Wir danken Paul O'Brien, Marizel Mina und Isabella Freedman für Tierversuche, Jacquie Gonzalez und Danielle Weiner von NIH/NIAID für Hilfe mit Gammastrahlung von Kaninchen Gewebe vor dem Laser Capture Microdissection und Jansy Sarathy für Manuskript Gedanken und Ratschläge. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Mittel aus der Bill und Melinda Gates Foundation (OPP1174780) und NIH geteilt Instrumentierung gewähren 1S10OD018072. Wir danken Eliseo A. Eugenin für den Zugang zu den Leica LMD 6500 Mikroskop und Austausch von Wissen und Beratung. Der Kauf und die laufende Unterstützung, der LMD-6500 wurde finanziert durch das National Institute of Mental Health Grant, MH096625, National Institute of Neurological Disorders und Schlaganfall, NS105584, PHRI Mittel (für E.A.E) und GSK Beiträge (zur E.A.E).

Alle Tierversuche erfolgten gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health mit Genehmigung aus dem institutionellen Animal Care und Use Committee der NIAID (NIH), Bethesda, MD.
(1) Tierversuche und Gewebe-Sammlung
Dieser Abschnitt des Protokolls beschreibt Tier Verfahren und Probenentnahme Biosafety Level 3 (BSL3) Bedingungen. Ausführliche Protokolle der Mycobacterium Tuberculosis Aerosol Infektion Verfahren and Drug Administration, die Protokolle bei Kaninchen wurden beschriebenen zuvor11,12.
<ol><li>New Zealand White Kaninchen (männlich und weiblich, ca. 4-5 Monate alt) mit M. Tuberculosis HN878 infizieren mit einem nur-Nase-Aerosol-System, wie oben beschrieben11.</li>
	<li>Verwalten Sie die gewählten Medikamente (Ethambutol im hier vorgestellten Beispiel) über die bevorzugte Route und einschläfern Sie die Tiere auf 2, 6 und 24 h nach Verabreichung. Erstens zu betäuben die Kaninchen durch intramuskuläre Injektion von Ketamin bei 35 mg/kg und Xylazin bei 5 mg/kg. Für zehn Minuten warten Sie, und bestätigen Sie richtige Anesthetization durch Kneifen die Rute und das Auge berühren. Wenn es keine Reaktion, einschläfern Sie durch intravenöse Gabe von Pentobarbital und Phenytoin (siehe Tabelle of Materials) in 1 mL/4,5 kg in 2 mL steriler Kochsalzlösung. Hinweis: Diese Zeitpunkte sind optimal um das pharmakokinetische Profil Ethambutol abzudecken und Anpassung/Optimierung für andere Studie Medikamente erfordern.</li>
	<li>Mit Pinzette, Schere und/oder Skalpell, entfernen Sie die Lungen aus der Brusthöhle, resezieren Sie Lunge Biopsien mit großen nekrotische Granulome in umliegenden unbeteiligte Lungengewebe (wie zuvor beschrieben3) eingebettet. Nekrotische Granulome erscheinen in Beige Farbe und in der Regel ragen leicht aus der umliegenden rot/Rosé-farbene Lunge. Um einfache Kryoschneiden zu erleichtern, damit Biopsien sind nicht größer als 2 x 1,5 x 1,5 cm.</li>
	<li>Mit Pinzette, Ort der Biopsie auf ein bereits beschriftete Cryomold Tablett mit den gewünschten Schnittfläche in direktem Kontakt mit der Basis des Fachs. Nach dem Einfrieren, wird dies eine flache Oberfläche bieten, aus der Cryosections geschnitten werden.</li>
	<li>Fixieren Sie die Biopsie in flüssigem Stickstoff Dampf. Füllen Sie einen Styropor-Behälter bis zu einer Tiefe von 2 Zoll mit flüssigem Stickstoff und einem Metalldraht Rohr Gestell. Das Rack sollte ragen über der Oberfläche des flüssigen Stickstoffes, die Bereitstellung einer flachen Oberfläche, auf der die Gewebe-Trays platziert werden. Setzen Sie den Deckel wieder auf die Styropor-Behälter und lassen Sie Gewebe für 10 Minuten vollständig einfrieren.</li>
	<li>Entfernen Sie die Gewebe-Fächer, wickeln Sie schnell in Aluminiumfolie ein und in individuell beschriftet, wiederverschließbaren Plastiktüten und Dichtung. Übertragen Sie auf-80 ° C Gefrierschrank für die Lagerung. Hinweis: Schritte 1.1-1.6 sind in BSL3-Bedingungen (einschließlich alle tierische Arbeit und Umgang mit infizierten Organen und Geweben) durchgeführt. Gamma bestrahlen die Lunge Biopsien bei 3 Megarads Handhabung außerhalb BSL3 Containment zu ermöglichen. Laser Capture Microdissection auf sterilisierte Gewebe kann durchgeführt werden, innerhalb der BLS3 Anlage wenn Sicherheitsprotokolle zugelassen sind vorhanden. Allerdings beschreibt der Rest dieses Protokolls Weiterverarbeitung in einem BSL-2-Anlage.</li>
</ol>(2) Gewebe schneiden
<ol><li>Die gewünschte Arbeitstemperatur des Kryostaten gesetzt. Die Gamma-Bestrahlung Lungenbiopsie von-80 ° C Lagerung auf den Kryostaten übertragen und für 30 Minuten bis die Gewebetemperatur equilibrate lassen. Hinweis:-20 bis-22 ° C ist optimal für TB Läsion Biopsien.</li>
	<li>Mit einer Pinzette, beheben Sie die Biopsie an der Kryostat-Futter mit einem kleinen Betrag der optimale Temperatur Klebstoff (OCT) auf um die Basis des Gewebes an das Futter zu halten. Das Gewebe zu orientieren, so dass die flache Oberfläche (das war in Kontakt mit der Basis der Cryomold) die freiliegende Oberfläche zum Schneiden ist. Gewährleisten Sie, dass das Office-Anpassungstool die Gewebeoberfläche nicht verschmutzt, da dies die anschließende Massenspektrometrie Analyse beeinträchtigen.</li>
	<li>Schneiden Sie drei Gewebeschnitte bei 25 µm Dicke und montieren Sie auf PET-Membran-Folien. Sanft berühren Sie die Membran zum Abschnitt Gewebe und entfernen. Wenn zu viel Druck ausgeübt wird, kann die dünne Membran reißen.<ol>
<li>Vermeiden Sie übermäßige Handhabung der Dias vor der Montage, da dies in der PET-Membran immer aufgeladen und schlechte Adhäsion von der Gewebeschnitte zur Folge. Sicherstellen Sie, dass die Membran Folie ist bei Raumtemperatur Tauwetter-Montage und erfolgreiche Verklebung des Gewebes an der Membran zu ermöglichen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie die Folie aus der Kryostat und 3 Minuten an der Luft trocknen lassen. LCM-LC/MS/MS nicht sofort durchgeführt werden, verschließen Sie die Folie in einem luftdicht verschließbaren Beutel und Transfer zum-80 ° C Lagerung bis zur Präparation erforderlich.</li>
	<li>Schneiden Sie einen angrenzenden Abschnitt 10-12 µm und Tauwetter-Mount auf einem standard Objektträger für Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung und Referenz. Weitere Querschnitte können in dieser Zeit für andere gewünschte Histochemie Flecken (z. B. Ziehl-Niellsen zur Visualisierung von Mycobacterium Tuberculosis (MTB)).</li>
</ol>(3) Mikrodissektion
<ol><li>Versiegelten Beutel mit der Folie von-80 ° C Lagerung und um Raumtemperatur für 5 Minuten zu erreichen. Hinweis: Wenn die kalte Folie sofort die Labor-Atmosphäre ausgesetzt ist, wird das Gewebe mit Kondensation beschichtet werden, und die räumliche Integrität des Arzneimittels beeinträchtigt werden.</li>
