This work received support through grant HA 6136/1-1 from the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) to MH. JAT is supported by Program and Project Grants from the National Health and Medical Research Council of Australia.

NOTA: Los bazos fueron derivadas de ratones (6-10 semanas de edad) y todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices de Ética Animal del Centro de Cáncer Peter MacCallum (E486). 1. Preparación de las muestras. <ol><li> Preparación de células de ratón NK activadas. <ol><li> Aislar las células NK ingenuos primarias a partir de suspensiones de una sola célula de bazo de C57BL / 6 o B6.GrzmB - / - (GzmB gen null) ratones por selección negativa utilizando kits disponibles en el mercado. </li><li> Siga el protocolo de los fabricantes. Brevemente, magnéticamente marcar las células NK &quot;no&quot;, tales como las células T y B, células dendríticas, granulocitos, macrófagos, y células rojas de la sangre utilizando anticuerpos conjugados con biotina contra sus marcadores de superficie específicos. Utilice separación magnética con cuentas anti-biotina para agotar las células NK &quot;no&quot;. </li><li> Aislado Cultura células NK durante 5-7 días en medio que contenía IL-2 (1000 U / ml) a 700,000 células / ml en placas de 24 pocillosa 37 &#160; ° C. </li><li> Alternativamente, el uso de células T activadas 19, CTL restringido el antígeno principal de OT1 receptor de células T de ratones transgénicos 20, CTL generados en cultivos mixtos de linfocitos 21, o los sobrenadantes de las células NK activadas para determinar la actividad de secretada GzmB 19. </li></ol></li><li> Mantenimiento de la línea humana de células NK y el aislamiento de células primarias NK. <ol><li> Mantener la leucemia NK humana (células YT) en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado con 10% de suero de ternera fetal. Alternativamente, purificar células NK primarias de la sangre periférica de sujetos sanos y estimular durante 2-3 días en medio que contiene IL-2 a 100 U / ml como se ha descrito previamente 22. </li></ol></li><li> Generación de lisados ​​celulares. <ol><li> Lavar las células tres veces en PBS (pH 7,4), a continuación, suspender en Nonidet P-40 tampón de lisis (0,1% NP-40, NaCl 250 mM, 25 mM Hepes, EDTA 2,5 mM). Idealmente, la lisis de un mínimo de 5 x 10 6 </sarriba&gt; células NK, o 1 x 10 7 células T en 100 l de tampón. No añadir inhibidores de la proteasa, ya que muchos son inhibidores irreversibles de proteasas de serina, y en triptasas particulares como GzmA. Incubar en hielo durante 20 min, y luego sedimentar los núcleos en una microcentrífuga a 15.000 xg durante 10 min. Desechar el pellet nuclear y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. </li></ol></li><li> Determinar la concentración de proteína de los lisados. <ol><li> Use un protocolo disponible comercialmente de elección tales como, Bradford o ácido bicinconínico (BCA) y determinar la concentración de proteínas. Asegúrese de que la concentración es de ~ 2 mg mínimo / ml. Lisados ​​almacenar a -20 ° C hasta que sea necesario (actividad granzima es estable durante muchos meses a -20 ° C). </li></ol></li></ol> 2. granzima B Ensayo de la actividad <ol><li> Preparación de