This work was supported by the United States Federal Drug Administration (FDA) contract HHSF223201310224C and the United States National Institutes of Health/FDA grant 1U01FD004573-01.

De-identifizierte Blutproben von gesunden Personen waren von der University of Colorado Hospital (Aurora, Colorado). Die Verwendung von de-identifizierten Blutbank-Proben für die Validierungsstudien sowie für die Herstellung von Kalibratoren und Qualitätskontrollproben wurde als von der Colorado Mehr Institutional Review Board (COMIRB, Aurora, Colorado) &quot;befreit&quot;. 1. Herstellung von Referenzen und Lösungen <ol><li> Kauf Tacrolimus und der interne Standard D 2, 13 C-Tacrolimus aus den in der Materialliste aufgeführt Anbieter. <ol><li> Stammlösungen in reinem Methanol bei einer Konzentration von 1 mg / ml für Tacrolimus und einer Konzentration von 10 ug / ml D 2, 13 C-Tacrolimus. Machen Stammlösungen von Referenzmaterialien auf Basis von drei unabhängigen Gewichtungen. Aliquot Stammlösungen und bei -70 ° C oder darunter. </li></ol></li><li> Bereiten Lösung Proteine ​​auszufällenund extrahieren Tacrolimus Verwendung von Methanol / 0,2 M ZnSO 4 in Wasser (7: 3, V: V). Diese Lösung enthält auch den internen Standard D 2, 13 C-Tacrolimus in einer Konzentration von 2,5 ng / ml und wird für die Extraktion von allen Proben mit Ausnahme der Entnahme von Leerproben (siehe 1.3.3) verwendet. <ol><li> Bereiten Sie diese Proteinfällungslösung frisch auf jeder Extraktion Tag und stellen Sie den Ablauf der Lösung bei 12 Stunden. </li></ol></li><li> Herstellung der Eichkurve und Qualitätskontrolle (QC) Proben <ol><li> Bereiten Stammlösungen von Tacrolimus, indem geeignete Verdünnungen der Stammlösung mit reinem Methanol. </li><li> Um Kalibratoren und Qualitätskontrollproben vorzubereiten, Spike 20 ul entsprechend verdünnten Stammlösung in EDTA-Vollblut, bei 37 ° C unter leichtem im Wasserbad Schütteln, um eine homogene Verteilung von Tacrolimus in die zellulären Blutbestandteile für 20 min und aliquoten ermöglichen in 1,5 ml Polypenropylene Röhrchen mit konischem Boden und Schnappdeckel. Sicherzustellen, dass das relative Volumen an organischem Lösungsmittel 5% nicht übersteigen. </li><li> Spot 50 ul der Stachelvollblut in der Mitte jedes Kreises auf der Filterkarten unter Verwendung einer Pipette. </li><li> Trocknen Sie die Blutflecken auf Filterkarten bei RT für 3 h. </li><li> Vorbereitung Tacrolimus Kalibrierstandards humanes EDTA-Vollblut bei Tacrolimus Konzentrationen von 1, 2,5, 5, 10, 25 und 50 ng / ml. Bereiten Sie eine leere Probe für die Extraktion wie die Kalibrierungsstandards mit der Proteinfällung Lösung, die den internen Standard D 2, 13 C-Tacrolimus (&quot;Nullprobe&quot;). </li><li> Vorbereitung QC Proben menschlichen EDTA-Vollblut bei Konzentrationen von 0, 2, 4, 20, 40 ng / ml. Bereiten Sie eine leere Probe. Im Gegensatz zu den QC-Proben, die mit Ausfällen den internen Standard enthält D 2 extrahiert werden, 13 C-Tacrolimus, extrahieren Sie diese Blindprobe mit Proteinfällungslösung, die funktioniertnicht enthalten, die den internen Standard D 2, 13 C-Tacrolimus (&quot;Blindprobe&quot;). </li></ol></li><li> Sammlung von klinischen Proben <ol><li> Sammeln getrocknete Blutflecken wie in 43,44 beschrieben. </li></ol></li></ol> 2. Extraktion von Tacrolimus Trockenblut Proben <ol><li> Sichtprüfung der getrockneten Blutfleck auf akzeptable Probenqualität und Volumen 45 zu gewährleisten. </li><li> Punch Zentrum der Blutfleck auf der Filterkarte mit einem 6-mm-Lochung. Hinweis: Die Qualität von Schlägen kann durch Wiegen kontrolliert werden. Eine Stanz gesättigten Filterscheibe wiegt durchschnittlich 5,02 mg ± 0,09 mg (Bereich: 4.83- 5.14 mg, n = 12). </li><li> Platz Scheiben in 1,5 ml Polypropylen-Röhrchen mit konischem Boden und Schnappdeckel. </li><li> Hinzufügen 20-30 Kugeln in jedes Röhrchen. </li><li> Fügen Sie 500 ul der Proteinfällungslösung (Methanol: 0,2 M ZnSO 4, 7: 3, V: V mit 2,5 ng / ml interner Standard) in jedes Röhrchen. Für die extrWirkung von Leerproben, verwenden Proteinfällungslösung ohne inneren Standard. </li><li> Homogenisieren die Scheiben in der Kugel-Mischer für 1 min (Maximaldrehzahl, der Einstellung &quot;10&quot;). </li><li> Schütteln Sie Proben bei RT auf Mehrrohr Vortex (Maximaldrehzahl, die Einstellung &quot;10&quot;) für 10 min. </li><li> Zentrifuge Proben bei 16.000 × g und 4 ° C für 10 min. </li><li> Die Überstände in Glas HPLC-Ampullen mit einer 300 ul Einsatz ausgestattet. Verwenden vorgeschlitzten Teflondichtungen. Anmerkung: Die extrahierten Proben können bei -20 ° C oder darunter, bis LC-MS / MS-Analyse gespeichert werden. </li></ol> 3. LC-MS / MS-Analyse <ol><li> Last 100 ul des Überstands der extrahierten Probe auf die Extraktionssäule C8 Patrone und waschen mit einem 7: 