	<li>Schalten Sie das Mikroskop und Laser (Laser benötigt ca. 5-10 Minuten warm up, bevor schneiden begonnen werden kann). Flat-Cap 0,20 mL PCR-Röhrchen in den Halter zu laden.</li>
	<li>Objektträger aus dem Beutel nehmen und nehmen ein optisches Bild des Abschnitts Gewebe auf der PET-Folie mit einem Flachbettscanner.</li>
	<li>Legen Sie die Folie in den Diahalter (Gewebeseite nach unten) und bestimmte Granulom Regionen von Interesse, die mit dem Mikroskop Software weisen Sie separate primärgefäßen zu. In der Regel werden diese "unbeteiligte Lunge", "zelluläre Granulom," und "Caseum" (nekrotische Mitte), kann aber variieren je nach der spezifischen Pathologie der Granulom/Biopsie.</li>
	<li>Konzentrieren Sie sich auf das Gewebe mit den 5 X Mikroskopobjektiv. Diese Vergrößerung sollte einen guten Überblick über das Gewebe mit beiden zellulären und nekrotischen Granulom Bereichen bieten. Wählen Sie in der Software das Rohr bezeichnet "Caseum" in Position unter dem Gewebe verschieben.</li>
	<li>Geben Sie die gewünschte Dissektion-Parameter. Typische Einstellungen für eine 25 µm dicken Lunge Abschnitt sind Laserleistung 30, 15, und Blende 35 (willkürliche Einheiten). Jedoch werden diese unterscheiden sich je nach Mikroskop verwendet und Potenzial rückläufiger macht aufgrund des Alters des Lasers.</li>
	<li>Wählen Sie das Werkzeug "frei-ziehen" und mit Maus oder Touchscreen Stift, umreißen Sie die gewünschte Region für Dissektion. Die Fläche der Region werden in der Software angezeigt. Halten Sie die ausgewählte Regionen unter 500.000 µm2 (0,5 mm2) einfacher Dissektion zu erleichtern. Wiederholen Sie die Dissektion bis 3 Millionen µm2 (3 mm2) insgesamt in der Röhre Kappe gesammelt worden.<ol>
<li>Gelegentlich kann die zergliederten Region bleiben stecken an die umgebenden Membran (z.B. durch statische Anziehung) und fallen nicht in die Sammlung-Kappe. Entfernen Sie diese Regionen aus die kumulierte Fläche insgesamt durch Auswahl und innerhalb der Software manuell zu entfernen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wählen Sie die Kappe für "zelluläre Läsion" und sammle 3 Millionen µm2 des Gewebes, die nach dem gleichen Verfahren wie in Schritt 3.7 beschrieben.</li>
	<li>Wählen Sie die Kappe für "unbeteiligte Lunge" und sammle 3 Millionen µm2 des Gewebes, die nach dem gleichen Verfahren wie in Schritt 3.7 beschrieben. Beachten Sie, dass unbeteiligte Lungengewebe vielen Bronchiolen und alveoläre Räume enthält. Achten Sie besonders auf diese von den definierten Gewebe Regionen für Dissektion auszuschließen.</li>
	<li>Entfernen Sie den Deckel sorgfältig ausclipsen Sie, verschließen Sie und beschriften Sie jedes Rohr. Schützen Sie die seziert Gewebe aus den umliegenden Luft Störungen (z. B. Air Flow Störungen durch eine sich öffnende Tür). Analysieren die seziert Gewebe sofort, oder bei-80 ° C aufbewahren und Auftauen vor der Verarbeitung und Analyse der LCMS.</li>
</ol>(4) Extraktion und Analyse der LCMS
<ol><li>Bereiten Sie Extraktionslösung von 1:1 Acetonitril/Methanol mit Ethambutol d-10 interne Standard vor. Bei der Auswahl eines internen Standards verwenden eine stabile bezeichnete Form des Analyten Medikaments mit ausreichend Masse Verschiebung Isotop zu vermeiden (z. B. Deuterium-mit der Bezeichnung EMB in dieser Demo verwendet) cross sprechen zwischen den Analyten Droge und Standard (in der Regel mindestens 4 Daltons) . Hinweis: Schaffung von Standards im Homogenat von jedem jeweiligen Gewebetyp ist schwierig, denn es gibt nur eine sehr begrenzte kontrollgewebe mit dem Homogenat Normen erstellt werden soll. Als Alternative zu Standards von einer stacheligen Homogenat Probe zu machen kann ein Standard erstellt werden, indem leere Gewebe und Testverbindung zusammen und extrahieren. Ein Volumen von kontrollgewebe in eine homogenisierte, die das Ziel-Volume von der Studie Probe Gewebeschnitte entspricht wird direkt mit einer Menge an die Testverbindung kombiniert, die in einer bestimmten Konzentration vorhanden sein würde.</li>
	<li>Berechnen Sie das Zielgewebe Volumen anhand der Fläche und Dicke des Abschnitts Gewebe und bestimmen Sie den erforderlichen Verdünnungsfaktor für das Homogenat über das Volumen der Homogenat, die von der Norm und QC Proben hinzugefügt werden. Berechnungen sind unten für 3 Millionen µm2 (3 mm2) seziert Zielgebiet mit 25 µm Dicke und 2 µL Volumen von Homogenat dargestellt. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq4.jpg">
</li>
	<li>Unter der Annahme einer Gewebe-Dichte von 1 g/mL, Homogenat Lager vorbereiten, indem mit einem Gewicht von 50 mg kontrollgewebe und Hinzufügen von PBS-Puffer zu verdünnen (mit Hilfe den 26.67 Homogenat Verdünnungsfaktor errechnet im Schritt 4.2, das Verdünnungsmittel 1,283 mL). Homogenisieren von Perle gegen Lungengewebe und PBS-Puffer für 5 Minuten bei 1750 u/min auf einem Wulst-Homogenisator. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq5.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq6.jpg">
</li>
	<li>Verdünnen Sie 1 mg/mL Wirkstoffkonzentration Bestände im 1:1 Acetonitril/Wasser Standardkurve Spick Lösungen zu erstellen. Spick standard Konzentrationen auf der Grundlage der Spike-Volumen und das Zielvolume Gewebe zu bestimmen. Dargestellte Beispiel ist für eine 100 ng/mL standard mit einer 10 µL Spike Volumen. <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq7.jpg"> <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq8.jpg">
</li>
	<li>Entfernen Sie die Röhrchen mit Microdissected Gewebe von-80 ° C Lagerung und erlauben Sie, um Raumtemperatur für 5 Minuten zu erreichen.</li>
	<li>Die Röhrchen mit Microdissected Gewebe fügen Sie 10 µL 1:1 Acetonitril/Wasser-Lösung und 2 µL PBS-Puffer hinzu.</li>
	<li>Fügen Sie für Standardkurve und Qualitätskontrolle Röhren 10 µL Lösung 2 µL Kontrolle Lunge Homogenat Spick.</li>
	<li>Jedes Rohr 50 µL der Extraktionslösung hinzufügen.</li>
	<li>Vortex jede Röhre für 5 Minuten, 5 Minuten lang beschallen und Zentrifugieren bei 5000 u/min für 5 Minuten einen Pellet Film- und Gewebe in jedem Röhrchen zu bilden.</li>
	<li>50 µL überstand auf eine 96-Well Deep-Well-Platte übertragen und mit einer zusätzlichen 50 µL deionisiertes Wasser in jede Vertiefung verdünnen.</li>
	<li>Durchführen Sie LC/MS/MS-Analyse mit optimierten Geräteparameter für Ethambutol und Ethambutol-d10 interner Standard (wie oben beschrieben im Detail12).</li>