los reactivos <ol><li> Preparar una mM balance de los sustratos (Boc-AAD-S-Bzl o Ac-IEPD-PNA) 10 en DMSO (~ 5 mg / ml) y almacenar en alícuotas a -20 &amp; #176; C. Prepare una dilución de trabajo recién y desechar después de cada día, como Boc-AAD-S-Bzl hidroliza parcialmente en el almacenamiento en DMSO. </li><li> Preparar una población de 250 mM de reactivo colorimétrico (5,5&#39;-ditio-bis (ácido 2-nitrobenzoico), DTNB) en DMSO (0,09 g / ml) y se almacena a -20 ° C. Prepare una dilución de trabajo nueva cada día. Este reactivo sólo se requiere para sustratos con grupos indicadores SBzl, no ANP. </li><li> Invente tampón fresco (0,1 M HEPES, 0,05 M MgCl 2, pH 7,3) cada 2-3 semanas. </li></ol></li><li> Llevar DTNB y sustratos sintéticos a temperatura ambiente. Diluir sustratos (1:16, por ejemplo, 100 l en 1,6 ml de tampón) y DTNB (1: 250, por ejemplo, 10 l en tampón 2,5 ml) y mezclar bien. </li><li> Diluir un mínimo de 100 g de proteína de lisado de cada muestra en un tampón a un volumen final de 160 microlitros. Usando una pipeta multicanal añadir 50 l por pocillo por triplicado (~ 33,3 g / pocillo) en una &#39;&#39; U &#39;&#39; de vinilo del fondo placa de 96 pocillos.Incluir un &quot;búfer de sólo&quot; control (también por triplicado). </li><li> Añadir 100 l de diluirse DTNB para el control de muestras / tampón (omita este paso cuando se trabaja con Ac-IEPD-pNA. NOTA: La escisión de Ac-IEPD-pNA por GzmB libera directamente fluorogénica pNA (Figura 4B). </li><li> Utilizar una pipeta multicanal para añadir rápidamente 50 l de sustratos diluidas a cada conjunto de triplicados, empezando con el tampón entonces cualquier controles negativos y terminando con muestras positivas esperados. </li><li> Colocar la placa en el lector de placas. Medir la actividad Asp-asa por hidrólisis de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl / Ac-IEPD-pNA en un lector de microplacas a OD 405 nm. Utilice un protocolo de ensayo cinético, tomar 25 lecturas, cada 15 segundos (aprox 6 min tiempo de lectura total). </li><li> Use las lecturas de absorbancia generadas en cada punto de tiempo para calcular manualmente la tasa de escisión de sustrato de si el software del lector de placas no puede generar un valor de Vmax. </li></ol> 3. Análisis de Data NOTA: Los datos generados se presenta como velocidad máxima, que se define como el cambio de OD en el tiempo (mod / min). <ol><li> Para analizar los datos, determinar la tasa máxima de escisión de sustrato, que se calcula a partir de la tasa de cambio en la absorbancia. Hacer esto automáticamente con el software lector de placas, que normalmente tiene esta opción. </li><li> Alternativamente después de ver las parcelas cinéticos de cambio en la absorbancia, que se generan durante el ensayo cinético en el lector de placas, seleccionar manualmente los puntos de datos que dan a la línea recta más empinada. Para la mayoría de los ensayos se consigue la tasa máxima dentro de la primera 2 min del ensayo. </li><li> Restar la lectura OD inicial a partir de la lectura más alta OD en esta línea recta y se dividen por el intervalo de tiempo. Transferir datos brutos a Microsoft Excel / Gráfico almohadilla para el análisis estadístico y gráfico. </li></ol>