3-Verhältnis von 0,1% Ameisensäure in Wasser: Acetonitril, bei einem Fluss von 5 ml / min für 1 min. Die Anschlüsse des Schaltventils sind in Figur 2 gezeigt und die Steigung durch die Extraktionspumpe in Tabelle 1 ausgeführt </strong&gt;. </li><li> Jenseits, aktivieren Sie die Schaltventil, was zu Rückspülung der Analyten aus der Vorsäule auf die analytische Säule. </li><li> Stellen Sie den Säulenthermostat auf 65 ° C. </li><li> Elution der Analyten aus der analytischen Säule mit Hilfe der Durchflussraten und Gradienten in Tabelle 1 dargestellt. </li><li> Schließen Sie die Trennsäule mit einem Tandem-Massenspektrometer über das Turbo-Elektrospray-Ionisations-Quelle. Anpassung der wesentlichen Parameter des Massenspektrometers gemäß Tabelle 2. </li><li> Erkennung von positiven Ionen ([M + Na] +) in der Mehrfachreaktionsmodus (MRM). Verwenden Sie die folgenden Ionenübergänge für die Quantifizierung: Tacrolimus: m / z (Masse / Ladungs) = 826,6 → 616,2 und D 2, 13 C-Tacrolimus: m / z = 829,6 → 619,2. Hinweis: Die Gesamtlaufzeit beträgt 4,6 min. </li></ol> 4. Quantifizierung <ol><li> Für jeden Durchlauf, erzeugen eine Eichkurve auf der Grundlage der in 1.3.5 und hergestellt Kalibratorengehören in jede Analysenserie. <ol><li> Generieren Sie eine Eichkurve Nennkonzentrationen gegenResponseFaktor des Analyten (Peakfläche [Analyt] / Peak-Bereich [interner Standard]) unter Verwendung des Massenspektrometers Software. </li><li> Setzen Sie die Kalibratoren mit einer quadratischen Anpassung in Verbindung mit 1 / X Gewichtung. </li></ol></li><li> Quantität Tacrolimus in den getrockneten Blutflecken integrieren die Tacrolimus und des internen Standardpeaks in den extrahierten MRM Chromatogramme. Berechnen Sie die Reaktionsfaktor für Tacrolimus (Peakfläche [Analyt] / Peak-Bereich [interner Standard]) und vergleichen Sie mit der Eichkurve unter Verwendung der Massenspektrometrie-Software. </li></ol> 5. Validierungsverfahren <ol><li> Untere Nachweisgrenze (untere Nachweisgrenze) und Untergrenze (LLOQ). <ol><li> Betrachten wir die niedrigste Konzentration von Tacrolimus mit einer Spitze-zu-Rausch-Verhältnis von 4: 1 als die untere Nachweisgrenze (untere Nachweisgrenze). Definieren Sie die untere Grenze der Quantifizierung (LLOQ) alsniedrigste Konzentration der Eichkurve mit einer Genauigkeit, die gleich oder besser als ± 20% Abweichung von der Soll-Konzentration und Präzision gleich oder besser als 20% (Variationskoeffizient). </li></ol></li><li> Intra- und inter Tag Genauigkeiten und Präzisierungen. <ol><li> Testen der Genauigkeit und Präzision bei vier Konzentrationen von 2 ng / ml (QC1), 4 ng / ml (QC2), 20 ng / ml (QC3) und 40 ng / ml (QC4). </li><li> Bereiten Sie die QC-Proben auf jeder Validierung Tag im menschlichen EDTA-Vollblut, Trocken auf Filterkarten, extrahieren und zu analysieren, wie oben beschrieben. </li><li> Bestimmen Sie Intraday-Genauigkeit und Präzision mit 6 Proben pro QC Konzentration. </li><li> Beurteilen Sie Inter-Day-Genauigkeit und Präzision über 20 Tage. Messen Sie jedes QC-Ebene mit 4 Proben pro Tag. </li><li> Analysieren Sie zwei Kalibrierungskurven zusammen mit den QC-Proben an jedem Tag. </li><li> Intraday-Genauigkeit zu berechnen als% der Nominalkonzentration (sechs Proben pro Konzentrationsstufe, siehe 5.2.2). CalcUlate Präzision als Varianzkoeffizienten (CV%). </li><li> Betrachten Sie Intraday-Genauigkeit akzeptabel, wenn sie fällt in der vorgegebenen Grenzwerte in 85% bis 115% des Nominalkonzentration. Sehen untertägigen Genauigkeit akzeptabel ist, wenn er gleich oder besser als ein CV (Variationskoeffizient) von 15%. </li><li> Berechnen inter Tag Genauigkeit und Präzision als Mittelwert für jeden QC Konzentration an den 20 Validierungs Tagen analysiert. </li><li> Betrachten mittlere Inter-Day-Genauigkeit akzeptabel, wenn sie fällt in der vorgegebenen Grenzwerte in 85% bis 115% des Nominalkonzentration. Prüft unter Tages Genauigkeit akzeptabel ist, wenn er gleich oder besser als ein CV (Variationskoeffizient) von 15%. </li></ol></li><li> Ausschluss von Matrixinterferenzen. <ol><li> Für den Ausschluss von Störungen, die durch die Matrix-Signale verursacht werden können, zu analysieren leere getrocknete Blutflecken (8 verschiedenen Individuen, vorzugsweise 4 Männer und 4 Frauen). </li><li> Sichtprüfung Ionenchromatogramme. Wenn Spitzen innerhalb der RetentionszeitFenster von Tacrolimus festgestellt werden, zu integrieren und vergleichen Sie die Flächen unter der Kurve mit denen von Tacrolimus Spitzen im Leerproben gespickt mit Tacrolimus im LLOQ. Die Fläche der Peaks in den Leerproben sollen nicht 15% der von Tacrolimus im LLOQ überschreiten. </li></ol></li><li> Ionensuppression / ion Verbesserung. <ol><li> Verwenden Sie einen Post-Spalte Infusionsprotokoll, wie beschrieben, 45, um