	<li>Verwenden Sie ein Verdünnungsfaktor, um für die genaue Menge des Gewebes seziert für jede Probe zu korrigieren. <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq9.jpg">
</li>
</ol>5. die Methodenvalidierung
<ol><li>Erstellen Sie eine Homogenat im Lungengewebe Kontrolle durch die Kombination von 1 Teil Lunge, 2 Teile PBS und 3-4 stahlkügelchen. Schlagen Sie Lungengewebe und PBS-Puffer für 5 Minuten bei 1750 u/min mit einer Wulst-Homogenisator.</li>
	<li>Spike der Homogenat durch Zugabe von 10 µL von 1 mg/mL Ethambutol DMSO Lager in 990 µL Homogenat erstelle ich eine Endkonzentration von 10.000 ng/mL (10 mg/mL) und Vortex für 1 Minute.</li>
	<li>Erstellen Sie einen gefrorenen Homogenat Block durch das Homogenat in eine Cryomold Gießen und schnell Einfrieren auf Trockeneis für 5 Minuten.</li>
	<li>Bereiten Sie 25 µm Dicke Abschnitte aus dem Homogenat Block wie in 2.1-2.5 beschrieben vor.</li>
	<li>Das Zielgebiet Gewebe wie angegeben in Schritten 3.2-3.10 zu sezieren.</li>
	<li>Die Röhrchen mit Microdissected Gewebe fügen Sie 10 µL 1:1 Acetonitril/Wasser und 2 µL PBS-Puffer hinzu.</li>
	<li>Jedes Rohr 50 µL der Extraktionslösung hinzufügen. Schritte zum Erstellen einer Standardkurve und bestimmen die Wirkstoffkonzentration im Gewebe Homogenat Block 4,9-4.12.</li>
	<li>Berechnen Sie Extraktionseffizienz mit Hilfe der folgenden Formel: <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq10.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dartois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+path+of+anti-tuberculosis+drugs:+From+blood+to+lesions+to+mycobacterial+cells.">The path of anti-tuberculosis drugs: From blood to lesions to mycobacterial cells.</a> Nat Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+between+sterilizing+activity+and+drug+distribution+into+tuberculosis+lesions.">The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions.</a> Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+MALDI-MRM-MS+imaging+of+moxifloxacin+distribution+in+tuberculosis-infected+rabbit+lungs+and+granulomatous+lesions.">High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions.</a> Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).</li><li>Roscioli, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desorption+electrospray+ionization+(DESI)+with+atmospheric+pressure+ion+mobility+spectrometry+for+drug+detection.">Desorption electrospray ionization (DESI) with atmospheric pressure ion mobility spectrometry for drug detection.</a> Analyst. 139 (7), 1740-1750 (2014).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging+of+levofloxacin+distribution+in+TB-infected+pulmonary+lesions+by+MALDI-MSI+and+continuous+liquid+microjunction+surface+sampling.">Mass spectrometry imaging of levofloxacin distribution in TB-infected pulmonary lesions by MALDI-MSI and continuous liquid microjunction surface sampling.</a> Int J Mass Spectrom. 377, 699-708 (2015).</li><li>Griffiths, R. L., Randall, E. C., Race, A. M., Bunch, J., Cooper, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raster-mode+continuous-flow+liquid+microjunction+mass+spectrometry+imaging+of+proteins+in+thin+tissue+sections.">Raster-mode continuous-flow liquid microjunction mass spectrometry imaging of proteins in thin tissue sections.</a> Anal Chem. 89 (11), 5683-5687 (2017).</li><li>Prideaux, B., Stoeckli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging+for+drug+distribution+studies.">Mass spectrometry imaging for drug distribution studies.</a> J Proteomics. 75 (16), 4999-5013 (2012).</li><li>Dilillo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging,+laser+capture+microdissection,+and+LC-MS/MS+of+the+same+tissue+section.">Mass spectrometry imaging, laser capture microdissection, and LC-MS/MS of the same tissue section.</a> J Proteome Res. 16 (8), 2993-3001 (2017).</li><li>Xu, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+laser+capture+microdissection+and+proteomics:+methodologies+and+clinical+applications.">Combining laser capture microdissection and proteomics: methodologies and clinical applications.</a> Proteomics Clin Appl. 4 (2), 116-123 (2010).</li><li>Cahill, J. F., Kertesz, V., Van Berkel, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+dissection+sampling+modes+for+direct+mass+spectral+analysis.">Laser dissection sampling modes for direct mass spectral analysis.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 30 (5), 611-619 (2016).</li><li>Subbian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+pulmonary+cavitary+tuberculosis+in+rabbits:+A+failed+host+immune+response.">Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: A failed host immune response.</a> Open Biol. 1 (4), 110016 (2011).</li><li>Zimmerman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethambutol+partitioning+in+tuberculous+pulmonary+lesions+explains+its+clinical+efficacy.">Ethambutol partitioning in tuberculous pulmonary lesions explains its clinical efficacy.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (9), (2017).</li><li>Kempker, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitary+penetration+of+levofloxacin+among+patients+with+multidrug-resistant+tuberculosis.">Cavitary penetration of levofloxacin among patients with multidrug-resistant tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 59 (6), 3149-3155 (2015).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+drug+penetration+of+echinocandin+antifungals+at+the+site+of+infection+in+an+intra-abdominal+abscess+model.">Unraveling drug penetration of echinocandin antifungals at the site of infection in an intra-abdominal abscess model.</a> Antimicrob Agents Chemother. , (2017).</li><li>Pascal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+modeling+identifies+drug-uptake+history+as+predictor+of+tumor+drug+resistance+and+nano-carrier-mediated+response.">Mechanistic modeling identifies drug-uptake history as predictor of tumor drug resistance and nano-carrier-mediated response.</a> ACS Nano. 7 (12), 11174-11182 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Räumlich aufgelöst Quantifizierung von Medikamenten innerhalb pulmonale TB Läsionen ist erforderlich, um festzustellen, ob Arzneimittelexposition sterilisieren Konzentrationen an Bakterienpopulationen mit Wohnsitz innerhalb der verschiedenen Läsion Fächer erreicht. Die hier beschriebene LCM-LC/MS-Methode ermöglicht absolute Quantifizierung von Anti-TB-Medikamente in alle Fächer der Läsion, einschließlich der Bakterien-reiche Caseum, mit nur 1-3 Gewebeschnitte insgesamt. Traditionelle Gewebe Homogenisierung und L...