<ol>
	<li>Trapani, J. A., Browne, K. A., Dawson, M., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunopurification+of+functional+Asp-ase+(natural+killer+cell+granzyme+B)+using+a+monoclonal+antibody).">Immunopurification of functional Asp-ase (natural killer cell granzyme B) using a monoclonal antibody).</a> Biochem Biophys Res Commun. 195 (2), 910-920 (1993).</li><li>Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quarter+century+of+granzymes.">A quarter century of granzymes.</a> Cell Death Differ. 19 (1), 28-35 (2012).</li><li>Hoves, S., Trapani, J. A., Voskoboinik, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+battlefield+of+perforin/granzyme+cell+death+pathways.">The battlefield of perforin/granzyme cell death pathways.</a> J Leukoc Biol. , (2009).</li><li>Peters, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T+lymphocyte+granules+are+secretory+lysosomes,+containing+both+perforin+and+granzymes.">Cytotoxic T lymphocyte granules are secretory lysosomes, containing both perforin and granzymes.</a> J Exp Med. 173 (5), 1099-1109 (1991).</li><li>Berthou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition+of+granzyme+B+and+Fas+ligand+proteins+by+human+keratinocytes+contributes+to+epidermal+cell+defense.">Acquisition of granzyme B and Fas ligand proteins by human keratinocytes contributes to epidermal cell defense.</a> J Immunol. 159 (11), 5293-5300 (1997).</li><li>Tschopp, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granzyme+B,+a+novel+mediator+of+allergic+inflammation:+its+induction+and+release+in+blood+basophils+and+human+asthma.">Granzyme B, a novel mediator of allergic inflammation: its induction and release in blood basophils and human asthma.</a> Blood. 108 (7), 2290-2299 (2006).</li><li>Strik, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mast+cells+produce+and+release+the+cytotoxic+lymphocyte+associated+protease+granzyme+B+upon+activation.">Human mast cells produce and release the cytotoxic lymphocyte associated protease granzyme B upon activation.</a> Mol Immunol. 44 (14), 3462-3472 (2007).</li><li>Jahrsdorfer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granzyme+B+produced+by+human+plasmacytoid+dendritic+cells+suppresses+T+cell+expansion.">Granzyme B produced by human plasmacytoid dendritic cells suppresses T cell expansion.</a> Blood. , (2009).</li><li>Hagn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+B+cells+secrete+granzyme+B+when+recognizing+viral+antigens+in+the+context+of+the+acute+phase+cytokine+IL-21.">Human B cells secrete granzyme B when recognizing viral antigens in the context of the acute phase cytokine IL-21.</a> J Immunol. 183 (3), 1838-1845 (2009).</li><li>Hagn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+B+cells+differentiate+into+granzyme+B-secreting+cytotoxic+B+lymphocytes+upon+incomplete+T-cell+help.">Human B cells differentiate into granzyme B-secreting cytotoxic B lymphocytes upon incomplete T-cell help.</a> Immunol Cell Biol. 90 (4), 457-467 (2012).</li><li>Froelich, C. J., Pardo, J., Simon, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granule-associated+serine+proteases:+granzymes+might+not+just+be+killer+proteases.">Granule-associated serine proteases: granzymes might not just be killer proteases.</a> Trends Immunol. 30 (3), 117-123 (2009).</li><li>Hagn, M., Jahrsdorfer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+do+human+B+cells+secrete+granzyme+B?+Insights+into+a+novel+B-cell+differentiation+pathway.">Why do human B cells secrete granzyme B? Insights into a novel B-cell differentiation pathway.</a> Oncoimmunology. 1 (8), 1368-1375 (2012).</li><li>Susanto, O., Trapani, J. A., Brasacchio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controversies+in+granzyme+biology.">Controversies in granzyme biology.</a> Tissue Antigens. 80 (6), 477-487 (2012).</li><li>Walch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+cells+kill+intracellular+bacteria+through+granulysin-mediated+delivery+of+granzymes.">Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes.</a> Cell. 157 (6), 1309-1323 (2014).</li><li>Odake, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+and+murine+cytotoxic+T+lymphocyte+serine+proteases:+subsite+mapping+with+peptide+thioester+substrates+and+inhibition+of+enzyme+activity+and+cytolysis+by+isocoumarins.">Human and murine cytotoxic T lymphocyte serine proteases: subsite mapping with peptide thioester substrates and inhibition of enzyme activity and cytolysis by isocoumarins.</a> Biochemistry. 30 (8), 2217-2227 (1991).</li><li>Casciola-Rosen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+and+human+granzyme+B+have+distinct+tetrapeptide+specificities+and+abilities+to+recruit+the+bid+pathway.">Mouse and human granzyme B have distinct tetrapeptide specificities and abilities to recruit the bid pathway.</a> J Biol Chem. 282 (7), 4545-4552 (2007).</li><li>Kaiserman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+human+and+mouse+granzymes+are+structurally+and+functionally+divergent.">The major human and mouse granzymes are structurally and functionally divergent.</a> J Cell Biol. 175 (4), 619-630 (2006).</li><li>Powers, J. C., Kam, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+thioester+substrates+for+serine+peptidases+and+metalloendopeptidases.">Peptide thioester substrates for serine peptidases and metalloendopeptidases.