mögliche Störungen von Ionenunterdrückung / ion Verbesserung durch koeluierenden Matrixkomponenten verursacht zu bewerten. </li><li> Infundieren Tacrolimus in einer Konzentration von 10 ug / ml in 0,1% iger Ameisensäure gelöst: Methanol (30:70, v / v) post-Säule mit einer Geschwindigkeit von 10 ul / min. <ol><li> Verbinden einer Spritzpumpe über T-Stück zwischen der Trennsäule und dem Elektrosprayquelle des Massenspektrometers. </li><li> Überwacht die MS / MS-Signalintensität der MRM Gänge für Tacrolimus und seiner internen Standard (m / z = 826,6 → 616,2 und m / z = 829,6 → 619,2) nach der Injektion von extracted Leerproben (n = 8 Proben von verschiedenen Individuen). Anmerkung: In Abwesenheit von Ionenunterdrückung / Ionenanreicherungs sollte das Dauersignal von einer Infusion der Analyten verursacht nicht durch Injektion des Blindmatrix beeinflusst werden, während Ionensuppression bewirkt einen Sprung des Signals und Ionenanreicherungs ein Peak. </li></ol></li></ol></li><li> Übertrag. <ol><li> Bewertung der potenziellen Übertrag durch Analysieren extrahierten Leerproben nach den höchsten Kalibratoren (50 ng / ml, n = 6). </li><li> Sichtprüfung Ionenchromatogramme. Wenn Peaks innerhalb des Retentionszeitfenster von Tacrolimus festgestellt werden, zu integrieren und vergleichen Sie die Flächen unter der Kurve mit denen von Tacrolimus Spitzen im Leerproben gespickt mit Tacrolimus im LLOQ. Die Fläche der Peaks in den Leerproben sollen nicht 15% der von Tacrolimus im LLOQ überschreiten. </li></ol></li><li> Extraction Erholungen. <ol><li> Bestimmen Sie, Rückforderungen durch Vergleich der Signale der Analyten nach der Extraktion des QC samsätze an allen vier Konzentrationsstufen (n = 6 pro Konzentration) mit denen der leere getrocknete Blutflecken versetzt mit der entsprechenden Beträge von Tacrolimus nach der Extraktion. </li><li> Vorbereitung vier Sätze von QC (Konzentration: 2, 4, 20, 40 ng / ml). </li><li> Bereiten Sie weitere 4 Sätze von entsprechenden &quot;Rückgewinnung Testproben&quot; durch Spotting 50 ul blank EDTA-Vollblut auf die Filterpapierkarten und Trocknen 2 h. </li><li> Im Folgenden wird sowohl für die QC und blank &quot;Recovery-Testproben&quot;, schneiden Sie die gesamte Blutfleck auf der Filterkarte mit einer Schere und legen Sie die resultierenden Scheiben in eine Polypropylen-Röhrchen mit konischem Boden und Schnappdeckel. </li><li> Extrahieren Sie alle Proben. </li><li> Die Überstände (400 &amp; mgr; l) in Glas HPLC-Ampullen. </li><li> In Tacrolimus-Stammlösung zu den blank &quot;extrahiert Recovery-Testproben&quot;, um Konzentrationen von 2, 4, 20 und 40 ng / ml (4 &amp; mgr; l von 200, 400, 2.000, 4.000 ng / ml Tacrolimus stock Sol erreichenutions bis 400 &amp; mgr; l Überstand). </li><li> Nach dem LC-MS / MS-Analyse, zu vergleichen, die Signale in beide QC Proben und &quot;Recovery Testproben&quot; der entsprechenden Konzentration (Rückgewinnung% = Signalproben versetzt vor der Extraktion / Signalproben versetzt nach der Extraktion x 100). </li></ol></li><li> Dilution Integrität. <ol><li> Herzustellen Verdünnungs Integrität mit dotierten Proben mit den Analyten bei 500, 250 und 100 ng / ml. </li><li> Nach der Extraktion, verdünnte Proben unter Verwendung von Protein-Fällungslösung (1.10, n = 3 pro Konzentrationsstufe). </li><li> Berechnen Sie Abweichungen von den Nennkonzentrationen. Betrachten Sie Ergebnisse, die innerhalb von 85% -115% der Nenn akzeptabel fallen. </li></ol></li><li> Stabilitäten. <ol><li> Untersuchen Stabilitäten Verwendung der QC-Proben an allen vier Konzentrationsstufen (n = 4 pro Konzentration) analysiert zu verschiedenen Zeitpunkten und unter unterschiedlichen Lagerbedingungen. </li><li> Ergebnisse nach Lagerung mit den Sollwerten zu vergleichen. Betrachten rrgebnisse, die innerhalb 85% -115% der Nenn akzeptabel fallen. </li><li> Stellen Sie die Probenstabilität für 1 Woche bei Raumtemperatur, 1 Woche bei 4 ° C, 1 Monat bei -20 ° C und 1 Monat bei -80 ° C. </li><li> Test Gefrier-Tau-Stabilität über drei Zyklen (-20 ° C). Test extrahierten Probe und Autosampler-Stabilität, indem Proben in den thermostatisierten Autosampler auf 4 ° C eingestellt. Injizieren Proben nach 72 h. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Obwohl, wie oben erwähnt, ist das Konzept der therapeutischen Arzneimittel und Einhaltung Überwachung der Tacrolimus auf Basis von Trockenblut attraktiv, es gibt analytische Herausforderungen, die über die in der Regel mit der LC-MS / MS-Analyse von Tacrolimus im venösen EDTA-Vollblut-Proben verbunden zu gehen. Diese schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf die Tatsache, dass die Matrix Kappilarblut in die Baumwolllinters Material des hier verwendeten Filterkarte Materials und der geringen Blutvolumen (20 ul)...