Die Fähigkeit, räumlich zu lösen und zu quantifizieren Droge Ebenen ist eine wesentliche Voraussetzung für die Feststellung, ob Anti-Tuberkulose-Medikamente bakterielle Subpopulationen innerhalb pulmonale Läsionen bei Sterilisation Konzentrationen1erreichen. Von besonderer Bedeutung ist Medikament Eindringen in die nekrotischen Kern der Läsion (genannt Caseum), bestimmen, welche in der Regel enthält die höchste Anzahl von Bazillen und möglicherweise schlecht zugänglichen Drogen wegen fehlender Vaskularisierung.
Traditionelle Methoden zur Läsion eindringen, bewerten die Homogenisierung der ausgeschnittenen pulmonale Läsionen gefolgt von solvent-Extraktion und Analyse der Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC/MS) betreffen, sind sehr empfindlich und selektiv für die Medikamente der Interesse. Diese Methoden bieten jedoch schlechte räumliche Informationen, auf die Größe des ursprünglichen homogenisierte Gewebe beschränkt. Massenspektrometrie-basierte Bildgebung Ansätze, wie Matrix-assisted Laser Desorption ionisation (MALDI)2,3, desorption Electrospray Ionisierung (DESI)4 oder Flüssigkeit-Erweiterte Oberfläche Extraktion5, 6 bieten sehr räumlich aufgelöst imaging-Funktionen, direkte Quantifizierung kann jedoch extrem schwierig oder unmöglich aufgrund der heterogenen Ion Unterdrückung Effekte und unterschiedliche Extraktion Wirkungsgrade von Analyten aus der einzelnen Zelle oder Gewebe7. Darüber hinaus sind direkteste Gewebe MS bildgebenden Ansätze von Natur aus weniger empfindlich als LC/MS aufgrund fehlender chromatographische Trennung von endogenen Arten konkurrieren für Ionisierung und die geringeren Wirkungsgrad der solvent-Extraktion der Droge aus Gewebe.
Laser Capture Microdissection (LCM) in Kombination mit LC/MS-Analyse wurde routinemäßig angewendet zu isolieren und zu charakterisieren verschiedene Gewebe Regionen für Proteomik8,9 Studien und vor kurzem verwendet für die Droge Quantifizierung dosiert tierisches Gewebe10. Hier präsentieren wir Ihnen eine optimierte Protokoll Anwendung LCM kombiniert mit LC/MS (LCM-LC/MS)-Analyse, um Anti-TB-Medikamente in unterschiedlichen Granulom Fächer zu quantifizieren. Laser Capture Microdissection dabei konzentriert sich ein UV-Laser durch das Mikroskopobjektiv auf Gewebe, die schneidet und isoliert die gewünschte Gewebebereich ein Pfad durch den Benutzer definiert. Schwerkraft-unterstützte LCM (die Technik für diese Forschung verwendet), Abschnitt Gewebe wird auf einer dünnen Polymer-Membran-Folie (PET oder Stift) montiert und das Gewebe wird in einer Sammlung Rohr Kappe gelegen unterhalb der Folie erfasst. Die Medikamente werden aus dem ausgeschnittenen Gewebe extrahiert und quantifiziert mit LC/MS Standardansätze. Die Menge des Gewebes zu erhebenden erforderlich wird letztlich von der erwarteten Konzentration des Medikaments im Gewebe vorhanden und die Empfindlichkeit der LC/MS-Methode bestimmt. Für die meisten Analysen von Drogen auf therapeutische Ebenen dosiert und analysiert mit Hilfe einer routinemäßigen triple Quadrupol-Massenspektrometer, 3 Millionen µm2 (3 mm2) des Gewebes ist die Fläche ausreichend.
Dieses Protokoll beschreibt die kraftvolle Kombination von räumlichen Profilierung und vollständigen Quantifizierung von LCM-LC/MS, bietet absolute Droge Konzentrationen in allen Abteilen der TB Granulome angeboten. Die Technik kann auch angewendet werden, zu bestimmen, Droge-Konzentrationen in vielen verschiedenen erkrankten Geweben lebenswichtige Medikament Entdeckung und Entwicklung informieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="841">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">New Zealand White rabbits</td>
			<td style="width:159px;">Covance</td>
			<td style="width:155px;">N/A</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">HN878 Mycobacterium tuberculosis</td>
			<td style="width:159px;">BEI Resources</td>
			<td style="width:155px;">NR-13647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N</td>
			<td style="width:159px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:155px;">56344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Anased (Xylazine) 100 mg/mL</td>
			<td style="width:159px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:155px;">33198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Virbac</td>
			<td style="width:155px;">710101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Acetonitrile (LC-MS grade)</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">A955-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Methanol (LC-MS grade)</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">A456-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Formic Acid (LC-MS grade)</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Water (LC-MS grade)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">W6212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">0.2 mL flat-cap PCR tubes</td>
			<td style="width:159px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">07-200-392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Steel frames, PET-membrane</td>
			<td style="width:159px;">Leica</td>
			<td style="width:155px;">11505151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Premium Frosted Microscope Slides</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">12-544-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">&#160;96 Deep well plate 2.0ML PP RB&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">NC0363259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Zorbax SB-C8&#160;column (4.6 by 50 mm; particle size, 3.5 &#956;m)</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:155px;">820631-001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">&#34;Zipper&#8221; Seal Sample Bags</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">01-816-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Name</td>
			<td style="width:159px;">Company</td>
			<td style="width:155px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Equipment</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">CM1850&#160;cryostat</td>
			<td style="width:159px;">Leica</td>
			<td style="width:155px;">Discontinued</td>
			<td>Leica CM1860 is the current model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Laser Microdissection System 6500</td>
			<td style="width:159px;">Leica</td>
			<td style="width:155px;">Discontinued</td>
			<td>Leica LMD 6 is the current model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Agilent 1260 Infinity II HPLC&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">API 4000 QTRAP Mass Spectrometer</td>
			<td style="width:159px;">Sciex</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatial quantification of drugs in pulmonary tuberculosis lesions by laser capture microdissection liquid chromatography mass spectrometry (lcm-lc/ms)

