und APS. Dann füllen und leeren 1,5 Millimeter Mini-Gel-Kassette auf halbem Weg mit der auflösenden Gel-Lösung. Fügen Sie eine dünne Schicht Isopropanol an der Oberseite des Polyacrylamid-Gels hinzu, um ein ebenein Gel zu erzeugen und Blasen zu verhindern.
Verwenden Sie die übrig gebliebene Polyacrylamidlösung, um den Fortschritt der Polymerisationsreaktion zu verfolgen. Wenn das Polyacrylamid im Rohr vollständig verfestigt ist, ist die Reaktion vollständig. Während die erste auflösende Gelschicht polymerisiert ist, rufen Sie das Azido-PEG3-Maleimid-Kit bei 20 Grad Celsius aus der Lagerung ab und lassen Sie die Komponenten Raumtemperatur erreichen.
Lösen Sie dann die Komponenten von Durchstechflasche zwei im vom Hersteller empfohlenen DMSO-Volumen auf. Und Wirbel für 30 Sekunden, um sicherzustellen, dass die Flüssigkeiten gut gemischt sind. Übertragen Sie den Inhalt der Durchstechflasche eins in einen sauberen, trockenen 100 Millileter runden Bodenkolben, der eine Rührstange enthält.
Legen Sie sofort einen Gummiseptumstopfen mit einem Zwerchfell ein, das mit einer Spritze in den Mund des Kolbens einstechen kann. Als nächstes legen Sie zwei 18-Spur-Spritzennadeln in das Zwerchfell ein. Schließen Sie eine der Spritzennadeln an einen inerten Gastank an und lassen Sie das Gas den runden Bodenkolben für drei Minuten füllen.
Schalten Sie dann das Inertgas ab und lösen Sie es von der Nadel. Mit einer Spritze den vollen Inhalt der Durchstechflasche zwei in den Kolben injizieren. Entfernen Sie sowohl die Nadeln als auch die Spritze.
Lassen Sie die Komponenten 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Rühren mischen. Danach den Gummiseptumstopfen entfernen und den Inhalt in ein sauberes Fünf-Milliliter-Zentrifugenrohr geben. Sobald die erste auflösende Gelschicht polymerisiert ist, gießen Sie die Isopropanolschicht ab.
Pipet einen Milliliter entionisiertes Wasser auf das Gel und gieße dann das Wasser ab, um das Gel abzuspülen. Holen Sie das Thiol funktionalisierte fluoreszierende Peptid aus der Lagerung bei 80 Grad Celsius. Lassen Sie es bei Raumtemperatur auftauen.
Bereiten Sie eine 10%lösende Gellösung vor, die das Azido-PEG3-Maleimid-Linkermolekül und das fluoreszierende Peptid enthält, wie in Tabelle 1 des Textprotokolls beschrieben. Unmittelbar vor dem Gießen des Gels fügen Sie die TMED und APS. Als nächstes füllen Sie die Hälfte des restlichen Teils der Gelkassette mit der Peptid-Auflösungslösung.
Fügen Sie eine dünne Schicht Isopropanol an der Oberseite des Polyacrylamid-Gels hinzu, um ein ebenein Gel zu erzeugen und Blasen zu verhindern. Verwenden Sie die übrig gebliebene Polyacrylamidlösung, um den Fortschritt der Polymerisationsreaktion zu verfolgen. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, gießen Sie die Isopropanolschicht ab.
Pipet einen Milliliter entionisiertes Wasser auf das Gel und gieße dann das Wasser ab, um das Gel abzuspülen. Wenn Sie die Gele nicht sofort verwenden, lagern Sie sie, indem Sie sie in eine Plastikbox eintauchen, die mit 100 Millilitern 1x PBS bei vier Grad Celsius gefüllt ist. Wickeln Sie die Box in Aluminiumfolie, um Photobleichungen zu verhindern.
Bereiten Sie zunächst eine 5%stacking Gel-Lösung vor, wie in Tabelle 1 des Textprotokolls beschrieben. Unmittelbar vor dem Gießen des Gels fügen Sie die TMED und APS. Füllen Sie den restlichen leeren Teil der Gelkassette mit der Stapelgellösung.