Tacrolimus ist ein potenter immonosuppressant 1-7 die Makrolidstruktur 8 (Figur 1) besitzt. Aufgrund cis - trans-Isomerie der CN Bindungen sie zwei Rotameren in Lösung 9, die durch Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie getrennt werden können bildet (HPLC) Tacrolimus ist lipophil und löslich in Alkoholen (Methanol: 653 g / l, Ethanol: 355 g / L), halogenierte Kohlenwasserstoffe (Chloroform: 573 g / L) und Äther. Es ist in aliphatischen Kohlenwasserstoffen (Hexan kaum löslich: 0,1 g / l und Wasser (pH 3. 0,0047 g / l) 9 Das Molekül keinerlei Chromophor, und das UV-Absorptionsmaximum nicht enthalten, ist 192 nm Tacrolimus über eine Hemmung der Calcineurin wirkt. . Sein Wirkungsmechanismus ist in den Referenzen 10,11 prüft worden. Es ist derzeit in mehr als 80% der Festorgantransplantationspatienten in den Vereinigten Staaten 12 verwendet. Der therapeutische Index von Tacrolimus ist stattd schmalen 13 zu sein. Darüber hinaus ist die Korrelation zwischen Tacrolimus-Dosen und Konzentrationen im Blut arm und Pharmakokinetik ist variabel 14,15. Therapeutische Medikamentenüberwachung auf Tacrolimus Dosierung bei Transplantationspatienten zu führen ist daher allgemeine klinische Praxis 16-20. Das Ziel ist, die Tacrolimus-Blutkonzentrationen innerhalb einer vorgegebenen therapeutischen Bereich zu halten. Tacrolimus-Blutspiegel unter dem therapeutischen Bereich kann in einer erhöhten Aktivität der chronischen oder akuten Allo-Immunreaktionen führen, während die oberhalb des therapeutischen Fensters erhöhen das Risiko für Über Immunsuppression, Krebs und Toxizitäten, wie Nierentoxizität, Neurotoxizität, Bluthochdruck und Diabetes. Hohe pharmakokinetischen intraindividuellen Schwankungen von Tacrolimus kann sich nachteilig auf beiden Transplantationsorgan und das Überleben der Patienten 21,22 sein. Während interindividuelle Variabilität der Pharmakokinetik von Tacrolimus wird hauptsächlich durch CYP3A5-Polymorphismen, Gründe für intraindividuelle verursachtVariabilität beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, Arzneimitteln, krankheits Drogen-und Lebensmittel Wechselwirkungen 14,15 begrenzt. Auch fehlt der Einhaltung der immunsuppressiven Therapie Drogen-Regime ist ein Faktor und ein Hauptgrund für Transplantatverlust 23,24. Diese Überlegungen zeigen, dass häufige Hause therapeutischen Drug-Monitoring und die Einhaltung von Tacrolimus-Vollblutkonzentration kann vorteilhaft sein, um sicherzustellen, dass Patienten Tacrolimus Exposition innerhalb des gewünschten therapeutischen Fenster zu allen Zeiten. Allerdings, die Logistik und die Kosten der häufigeren therapeutischen Drug-Monitoring, wie es der gängigen klinischen Praxis 15 ist unerschwinglich. Einer der Gründe ist, dass der Patient zu sehen, ein phlebotomist, um die erforderliche venöse Blutprobe gezogen haben. Getrocknetes Blut wurden vor kurzem als attraktives Konzept 25-28 entstanden. Nach einer einfachen Finger-Stick, den Patienten sammelt einen Blutstropfen auf einem speziellen Filterpapierkarte und nach der Blutfleck ist dRied, kann es zu einem zentralen Labor zur Analyse von Tacrolimus und einer anderen Immunsuppressivum, dass der Patient möglicherweise gerade unter zugesandt. Dies hat sich auf die Entwicklung von hochempfindlichen und spezifischen LC-MS / MS-Assays zur Quantifizierung von Tacrolimus und anderen Immunsuppressiva in sehr kleinen Blutvolumina, wie beispielsweise Trockenblut (typischerweise 20 &amp; mgr; l Blut) 25,29-43 möglich. Ein weiterer Vorteil ist, dass minimal-invasive, geringes Volumen Probennahme-Strategien wie Trockenblut therapeutischen Drug-Monitoring und pharmakokinetischen Untersuchungen bei Kleinkindern 28 erheblich erleichtern. Tacrolimus wird in der Regel in venösen EDTA-Vollblut 15 gemessen. Gründe sind, dass Tacrolimus weitgehend verteilt in Blutzellen und klinische Studien haben eine bessere Korrelation zwischen Tacrolimus Talspiegel im Blut als im Plasma mit klinischen Ereignissen 15,18 ausgewiesen. Zum Vergleich: Die Analyse tacrolimus in getrockneten Blutflecken auf Kapillarblut, die mit der Filterpapiermatrix eingemischt basiert. Dies stellt Herausforderungen in Bezug auf die Solubilisierung von Tacrolimus und mögliche Interferenzen mit der LC-MS / MS-Analyse. Hier präsentieren wir einen etablierten und validierten Assay basierend auf Homogenisierung der getrocknete Blut vor Ort mittels einer Kugel Mixer in Kombination mit einem High-Flow-Online Spalte Probenvorbereitungsverfahren und LC-MS / MS-Analyse. Bis heute hat dieser Test erfolgreich zur Quantifizierung von mehr als fünftausend Tacrolimus Trockenblut-Proben für die Einhaltung Überwachung in klinischen Studien eingesetzt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reference Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tacrolimus</td>
			<td>U.S. Pharmacopeial Convention</td>
			<td>1642802</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2,13C-Tacrolimus</td>
			<td>Toronto Research Chemicals Inc.</td>
			<td>F370002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cells</td>
			<td>University of Colorado Hospital</td>
			<td>W20091305500 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma</td>
			<td>University of Colorado Hospital</td>
			<td>W2017130556300Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvents</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone CHROMASOLV, HPLC, &#8805; 99,9 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>439126-4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile Optima LC/ MS, UHPLC- UV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol 99.9 %, HPLC</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2632-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol Optima LC/ MS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Optima LC/ MS, UHPLC- UV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A118P-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Z68-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Instruments and Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 &#8211; 10 &#181;l pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008649</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,5 mL- Eppendorf tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-682-550</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#8211; 100 &#181;L pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008651</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L- pipet tips with filter, sterile</td>
			<td>Neptune</td>
			<td>BT 10XLS3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#8211; 1000 &#181;l pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008653</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L- pipet tips with filter, sterile</td>
			<td>Neptune</td>
			<td>BT 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L- pipet tips with filter, sterile</td>
			<td>Multimax</td>
			<td>2940</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 &#8211; 20 &#181;L pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008650</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL- Eppendorf tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-258</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#8211; 200 &#181;L pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008652</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L- pipet tips with filter, sterile</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>P-1237-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L- pipet tips with filter</td>
			<td>Multimax</td>
			<td>2938T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L- pipet tips with filter, sterile</td>
			<td>Multimax</td>
			<td>2936J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL- Falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#956;L inserts for&#160; HPLC vials</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>ARO-9973-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance PR2002</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>1117050723</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balances AX205 Delta Range</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>1119343379</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender Homogenizer</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBX24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Biofuge Fresco</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>290395</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Wipes</td>
			<td>PDI</td>
			<td>Q55172</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass v ials, 4 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-334</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials, 20 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B7800-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves, nitrile</td>
			<td>Titan Brand Gloves</td>
			<td>44-100S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC vials, 9 mm, 2 mL, clear</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>ARO- 9921-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lids for HPLC vials</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>ARO- 8952-13-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 18G 1.5</td>
			<td>Precision Glide</td>
			<td>305196</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack for Eppendorf tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack for HPLC Vials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-541-29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel beads 0.9 &#8211; 2 mm</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB14B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage boxes for freezers / refrigerators</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>03-395-464</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard multi-tube vortexer</td>
			<td>VWR Scientific Products</td>
			<td>658816-115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PK</td>
			<td>GE Whatman&#160;</td>
			<td>2016-05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Equipment and Columns</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler</td>
			<td>CTC PAL&#160;</td>
			<td>PAL.HTCABIx1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binary pump, Agilent 1260 Infinity</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 G1312B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binary pump, Agilent 1290 Infinity</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1290 G4220A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro vacuum degasser, Agilent 1260</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 G13798</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column oven,&#160; Agilent 1290 with 2 position&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1290 G1216C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostated column compartment with integrated 6 port switching valve</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1290 G1316C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC pre-column cartridge, Zorbax XDB C8 (5 &#181;m particle size), 4.6 &#183; 12.5 mm</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>820950-926</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC analytical column, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 &#181;m particle size), 4.6 &#183; 150 mm</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>993967-906</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tandem Mass Spectrometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>API5000 MS/MS with TurboIonspray source</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>4364257</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometry software</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>Analyst 1.5.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of the immunosuppressant tacrolimus on dried blood spots using lc-ms/ms