Tuberkulose ist nach wie vor eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität weltweit. Verbesserungen an vorhandenen Drogen-Therapien und die Entwicklung neuer Therapeutika werden dringend gebraucht. Die Fähigkeit der dosierten TB-Medikamente zu erreichen und Sterilisieren Bakterien innerhalb schlecht durchblutet nekrotische Regionen (Caseum) der pulmonale Granulome ist entscheidend für eine erfolgreiche therapeutische Intervention. Effektive therapeutische Therapien müssen daher Medikamente mit günstigen Caseum Eindringvermögen enthalten. Aktuelle LC/MS-Methoden zur Quantifizierung der Droge Ebenen in biologischen Geweben haben begrenzte räumliche Auflösung Fähigkeiten, macht es schwierig, genau festzustellen, absolute Droge Konzentrationen innerhalb kleiner Gewebe Fächer wie die gefunden in nekrotische Granulome. Hier präsentieren wir ein Protokoll mit LC/MS Quantifizierung Laser Capture Microdissection (LCM) pathologisch unterschiedliche Gewebe Regionen kombinieren. Diese Technik bietet absolute Quantifizierung von Medikamenten innerhalb von Granulomen Caseum, um zelluläre Läsion und unbeteiligte Lungengewebe und daher genau bestimmt, ob bakterizide Konzentrationen erreicht werden. Neben der Tuberkuloseforschung hat die Technik viele Anwendungsmöglichkeiten für räumlich aufgelöst Quantifizierung von Drogen im erkrankten Gewebe.