</a> Methods Enzymol. 248, 3-18 (1995).</li><li>Hagn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+mouse+B+cells+lack+expression+of+granzyme.">Activated mouse B cells lack expression of granzyme.</a> B. J Immunol. 188 (2), 3886-3892 (2012).</li><li>Konjar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+and+mouse+perforin+are+processed+in+part+through+cleavage+by+the+lysosomal+cysteine+proteinase+cathepsin+L.">Human and mouse perforin are processed in part through cleavage by the lysosomal cysteine proteinase cathepsin L.</a> Immunology. 131 (2), 257-267 (2010).</li><li>Sutton, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+active+granzyme+B+in+cathepsin+C-null+lymphocytes+is+sufficient+for+perforin-dependent+target+cell+apoptosis.">Residual active granzyme B in cathepsin C-null lymphocytes is sufficient for perforin-dependent target cell apoptosis.</a> J Cell Biol. 176 (4), 425-433 (2007).</li><li>Trapani, J. A., Smyth, M. J., Apostolidis, V. A., Dawson, M., Browne, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granule+serine+proteases+are+normal+nuclear+constituents+of+natural+killer+cells.">Granule serine proteases are normal nuclear constituents of natural killer cells.</a> J Biol Chem. 269 (28), 18359-18365 (1994).</li><li>Cullen, S. P., Adrain, C., Luthi, A. U., Duriez, P. J., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+and+murine+granzyme+B+exhibit+divergent+substrate+preferences.">Human and murine granzyme B exhibit divergent substrate preferences.</a> J Cell Biol. 176 (4), 435-444 (2007).</li><li>Thornberry, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+approach+defines+specificities+of+members+of+the+caspase+family+and+granzyme+B.+Functional+relationships+established+for+key+mediators+of+apoptosis.">A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis.</a> J Biol Chem. 272 (29), 17907-17911 (1997).</li><li>Bird, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+regulation+of+apoptosis:+the+cytotoxic+lymphocyte+serpin+proteinase+inhibitor+9+protects+against+granzyme+B-mediated+apoptosis+without+perturbing+the+Fas+cell+death+pathway.">Selective regulation of apoptosis: the cytotoxic lymphocyte serpin proteinase inhibitor 9 protects against granzyme B-mediated apoptosis without perturbing the Fas cell death pathway.</a> Mol Cell Biol. 18 (11), 6387-6398 (1998).</li><li>Bots, M., Medema, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serpins+in+T+cell+immunity.">Serpins in T cell immunity.</a> J Leukoc Biol. 84 (5), 1238-1247 (2008).</li><li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+family+of+10+murine+ovalbumin+serpins+includes+two+homologs+of+proteinase+inhibitor+8+and+two+homologs+of+the+granzyme+B+inhibitor+(proteinase+inhibitor+9).">A new family of 10 murine ovalbumin serpins includes two homologs of proteinase inhibitor 8 and two homologs of the granzyme B inhibitor (proteinase inhibitor 9).</a> J Biol Chem. 272 (24), 15434-15441 (1997).</li><li>Bird, C. H., Hitchen, C., Prescott, M., Harper, I., Bird, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodetection+of+granzyme+B+tissue+distribution+and+cellular+localisation.">Immunodetection of granzyme B tissue distribution and cellular localisation.</a> Methods Mol Biol. 844, 237-250 (2012).</li><li>Jenkins, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+CTL+activity+for+different+CD8++effector+T+cells+supports+the+idea+that+lower+TCR/epitope+avidity+may+be+advantageous+for+target+cell+killing.">Visualizing CTL activity for different CD8+ effector T cells supports the idea that lower TCR/epitope avidity may be advantageous for target cell killing.</a> Cell Death Differ. 16 (4), 537-542 (2009).</li><li>Edwards, K. M., Kam, C. M., Powers, J. C., Trapani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+cytotoxic+T+cell+granule+serine+protease+granzyme+H+has+chymotrypsin-like+(chymase)+activity+and+is+taken+up+into+cytoplasmic+vesicles+reminiscent+of+granzyme+B-containing+endosomes.">The human cytotoxic T cell granule serine protease granzyme H has chymotrypsin-like (chymase) activity and is taken up into cytoplasmic vesicles reminiscent of granzyme B-containing endosomes.</a> J Biol Chem. 274 (43), 30468-30473 (1999).</li><li>Sutton, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+apoptosis+by+granzyme+B+requires+direct+cleavage+of+bid,+but+not+direct+granzyme+B-mediated+caspase+activation.">Initiation of apoptosis by granzyme B requires direct cleavage of bid, but not direct granzyme B-mediated caspase activation.</a> J Exp Med. 192 (10), 1403-1414 (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Históricamente las granzimas fueron identificados como moléculas efectoras clave de linfocitos citotóxicos (CTL y células NK) capaces de inducir una muerte apoptótica rápida en las células diana. Esto se debió principalmente a la acción de GzmB, que escinde moléculas de sustrato diana a aspartato (D) los residuos y por lo tanto fue capaz de activar la cascada de caspasas por ambas escisión pro-caspasas, así como varios de sus objetivos de abajo. Sin embargo, ahora se aprecia que la expresión GzmB no se limi...