Die Calcineurin-Inhibitor Tacrolimus ist der Eckpfeiler der meisten immunsuppressiven Behandlungsprotokolle nach Organtransplantation in den Vereinigten Staaten. Tacrolimus ist eine geringe therapeutische Droge und als solche erfordert therapeutischen Drug-Monitoring und Dosisanpassung basierend auf seiner Vollblut-Talspiegel. Nach Hause zu therapeutischen Drug-Monitoring und die Einhaltung zu erleichtern, ist die Sammlung von getrockneten Blutflecken ein attraktives Konzept. Nach einer Finger-Stick, sammelt der Patient einen Bluttropfen auf Filterpapier zu Hause. Nachdem das Blut getrocknet ist, es an die analytischen Labor, in dem Tacrolimus wird mit Hochleistungs-Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie quantifiziert geschickt wird (HPLC-MS / MS) in Kombination mit einem einfachen Handproteinfällung Schritt und Online-Spaltenextraktion. Für Tacrolimus Analyse wird eine 6-mm-Scheibe aus dem gesättigten Zentrum der Blutfleck ausgestanzt. Der Blutfleck wird mit einer Kugel ein Mixer homogenisiertnd dann Proteine ​​werden mit Methanol / 0,2 M ZnSO 4, die den internen Standard D 2, 13 C-Tacrolimus fällt. Nach dem Vortexen und Zentrifugieren wird 100 ul Überstand in ein Online-Extraktionskolonne injiziert und mit 5 ml / min von 0,1 Ameisensäure / Acetonitril gewaschen (7: 3, v: v) für 1 min. Danach wird das Schaltventil aktiviert, und die Analyten rückgespült auf die analytische Säule (und getrennt unter Verwendung einer 0,1% Ameisensäure / Acetonitril-Gradient). Tacrolimus wird in der positiven Mehrreaktionsmodus (MRM) mit einem Tandem-Massenspektrometer quantifiziert. Der Test ist linear von 1 bis 50 ng / ml. Inter-Assay-Varianz (3,6% -6,1%) und Genauigkeit (91,7% -101,6%) als in 20 Tagen beurteilt treffen Akzeptanzkriterien. Durchschnittliche Extraktion Erholung ist 95,5%. Es gibt keine relevante Übertrag, Matrix-Interferenzen und Matrixeffekte. Tacrolimus ist in getrockneten Blutflecken bei RT und bei +4 ° C für 1 Woche stabil. Extrahierten Proben in derProbengeber sind bei +4 ° C für mindestens 72 Stunden stabil.