Ein Überblick über die LCM-LC/MS-Ansatz ist in Abbildung 1dargestellt. Nach der Sterilisierung des Gewebes durch Gamma-Bestrahlung, statt alle weiteren Schritte (von Gewebe schneiden ab) außerhalb BSL3-Bedingungen. Abbildung 2 zeigt die Läsion Biopsie Abschnitte vor und nach dem Gewebe isoliert von LCM. Nekrotische und zelluläre Bereiche des TB Läsionen können leicht identifiziert und isoliert durch visuelle Inspektion der...

Watch this Scientific Journal Video about Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS at JoVE.c

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Hier beschreiben wir ein Protokoll mit Laser Capture Microdissection gepaart mit LC/MS-Analyse, um räumlich-Droge-Verteilungen innerhalb von Lungentuberkulose Granulome zu quantifizieren. Dieser Ansatz hat breite Anwendbarkeit auf Droge-Konzentrationen in den Geweben an hohe räumliche Details zu quantifizieren.

Räumliche Quantifizierung von Drogen in der Lungentuberkulose Läsionen durch Laser Capture Microdissection Flüssigkeit Gaschromatographie-Massenspektrometrie (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

spatial-quantification-drugs-pulmonary-tuberculosis-lesions-laser

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Medical-Surgical Nursing

Medicine

Unit 1

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Lower Respiratory Tract Infections

SCIENTISTS IN ACTION

9.0K Aufrufe.  Rutgers, The State University of New Jersey. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit Laser Capture Microdissection gepaart mit LC/MS-Analyse, um räumlich-Droge-Verteilungen innerhalb von Lungentuberkulose Granulome zu quantifizieren. Dieser Ansatz hat breite Anwendbarkeit auf Droge-Konzentrationen in den Geweben an hohe räumliche Details zu quantifizieren.

Serie: Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Magnetic Resonance Imaging Quantification of Pulmonary Perfusion using Calibrated Arterial Spin Labeling

This demonstrates a MR imaging method to measure the spatial distribution of pulmonary blood flow in healthy subjects 
during normoxia (inspired O2, fraction (FIO2) = 0.21) hypoxia (FIO2 = 0.125), and hyperoxia 
(FIO2 = 1.00). In addition, the physiological responses of the subject are monitored in the MR scan environment. MR images 
were obtained on a 1.5 T GE MRI scanner during a breath hold from a sagittal slice in the right lung at functional residual capacity. An arterial 
spin labeling sequence (ASL-FAIRER) was used to measure the spatial distribution of pulmonary blood flow 1,2 and a multi-echo fast 
gradient echo (mGRE) sequence 3 was used to quantify the regional proton (i.e. H2O) density, allowing the quantification 
of density-normalized perfusion for each voxel (milliliters blood per minute per gram lung tissue). 
With a pneumatic switching valve and facemask equipped with a 2-way non-rebreathing valve, different oxygen concentrations 
were introduced to the subject in the MR scanner through the inspired gas tubing. A metabolic cart collected expiratory gas via expiratory tubing. Mixed expiratory O2 and CO2 concentrations, oxygen consumption, carbon dioxide production, respiratory exchange ratio, 
respiratory frequency and tidal volume were measured. Heart rate and oxygen saturation were monitored using pulse-oximetry. 
Data obtained from a normal subject showed that, as expected, heart rate was higher in hypoxia (60 bpm) than during normoxia (51) or hyperoxia (50) and the arterial oxygen saturation (SpO2) was reduced during hypoxia to 86%. Mean ventilation was 8.31 L/min BTPS during hypoxia, 7.04 L/min during normoxia, and 6.64 L/min during hyperoxia. Tidal volume was 0.76 L during hypoxia, 0.69 L during normoxia, and 0.67 L during hyperoxia. 
Representative quantified ASL data showed that the mean density normalized perfusion was 8.86 ml/min/g during hypoxia, 8.26 ml/min/g during normoxia and 8.46 ml/min/g during hyperoxia, respectively. In this subject, the relative dispersion4, an index of global heterogeneity, was increased in hypoxia (1.07 during hypoxia, 0.85 during normoxia, and 0.87 during hyperoxia) while the fractal dimension (Ds), another index of heterogeneity reflecting vascular branching structure, was unchanged (1.24 during hypoxia, 1.26 during normoxia, and 1.26 during hyperoxia). 
Overview. This protocol will demonstrate the acquisition of data to measure the distribution of pulmonary perfusion noninvasively under conditions of normoxia, hypoxia, and hyperoxia using a magnetic resonance imaging technique known as arterial spin labeling (ASL). 
Rationale: Measurement of pulmonary blood flow and lung proton density using MR technique offers high spatial resolution images which can be quantified and the ability to perform repeated measurements under several different physiological conditions. In human studies, PET, SPECT, and CT are commonly used as the alternative techniques. However, these techniques involve exposure to ionizing radiation, and thus are not suitable for repeated measurements in human subjects.

A MR imaging method to study the distribution of pulmonary blood flow under a variety of physiological conditions, in this case exposure to three different inspired oxygen concentrations: hypoxia, normoxia, and hyperoxia, is described. This technique utilizes human pulmonary physiology research techniques in an MR scanning environment.

Magnetic Resonance Imaging Quantifizierung der pulmonalen Perfusion mittels geeichter Arterial Spin Labeling

This demonstrates a MR imaging method to measure the spatial distribution of pulmonary blood flow in healthy subjects 
during normoxia (inspired O2, ...