Legen Sie schnell einen 1,5-Millimeter-Gelkamm in die Stapelgelschicht ein, um sicherzustellen, dass keine Blasen unter den Brunnen gefangen bleiben. Verwenden Sie die übrig gebliebene Polyacrylamidlösung, um den Fortschritt der Polymerisationsreaktion zu verfolgen. Wenn die Reaktion abgeschlossen ist, entfernen Sie vorsichtig den Kamm und das Band von der Rückseite der Gelkassette.
Lösen Sie zunächst Proben im herkömmlichen Zymographie-Probenpuffer auf. 400 Milliliter os 1X Tris Glycen SDS Laufpuffer zum Gelgerät geben. Laden Sie bis zu 35 Mikroliter Probe pro Bohrgut.
Führen Sie die Proben bei 120 Volt bei vier Grad Celsius anderthalb Stunden oder bis die Molekulargewichtsstandards darauf hinweisen, dass sich die Proteasen von Interesse innerhalb der Peptid-auflösenden Gelschicht befinden. Danach entfernen Sie die Gele aus der Kunststoffkassette. Waschen Sie die Gele dreimal im Renaturierungspuffer bei Raumtemperatur unter sanfter Rührung.
Mit jeder Wäsche, dauert 10 Minuten. Übertragen Sie Gele für 15 Minuten in eine sich entwickelnde Pufferlösung. Dann ersetzen Sie die Lösung durch frisch entwickelnden Puffer und brüten bei 37 Grad Celsius unter sanfter Agitation für 24 Stunden.
Verwenden Sie danach einen fluoreszierenden Gelscanner-Imager mit den entsprechenden Anregungs- und Emissionsfiltern, um die Gele abzubilden. In dieser Studie zu fluoreszierender Protease werden abbaubare Peptide in Polyacrylamidgele eingearbeitet. QGIW ist eine Kollagen-Sequenz, die entwickelt wurde, um zelluläre Kollagenzuerkennen zu erkennen, während LACW eine Sequenz ist, die für die Detektion von MMP-14 und MMP-11 optimiert wurde.
Fluoreszierende Bildgebung zeigt zahlreiche Bänder innerhalb der LACW Peptid Gele, Während nur ein einziges Band in den QGIW Gelen gesehen wird. Im Vergleich zur Gelatinezymographie sind LACW-Gele in der Lage, mehr proteolytische Bänder zu erkennen, was die Fähigkeit der Peptidzymographie demonstriert, eine breitere Palette von Proteasen in biologischen Proben zu erkennen als herkömmliche Methoden mit nativen Substraten. Peptidzymographie-Zellen werden dann im Entwicklungspuffer inkubiert, der entweder GM6001, einen Breitspektrum-MMP-Hemmer, oder E64, einen allgemeinen Kathepsin-Inhibitor, enthält.
Die Behandlung der LACW Peptidgele mit GM6001 verringert die Intensität der Bänder. Während die Behandlung mit E64 keine erkennbare Wirkung hat. Die Behandlung der QGIQ Peptidgele mit GM6001 führt zu einer vollständigen Ablation der bisher gesehenen Bänder.
Während E64 keine Wirkung hat. Die Gelatinezymographie wird mit gereinigtem, aktiviertem MMP-9 durchgeführt, um die Empfindlichkeit der Peptidzymographie mit dem aktuellen Goldstandard zu vergleichen. LACW-Gele sind in der Lage, kleinste Konzentrationen von MMP-9 zu erkennen.
Proteasen erfordern spezifische Bedingungen, um sich neu zu veranlassen und aktiviert zu werden. Bereiten Sie die Pufferlösungen sorgfältig vor, um sicherzustellen, dass die Zusammensetzung und PH korrekt sind. Diese Methode kann durch bestehende Techniken zur Überprüfung der Identität und zur weiteren Analyse der gemessenen Proteasen ergänzt werden.
Dazu gehören Western Blotting, Echtzeit-PCR und Massenspektrometrie. Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit Polyacrylamid. Unpolymerisierte Lösung gilt als starkes Neurotoxin und geeignete persönliche Schutzausrüstung sollte immer bei der Handhabung getragen werden.