Vertreter Ionenchromatogramme einer Blindprobe, versetzt eine Probe, an der unteren Grenze der Quantifizierung und eine Patientenprobe werden in Abbildung 3 dargestellt. Kalibrierungskurven Die untere Detektionsgrenze lag bei 0,5 ng / ml, und die Untergrenze der Quantifizierung, betrug 1,0 ng / ml. Fünfzig ng / ml wurde als die höchste Kalibrator gewählt, da höhere Konzentrationen sind unwahrscheinlich, dass in der Klinik unter normalen Umst?...

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Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.

Die Quantifizierung des Immunsuppressivums Tacrolimus auf Getrocknetes Blut mittels LC-MS / MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

quantification-immunosuppressant-tacrolimus-on-dried-blood-spots

Research

JoVE Journal

Medicine

16.7K Aufrufe.  University of Colorado, Anschutz Medical Campus. Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.

Serie: Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

A Contusive Model of Unilateral Cervical Spinal Cord Injury Using the Infinite Horizon Impactor

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of spinal cord injury (SCI) in which the thoracic spinal cord is injured. Additionally, because most human cord injuries occur as the result of blunt, non-penetrating trauma (e.g. motor vehicle accident, sporting injury) where the spinal cord is violently struck by displaced bone or soft tissues, the majority of SCI researchers are of the opinion that the most clinically relevant injury models are those in which the spinal cord is rapidly contused.1 Therefore, an important step in the preclinical evaluation of novel treatments on their way to human translation is an assessment of their efficacy in a model of contusion SCI within the cervical spinal cord. Here, we describe the technical aspects and resultant anatomical and behavioral outcomes of an unilateral contusive model of cervical SCI that employs the Infinite Horizon spinal cord injury impactor.
Sprague Dawley rats underwent a left-sided unilateral laminectomy at C5. To optimize the reproducibility of the biomechanical, functional, and histological outcomes of the injury model, we contused the spinal cords using an impact force of 150 kdyn, an impact trajectory of 22.5&deg; (animals rotated at 22.5&deg;), and an impact location off of midline of 1.4 mm. Functional recovery was assessed using the cylinder rearing test, horizontal ladder test, grooming test and modified Montoya's staircase test for up to 6 weeks, after which the spinal cords were evaluated histologically for white and grey matter sparing.
The injury model presented here imparts consistent and reproducible biomechanical forces to the spinal cord, an important feature of any experimental SCI model. This results in discrete histological damage to the lateral half of the spinal cord which is largely contained to the ipsilateral side of injury. The injury is well tolerated by the animals, but does result in functional deficits of the forelimb that are significant and sustained in the weeks following injury. The cervical unilateral injury model presented here may be a resource to researchers who wish to evaluate potentially promising therapies prior to human translation.

A reliable and repeatable way to produce a cervical unilateral spinal cord injury using the Infinite Horizon impactor is described. The method takes advantage of a custom designed frame and clamp to stabilize the spine. The standardized procedure and biomechanical injury parameters result in sufficient and sustained injuries.

Ein Modell von gequetscht Einseitige Cervical Spinal Cord Injury Mit dem Infinite Horizon Impactor

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of ...

Forschung

Medizin

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Progress in prostate cancer research is severely limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems, which limit our ability to understand genetic and molecular events underlying prostate disease initiation. Toward developing better model systems for studying human prostate carcinogenesis, we and others have taken advantage of the unique pro-prostatic inductive potential of embryonic rodent prostate stroma, termed urogenital sinus mesenchyme (UGSM). When recombined with certain pluripotent cell populations such as embryonic stem cells, UGSM induces the formation of normal human prostate epithelia in a testosterone-dependent manner. Such a human model system can be used to investigate and experimentally test the ability of candidate prostate cancer susceptibility genes at an accelerated pace compared to typical rodent transgenic studies. Since Human embryonic stem cells (hESCs) can be genetically modified in culture using inducible gene expression or siRNA knock-down vectors prior to tissue recombination, such a model facilitates testing the functional consequences of genes, or combinations of genes, which are thought to promote or prevent carcinogenesis.
The technique of isolating pure populations of UGSM cells, however, is challenging and learning often requires someone with previous expertise to personally teach. Moreover, inoculation of cell mixtures under the renal capsule of an immunocompromised host can be technically challenging. Here we outline and illustrate proper isolation of UGSM from rodent embryos and renal capsule implantation of tissue mixtures to form human prostate epithelium. Such an approach, at its current stage, requires in vivo xenografting of embryonic stem cells; future applications could potentially include in vitro gland formation or the use of induced pluripotent stem cell populations (iPSCs).