Forschung

Medizin

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson's Disease

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 (Fig.1). A 12 &mu;m thin tissue section is covered with a MALDI matrix, which facilitates desorption and ionization of intact peptides and proteins that can be detected with a mass analyzer, typically using a MALDI TOF/TOF mass spectrometer. Generally hundreds of peaks can be assessed in a single rat brain tissue section. In contrast to commonly used imaging techniques, this approach does not require prior knowledge of the molecules of interest and allows for unsupervised and comprehensive analysis of multiple molecular species while maintaining high molecular specificity and sensitivity2. Here we describe a MALDI IMS based approach for elucidating region-specific distribution profiles of neuropeptides in the rat brain of an animal model Parkinson's disease (PD). 
PD is a common neurodegenerative disease with a prevalence of 1% for people over 65 of age3,4. The most common symptomatic treatment is based on dopamine replacement using L-DOPA5. However this is accompanied by severe side effects including involuntary abnormal movements, termed L-DOPA-induced dyskinesias (LID)1,3,6. One of the most prominent molecular change in LID is an upregulation of the opioid precursor prodynorphin mRNA7. The dynorphin peptides modulate neurotransmission in brain areas that are essentially involved in movement control7,8. However, to date the exact opioid peptides that originate from processing of the neuropeptide precursor have not been characterized. Therefore, we utilized MALDI IMS in an animal model of experimental Parkinson's disease and L-DOPA induced dyskinesia. 
MALDI imaging mass spectrometry proved to be particularly advantageous with respect to neuropeptide characterization, since commonly used antibody based approaches targets known peptide sequences and previously observed post-translational modifications. By contrast MALDI IMS can unravel novel peptide processing products and thus reveal new molecular mechanisms of neuropeptide modulation of neuronal transmission. While the absolute amount of neuropeptides cannot be determined by MALDI IMS, the relative abundance of peptide ions can be delineated from the mass spectra, giving insights about changing levels in health and disease. In the examples presented here, the peak intensities of dynorphin B, alpha-neoendorphin and substance P were found to be significantly increased in the dorsolateral, but not the dorsomedial, striatum of animals with severe dyskinesia involving facial, trunk and orolingual muscles (Fig. 5). Furthermore, MALDI IMS revealed a correlation between dyskinesia severity and levels of des-tyrosine alpha-neoendorphin, representing a previously unknown mechanism of functional inactivation of dynorphins in the striatum as the removal of N-terminal tyrosine reduces the dynorphin's opioid-receptor binding capacity9. This is the first study on neuropeptide characterization in LID using MALDI IMS and the results highlight the potential of the technique for application in all fields of biomedical research.

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson&#039;s Disease

Dopamine replacement pharmacotherapy using L-DOPA is the most commonly used symptomatic treatment of Parkinson&#x2019;s disease, but is accompanied by side effects including involuntary abnormal movements, termed dyskinesia 1. Here, a protocol for MALDI imaging mass spectrometry is presented that detects changes in rat brain neuropeptide levels related to dyskinesia.

MALDI-Imaging-Massenspektrometrie von Neuropeptiden bei Parkinsonpatienten

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Verbessertes Protokoll für Laser Mikrodissektion Of Human Pankreasinseln Von chirurgischen Proben

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic biomarkers. However, methods for quantitative proteomic characterization of patient-derived tumors and in particular their cellular subpopulations are largely lacking. Here we describe an experimental set-up that allows quantitative analysis of proteomes of cancer cell subpopulations derived from either liquid or solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry followed by bioinformatic data analysis. To enrich specific cellular subsets, liquid tumors are first immunophenotyped by flow cytometry followed by FACS-sorting; for solid tumors, laser-capture microdissection is used to purify specific cellular subpopulations. In a second step, proteins are extracted from the purified cells and subsequently combined with a tumor-specific, SILAC-labeled spike-in standard that enables protein quantification. The resulting protein mixture is subjected to either gel electrophoresis or Filter Aided Sample Preparation (FASP) followed by tryptic digestion. Finally, tryptic peptides are analyzed using a hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer, and the data obtained are processed with bioinformatic software suites including MaxQuant. By means of the workflow presented here, up to 8,000 proteins can be identified and quantified in patient-derived samples, and the resulting protein expression profiles can be compared among patients to identify diagnostic proteomic signatures or potential drug targets.

In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

Quantitative massenspektrometrische Analyse von Krebs-Zellen-Proteome Abgeleitet von Liquid und soliden Tumoren

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.

The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

Laser-Mikrodissektion für Menschen Prostataepithel für die RNA-Analyse

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (LA-ICP-MS)

Metals are found ubiquitously throughout an organism, with their biological role dictated by both their chemical reactivity and abundance within a specific anatomical region. Within the brain, metals have a highly compartmentalized distribution, depending on the primary function they play within the central nervous system. Imaging the spatial distribution of metals has provided unique insight into the biochemical architecture of the brain, allowing direct correlation between neuroanatomical regions and their known function with regard to metal-dependent processes. In addition, several age-related neurological disorders feature disrupted metal homeostasis, which is often confined to small regions of the brain that are otherwise difficult to analyze. Here, we describe a comprehensive method for quantitatively imaging metals in the mouse brain, using laser ablation - inductively coupled plasma - mass spectrometry (LA-ICP-MS) and specially designed image processing software. Focusing on iron, copper and zinc, which are three of the most abundant and disease-relevant metals within the brain, we describe the essential steps in sample preparation, analysis, quantitative measurements and image processing to produce maps of metal distribution within the low micrometer resolution range. This technique, applicable to any cut tissue section, is capable of demonstrating the highly variable distribution of metals within an organ or system, and can be used to identify changes in metal homeostasis and absolute levels within fine anatomical structures.

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry LA-ICP-MS

Quantitatively mapping metals in tissue by laser ablation - inductively coupled plasma - mass spectrometry (LA-ICP-MS) is a sensitive analytical technique that can provide new insight into how metals participate in normal function and disease processes. Here, we describe a protocol for quantitatively imaging metals in thin sections of mouse neurological tissue.

Imaging Metals im Hirngewebe durch Laserablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (LA-ICP-MS)

Metals are found ubiquitously throughout an organism, with their biological role dictated by both their chemical reactivity and abundance within a ...