Granzimas son una familia de serina proteasas que se encuentran en los lisosomas secretores de las células (NK) y linfocitos T citotóxicos (CTL) 1 asesino natural. Existen cinco granzimas diferentes en los seres humanos (A, B, H, K y M), y diez en ratones (A - G, K, M y N) 2,3. Granzima A y granzima B (GzmA, GzmB) son las más abundantes y han sido investigadas extensamente en el ambiente humano y de roedor. La función clásica de GzmB es la inducción de apoptosis en las células diana ejecutados en conjunción con la proteína de perforina de formación de poros, que permite la granzima para acceder al citosol de la célula diana 4. Aunque la expresión GzmB se encuentra de manera inequívoca en los linfocitos citotóxicos, estudios recientes se han ocupado de una variedad de otros tipos de células que expresan GzmB, incluyendo pero no limitado a los queratinocitos 5, 6 basófilos, mastocitos, células dendríticas 7 plasmacitoides 8, 9 y las células B, 10.En este contexto, las funciones GzmB no apoptóticas fueron revelados desde la participación en los procesos inflamatorios, la remodelación de tejidos y otras propiedades inmunorreguladoras 11-14. Dado que un papel biológico más amplio se ha propuesto para GzmB lo que se sospechaba previamente, los investigadores necesitan herramientas fiables y específicos para su detección. De la ventaja es requisito específico de GzmB para escindir en el lado carboxilo de residuos de ácido aspártico, una propiedad única entre serina proteasas eucariotas 15. Ratón, humano y de rata GzmB son estructuralmente muy similares, sin embargo, la especificidad de sustrato prolongado de GzmB ratón difiere sutilmente de que tanto de humano y de rata 16, lo que significa que ciertos sustratos genéricos con Asp en la terminal (P1) se pueden escindir eficientemente por GzmB de las tres especies, mientras que otros sustratos con secuencias más complicadas aguas arriba de P1 puede dar resultados muy variables. Tanto en el pasado y li más recienteterature, este hecho ha causado gran confusión y mala interpretación de la importancia biológica de algunos resultados experimentales, aunque cuidadosamente controlado, estudios cinéticos han tratado de corregir la situación 17. En este trabajo hemos tratado de ilustrar estos puntos usando dos sustratos disponibles en el mercado, a saber, Boc-Ala-Ala-Asp-SBzl y N-acetil-Ile-Glu-Pro-Asp-p-nitroanilida. Los dos reactivos hacer generar diferentes grupos reactivos después de la escisión (un sulfhidrilo libre versus un paranitroanilida libre fluorescente), pero esto no tiene efecto alguno sobre la escisión proteolítica. El protocolo descrito es una adaptación moderna de un protocolo muy antiguo 18, pero debería ayudar a los investigadores a utilizar los diferentes sustratos GzmB adecuadamente, mientras que también proporciona un marco metodológico para la detección de la actividad de otros granzimas, como GzmA y GzmH.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1133">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:284px;">Product</td>
			<td style="width:241px;">Company</td>
			<td style="width:181px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:427px;">Comment/description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl</td>
			<td>SM Biochemicals LLC, CA</td>
			<td>SMSB05</td>
			<td>Granzyme B substrate (mouse and human)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ac-IEPD-pNA&#160;</td>
			<td>SM Biochemicals LLC, CA</td>
			<td>SMPNA009</td>
			<td>Granzyme B substrate (only human)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-a-CBZ-L-lysine-S-Bzl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3647</td>
			<td>Granzyme A substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl</td>
			<td>SM Biochemicals LLC, CA</td>
			<td>SB025</td>
			<td>Granzyme H substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5,5&#8217;-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8130</td>
			<td>&#160;DTNB, Ellman&#8217;s Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NK cell isolation kit II mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td style="width:181px;">130-096-892</td>
			<td style="width:427px;">negative selection kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NK cell isolation kit human</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-092-657</td>
			<td style="width:427px;">negative selection kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate reader</td>
			<td>Biorad iMark</td>
			<td></td>
			<td>Biorad Microplate Manager Software Version MPM6.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Serocluster U-bottom vinyl 96-well plate</td>
			<td>Corning, MA, USA</td>
			<td>2797</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a colorimetric assay that specifically measures granzyme b proteolytic activity: hydrolysis of boc-ala-ala-asp-s-bzl