To unravel the earliest molecular mechanisms underlying prostate cancer initiation, novel and innovative human model systems and approaches are desperately needed. The potential of pre-prostatic urogenital sinus mesenchyme (UGSM) to induce pluripotent stem cell populations to form human prostate epithelium is a powerful experimental tool in prostate research.

Formation of Human Prostate Epithel Mit Tissue Rekombination von Nagetier Urogenitalsinus Mesenchym und menschlichen Stammzellen

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Dried Blood Spot Collection of Health Biomarkers to Maximize Participation in Population Studies

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spots meet this need, and can be collected in the field with high response rates. These elements are particularly important in longitudinal study designs including interventions where attrition is critical to avoid, and high response rates improve the interpretation of results. Dried Blood Spot sample collection is simple, quick, relatively painless, less invasive then venipuncture, and requires minimal field storage requirements (i.e.&#160;samples do not need to be immediately frozen and can be stored for a long period of time in a stable freezer environment before assay). The samples can be analyzed for a variety of different analytes, including cholesterol, C-reactive protein, glycosylated hemoglobin, numerous cytokines, and other analytes, as well as provide genetic material. DBS collection is depicted as employed in several recent studies.

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease or health. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spot (DBS) collection meets this need, can be collected in the field with high response rates&#160;and analyzed for a variety of biomarkers.

Trockenblut Sammlung von Gesundheits-Biomarker zur Teilnahme am Bevölkerungsstudien maximieren

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, ...

Absolute Quantification of A&#946;1-42 in CSF Using a Mass Spectrometric Reference Measurement Procedure

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the diagnosis of AD is based on cognitive tests and mental state exams, but the peptide amyloid-beta (A&#946;) in cerebrospinal fluid (CSF) is increasingly used in clinical trials and settings. As for most protein and peptide biomarkers, quantification is performed using antibody-based techniques, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). However, intra- and inter-laboratory variability in these assays hamper its use as a diagnostic marker in clinical routine.
An antibody-independent Reference Measurement Procedure (RMP) was developed based on solid-phase extraction (SPE) and liquid chromatography (LC)-tandem mass spectrometry (MS/MS), where stable, isotope-labeled A&#946; peptides were used as internal standards, enabling absolute quantification. A high-resolution quadrupole-orbitrap hybrid instrument was used for the measurements. The method allows for the quantification of CSF A&#946;1-42 between 150-4,000 pg/mL.

Absolute Quantification of A&amp;#946;&lt;sub&gt;1-42&lt;/sub&gt; in CSF Using a Mass Spectrometric Reference Measurement Procedure

A reference measurement procedure for the absolute quantification of A&#946;1-42 in human CSF based on solid-phase extraction and liquid chromatography tandem mass spectrometry is described.

Absolute Quantifizierung von Aß<sub&gt; 1-42</sub&gt; In CSF eine massenspektrometrische Referenzmessverfahren verwenden

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening pulmonary manifestations. Ivacaftor (IVA) and ivacaftor-lumacaftor (LUMA) combination are two new breakthrough CF drugs that directly modulate the activity and trafficking of the defective CFTR-protein. However, there is still a dearth of understanding on pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters and the pharmacology of ivacaftor and lumacaftor. The HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of the concentrations of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological fluids in patients receiving standard ivacaftor or ivacaftor-lumacaftor combination therapy has previously been developed by our group and partially validated to FDA standards. However, to allow the high-throughput analysis of a larger number of patient samples, our group has optimized the reported method through the use of a smaller pore size reverse-phase chromatography column (2.6 &#181;m, C8 100 &#197;; 50 x 2.1 mm) and a gradient solvent system (0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: held at 70% B; 2.7-2.8 min: 70-90% B; 2.8-4.0 min: 90% B washing; 4.0-4.1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: held at 40% B) instead of an isocratic elution. The goal of this study was to reduce the HPLC-MS analysis time per sample dramatically from ~15 min to only 6 min per sample, which is essential for the analysis of a large amount of patient samples. This expedient method will be of considerable utility for studies into the exposure-response relationships of these breakthrough CF drugs.

Ivacaftor and ivacaftor-lumacaftor combination are two new CF drugs. However, there is still a dearth of understanding on their PK/PD and pharmacology. We present an optimized HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of ivacaftor and its major metabolites, and lumacaftor.

Optimierte LC-MS/MS-Methode für die Hochdurchsatz-Analyse der klinischen Proben von Ivacaftor, seinen Hauptmetaboliten und Lumacaftor in biologischen Flüssigkeiten von Mukoviszidose-Patienten

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

A Chronic Cardiac Ischemia Model in Swine Using an Ameroid Constrictor

Cardiovascular disease remains the number one cause of mortality in the United States. There are numerous approaches to treating these diseases, but regardless of the approach, an in vivo model is needed to test each treatment. The pig is one of the most used large animal models for cardiovascular disease. Its heart is very similar in anatomy and function to that of a human. The ameroid placement technique creates an ischemic area of the heart, which has many useful applications in studying myocardial infarction. This model has been used for surgical research, pharmaceutical studies, imaging techniques, and cell therapies.
There are several ways of inducing an ischemic area in the heart. Each has its advantages and disadvantages, but the placement of an ameroid constrictor remains the most widely used technique. The main advantages to using the ameroid are its prevalence in existing research, its availability in various sizes to accommodate the anatomy and size of the vessel to be constricted, the surgery is a relatively simple procedure, and the post-operative monitoring is minimal, since there are no external devices to maintain. This paper provides a detailed overview of the proper technique for the placement of the ameroid constrictor.