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity is disturbed in gastrointestinal, cardiovascular and metabolic diseases, which may result in easier access of biologically active compounds, such as gut bacterial metabolites, to the bloodstream. Thus, the permeability of the GBB may be a marker of both intestinal and extraintestinal diseases. Furthermore, the increased penetration of bacterial metabolites may affect the functioning of the entire organism.
Commonly used methods for studying the GBB permeability are performed ex vivo. The accuracy of those methods is limited, because the functioning of the GBB depends on intestinal blood flow. On the other hand, commonly used in vivo methods may be biased by liver and kidney performance, as those methods are based on evaluation of urine or/and peripheral blood concentrations of exogenous markers. Here, we present a direct measurement of GBB permeability in rats using an in vivo method based on portal blood sampling, which preserves intestinal blood flow and is virtually not affected by the liver and kidney function. 
Polyurethane catheters are inserted into the portal vein and inferior vena cava just above the hepatic veins confluence. Blood is sampled at baseline and after administration of a selected marker into a desired part of the gastrointestinal tract. Here, we present several applications of the method including (1) evaluation of the colon permeability to TMA, a gut bacterial metabolite, (2) evaluation of liver clearance of TMA, and (3) evaluation of a gut-portal blood-liver-peripheral blood pathway of gut bacteria-derived short-chain fatty acids. Furthermore, the protocol may also be used for tracking intestinal absorption and liver metabolism of drugs or for measurements of portal blood pressure.

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

The access of nutrients, microbiota metabolites and medicines to the circulation is controlled by the gut-blood barrier (GBB). We describe a direct method for measuring the GBB permeability in vivo, which, in contrast to commonly used indirect methods, is virtually not affected by liver and kidney functions.

Eine In Vivo -Methode zur Bewertung der Darm-Blut-Schranke und LEBERSTOFFWECHSEL Mikrobiota Produkte

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity ...

Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography

Glycomics is a new subspecialty in omics system research that offers significant potential in discovering next-generation biomarkers for disease susceptibility, drug target discovery, and precision medicine. Alternative IgG N-glycans have been reported in several common chronic diseases and suggested to have great potential in clinical applications (i.e., biomarkers for diagnosis and prediction of diseases). IgG N-glycans are widely characterized using the method of hydrophilic interaction chromatography (HILIC) ultra-performance liquid chromatography (UPLC). UPLC is a stable detection technology with good reproducibility and high relative quantitative accuracy. In addition, the structure of IgG N-glycan is clearly separated, and glycan composition and relative abundance in plasma are characterized.

Immunoglobulin G (IgG) N-glycan is characterized using hydrophilic interaction chromatography UPLC. In addition, the structure of IgG N-glycan is clearly separated. Presented here is an introduction to this experimental method so that it can be widely used in research settings.

Immunglobulin G N-Glycan Analyse durch Ultra-Performance Liquid Chromatographie

Glycomics is a new subspecialty in omics system research that offers significant potential in discovering next-generation biomarkers for disease ...

Analysis of Raw and Processed Cyperi Rhizoma Samples Using Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry in Rats with Primary Dysmenorrhea

Cyperi rhizoma (CR) is widely used in gynecology and is a general medicine for treating women's diseases in China. Since the analgesic effect of CR is enhanced after processing with vinegar, CR processed with vinegar (CRV) is generally used clinically. However, the mechanism by which the analgesic effect is enhanced by vinegar processing is unclear. In this study, the ultra-high pressure liquid chromatographytandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) technique was used to examine changes in the blood levels of the exogenous constituents and metabolites between CR-treated and CRV-treated rats with dysmenorrhea. The results revealed differing levels of 15 constituents and two metabolites in the blood of these rats. Among them, the levels of (-)-myrtenol and [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tetramethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]acetic acid in the CRV group were considerably higher than in the CR group. CRV reduced the level of 2-series prostanoids and 4-series leukotrienes with proinflammatory, platelet aggregation, and vasoconstriction activities and provided analgesic effects by modulating arachidonic acid and linoleic acid metabolism and the biosynthesis of unsaturated fatty acids. This study revealed that vinegar processing enhances the analgesic effect of CR and contributes to our understanding of the mechanism of action of CRV.

Here, a comparative analysis of raw and processed Cyperi rhizoma (CR) samples is presented using ultra-high performance liquid chromatography-high-resolution tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) in rats with primary dysmenorrhea. The changes in blood levels of the metabolites and the sample constituents were examined between rats treated with CR and CR processed with vinegar (CRV).

Analyse von rohen und verarbeiteten Cyperi-Rhizom-Proben mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie bei Ratten mit primärer Dysmenorrhoe

Cyperi rhizoma (CR) is widely used in gynecology and is a general medicine for treating women's diseases in China. Since the analgesic effect of CR is ...

Erfassung von Gewebeproben der oralen submukösen Fibrose für die Spatial-Omics-Analyse

Isolation of Cells with Morphological and Spatial Information from Oral Submucous Fibrosis Samples by Laser Capture Microdissection

Oral submucous fibrosis (OSF) is a common type of potentially malignant disorder in the oral cavity. The atrophy of epithelium and fibrosis of the lamina propria and the submucosa are often found on histopathological slides. Epithelial dysplasia, epithelial atrophy, and senescent fibroblasts have been proposed to be associated with the malignant transformation of OSF. However, because of the heterogeneity of potentially malignant oral disorders and oral squamous cell carcinoma, it is difficult to identify the specific molecular mechanisms of malignant transformation in OSF. Here, we present a method to obtain a small number of epithelial or mesenchymal cells carrying morphological data and spatial information by laser capture microdissection on formalin-fixed paraffin-embedded tissue slides. Using a microscope, we can precisely capture microscale (~500 cells) dysplastic or atrophic epithelial tissue and fibrotic subepithelial tissue. The extracted cells can be evaluated by genome or transcriptome sequencing to acquire genomic and transcriptomic data with morphological and spatial information. This approach removes the heterogeneity of bulk OSF tissue sequencing and the interference caused by cells in non-lesioned areas, allowing for precise spatial-omics analysis of OSF tissue.

Autor im Rampenlicht: Die Geheimnisse oraler potenzieller Malignome entschlüsseln 

Laser capture microdissection of oral submucous fibrosis tissues allows for precise extraction of cells from histological regions of interest for the analysis of multi-omics data with morphological and spatial information.

Isolierung von Zellen mit morphologischen und räumlichen Informationen aus oralen submukösen Fibroseproben mittels Laser-Capture-Mikrodissektion

Oral submucous fibrosis (OSF) is a common type of potentially malignant disorder in the oral cavity. The atrophy of epithelium and fibrosis of the lamina ...