The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is the most studied granzyme in humans and mice and therefore, researchers need specific and reliable tools to study its function and role in pathophysiology. This especially necessitates assays that do not recognize proteases such as caspases or other granzymes that are structurally or functionally related. Here, we apply GzmB&#8217;s preference for cleavage after aspartic acid residues in a colorimetric assay using the peptide thioester Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. GzmB is the only mammalian serine protease capable of cleaving this substrate. The substrate is cleaved with similar efficiency by human, mouse and rat GzmB, a property not shared by other commercially available peptide substrates, even some that are advertised as being suitable for this purpose. This protocol is demonstrated using unfractionated lysates from activated NK cells or CTL and is also suitable for recombinant proteases generated in a variety of prokaryotic and eukaryotic systems, provided the correct controls are used. This assay is a highly specific method to ascertain the potential pro-apoptotic activity of cytotoxic molecules in mammalian lymphocytes, and of their recombinant counterparts expressed by a variety of methodologies.

El sustrato Boc-AAD-S-Bzl es específico para GzmB El GzmB serina proteasa es un constituyente principal de los linfocitos citotóxicos (CTL y células NK) y es predominantemente responsable de inducir la rápida muerte apoptótica en las células diana, tales como células infectadas por virus o transformadas. Esto es en gran parte debido a su preferencia de sustrato para la escisión después de ciertos residuos de aspartato específicos en las proteínas seleccionadas, un...

Watch this Scientific Journal Video about A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl at JoVE.com

A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

We describe a simple, quantitative colorimetric assay that specifically measures the proteolytic activity of human, mouse or rat Granzyme B (GzmB). This protocol can be easily adapted for determining protease activity of other granule serine proteases by the hydrolysis of other synthetic peptide substrates with an appropriate recognition sequence.

Un ensayo colorimétrico que mide específicamente granzima B actividad proteolítica: La hidrólisis de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is ...

a-colorimetric-assay-that-specifically-measures-granzyme-b

Research

JoVE Journal

Chemistry

12.9K vistas.  Peter MacCallum Cancer Centre. We describe a simple, quantitative colorimetric assay that specifically measures the proteolytic activity of human, mouse or rat Granzyme B (GzmB). This protocol can be easily adapted for determining protease activity of other granule serine proteases by the hydrolysis of other synthetic peptide substrates with an appropriate recognition sequence.