The purpose of this protocol is to demonstrate the placement of a delayed constricting device (an ameroid constrictor) around a coronary artery in a swine model. This device creates an ischemic area of the heart that is useful for studying new diagnostic imaging techniques and new methods of treatment.

Ein chronischer kardialer Ischämie-Modell bei Schweinen, die mit einem Ameroid Constrictor

Cardiovascular disease remains the number one cause of mortality in the United States. There are numerous approaches to treating these diseases, but ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

Verbesserte Methode für die Einrichtung einer In-vitro- Blut - Hirn-Schranke Modell auf porcinen Endothelzellen Gehirnzellen basiert

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained using laser Doppler flowmetry (LDF). This paper demonstrates a closed skull preparation that allows cerebral blood flow to be assessed without penetrating the skull or installing a chamber or cerebral window. To evaluate autoregulatory mechanisms, a model of controlled blood pressure reduction via graded hemorrhage can be utilized while simultaneously employing LDF. This enables the real time tracking of the relative changes in the blood flow in response to reductions in arterial blood pressure produced by the withdrawal of circulating blood volume. This paradigm is a valuable approach to study cerebral blood flow autoregulation during reductions in arterial blood pressure and, with minor modifications in the protocol, is also valuable as an experimental model of hemorrhagic shock. In addition to evaluating autoregulatory responses, LDF can be used to monitor the cortical blood flow when investigating metabolic, myogenic, endothelial, humoral, or neural mechanisms that regulate cerebral blood flow and the impact of various experimental interventions and pathological conditions on cerebral blood flow.

This article demonstrates the use of laser Doppler flowmetry to evaluate the ability of the cerebral circulation to autoregulate its blood flow during reductions in arterial blood pressure.

Auswertung der zerebralen Blutfluss-Autoregulation in der Ratte mit Laser-Doppler-Flowmetrie

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...

Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. Plasma drug levels are the current gold standard assessment, but require phlebotomy and a cold chain, and capture only very recent adherence. Our method uses hair, a matrix that is easily collected and reflective of long-term adherence, to test for 11 anti-TB medications. Previous work by our group shows that antiretroviral drug levels in hair are associated with HIV outcomes. Our method for DR-TB drugs uses 2 mg of hair (3 cm proximal to the root), which is pulverized and extracted in methanol. Samples are analyzed with a single LC-MS/MS method, quantifying 11 drugs in a 16 min run. Lower limits of quantification (LLOQs) for the 11 drugs range from 0.01 ng/mg to 1 ng/mg. Drug presence is confirmed by comparing ratios of two mass spectrometry transitions. Samples are quantified using the area ratio of the drug to the deuterated, 15N-, or 13C-labeled drug isotopologue. We used a calibration curve ranging from 0.001-100 ng/mg. Application of the method to a convenience sample of hair samples collected from DR-TB patients on directly observed therapy (DOT) indicated drug levels in hair within the linear dynamic range of nine of the eleven drugs (isoniazid, pyrazinamide, ethambutol, linezolid, levofloxacin, moxifloxacin, clofazimine, bedaquiline, pretomanid). No patient was on prothionamide, and the measured levels for ethionamide were close to its LLOQ (with further work instead examining the suitability of ethionamide&#8217;s metabolite for monitoring exposure). In summary, we describe the development of a multi-analyte panel for DR-TB drugs in hair as a technique for therapeutic drug monitoring during drug-resistant TB treatment.

Current methods of analyzing patients&#8217; adherence to complex drug resistant-tuberculosis (DR-TB) regimens can be inaccurate and resource-intensive. Our method analyzes hair, an easily collected and stored matrix, for concentrations of 11 DR-TB medications. Using LC-MS/MS, we can determine sub-nanogram drug levels that can be utilized to better understand drug adherence.

Validiertes LC-MS/MS Panel zur Quantifizierung von 11 medikamentenresistenten TB-Medikamenten in kleinen Haarproben

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. ...

Human Fetal Blood Flow Quantification with Magnetic Resonance Imaging and Motion Compensation

Magnetic resonance imaging (MRI) is an important tool for the clinical assessment of cardiovascular morphology and heart function. It is also the recognized standard-of-care for blood flow quantification based on phase contrast MRI. While such measurement of blood flow has been possible in adults for decades, methods to extend this capability to fetal blood flow have only recently been developed.
Fetal blood flow quantification in major vessels is important for monitoring fetal pathologies such as congenital heart disease (CHD) and fetal growth restriction (FGR). CHD causes alterations in the cardiac structure and vasculature that change the course of blood in the fetus. In FGR, the path of blood flow is altered through the dilation of shunts such that the oxygenated blood supply to the brain is increased. Blood flow quantification enables assessment of the severity of the fetal pathology, which in turn allows for suitable&#160;in utero&#160;patient management and planning for postnatal care.
The primary challenges of applying phase contrast MRI to the human fetus include small blood vessel size, high fetal heart rate, potential MRI data corruption due to maternal respiration, unpredictable fetal movements, and lack of conventional cardiac gating methods to synchronize data acquisition. Here, we describe recent technical developments from our lab that have enabled the quantification of fetal blood flow using phase contrast MRI, including advances in accelerated imaging, motion compensation, and cardiac gating.

Here we present a protocol for measuring fetal blood flow rapidly with MRI and retrospectively performing motion correction and cardiac gating.