Wir bedanken uns bei aktuellen und ehemaligen Mitgliedern des Rubenstein Labor zur Bereitstellung eines unterstützenden und begeisterten Forschungsumfeld. Wir danken Ryan T. Gibson um Hilfe bei der Protokolloptimierung. Wir danken Markus Hochstrasser (Yale University) und Dieter Wolf (Universität Stuttgart) für Hefestämme und Plasmide. Wir danken unseren anonymen Gutachtern für ihre Hilfe bei der Verbesserung der Klarheit und Nützlichkeit dieses Manuskript. Diese Arbeit wurde von einem Forschungspreis der Ball State University Kapitel der Sigma Xi zu SGW unterstützt, ein National Institutes of Health Zuschuss (R15 GM111713) zu EMR, ein Ball State University ASPiRE Forschungspreis zur EMR und Mittel aus der Ball State University Provost Büro und Fachbereich Biologie.

1. Hefe-Wachstumstest zur Kandidaten Mutanten Defekte in Proteinabbau identifizieren <ol><li> Transformieren Wildtyp- und mutierten Hefe-Zellen mit einem Plasmid einen instabilen Protein fusioniert codiert, im Rahmen, mit einem Reporter-Stoffwechselenzym. </li><li> Beimpfen von Transformanten in 5 ml synthetischem definiert (SD) Minimalmedium, das selektiv für Zellen, die Plasmid-Moleküle sind. Inkubieren über Nacht bei 30 ° C, rotiert. </li><li> Anschließend wird die optische Dichte bei 600 nm (OD 600) von jeder Übernachtkultur. HINWEIS: Nach Inkubation über Nacht, können die Zellen in Kultur in entweder logarithmisch oder stationären Wachstumsphase sein, sollte aber eine minimale OD 600 von 0,2 erreicht. Sehr langsam wachsenden Hefestämme können Inkubationszeiten von einer größeren Anzahl von Zellen benötigen länger als eine Nacht oder Inokulation empirisch bestimmt. </li><li> Bereiten sechsfache serielle Verdünnungen von transformierten Hefezellen in einem sterilen 96-Well-Platte, beginnend mit den Zellen, um eine verdünnten OD 600 von 0,2. Platzieren jedes Hefetransformante in einer anderen Reihe in der Platte mit 96 Vertiefungen untersucht werden. <ol><li> Für jede Transformante, die Berechnung des Volumens der Übernacht-Kultur erforderlich ist, um Zellen zu einer OD 600 von 0,2 in einem Endvolumen von 200 ul verdünnt. Fügen Sie diese Volumen von Übernacht-Kultur, um die entsprechende Vertiefung in Spalte 1. Fügen Sie die entsprechende Menge an sterilem Wasser, um das Volumen auf 200 ul zu bringen. </li><li> Für jede Reihe von Hefe, fügen 125 ul sterilem Wasser, um die Vertiefungen in den Spalten 2, 3 und 4. HINWEIS: Einzeln verpackte sterile 96-Well-Platten mit einer sterilen Deckeln verpackt werden. Der Deckel kann als Reservoir für das sterile Wasser, das in dieser Stufe verteilt werden. Dies ermöglicht die gleichzeitige Übertragung von sterilem Wasser zu allen Vertiefungen in einer bestimmten Spalte mit einer Mehrkanalpipette. </li><li> Mischen Sie den Inhalt der ersten Spalte (Hefe zu einer OD 600 von 0,2 verdünnt) durch Auf- und Abpipettieren mit einer Mehrkanalpipette. </li><li> Transfer 25 ul Hefe aus Spalte 1 bis Spalte 2, mit einer Mehrkanalpipette. Mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren. Transfer 25 ul aus Spalte 2 bis Spalte 3, und 25 ul aus Spalte 3 bis Spalte 4 (gut mischen bei jedem Schritt). </li></ol></li><li> Mischen Sie jede Probe mit einer Mehrkanalpipette. Ausgehend von den meisten verdünnten in wenigstens verdünnte Spalten von Hefe, einer Pipette 4 ul jeder Probe auf beiden Platten, die den entsprechenden Selektionsmedium. Verwenden Sie eine Platte mit Medium, das Plasmid-Selektion (diese Platte dient als Hefe-Spotting und Wachstumskontrolle) unterhält. Verwenden einer zweiten Platte mit Medium, das für die Erhaltung des Plasmids und Expression des instabilen Protein an das Reporterenzym fusioniert auswählt. Da Hefe begleichen schnell, mischen Zellen durch Auf- und Abpipettieren in regelmäßigen Abständen. HINWEIS: Trockenplatten werden leichter absorbiert Flüssigkeit als frisch zubereiteten Platten und sind daher für diese Versuche zu empfehlen. Feuchten Platten können durch Inkubation bei Raumtemperatur in lo trocknendenw Luftfeuchtigkeit für 1 - 2 Tage oder kürzer Inkubationen in einer Haube mit laminarer Strömung. Platten können ungleichmäßig trocknen, wenn sich die laminare Luftströmung parallel zu der Bank. Verwendung einer Schablone erleichtert die Hefezellen in regelmäßigen Abständen zu erkennen. Zwei Mustervorlagen sind in Figur 1 zur Verfügung gestellt. Diese können gedruckt werden, ausgeschnitten und in das Innere der Petrischale mit Deckel versehen. </li><li> Lassen Platten auf der Bank oben trocknen. </li><li> Inkubation erfolgt bei 30 ° C für 2 - 6 Tagen haben. </li><li> Fotografieren Sie jede Platte nach Inkubation. </li></ol><img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52428/52428fig1large.jpg" width="650" /> Abbildung 1. Vorlagen für das Auffinden Hefezellen auf 100-mm-Agar-Platten. Diese Vorlagen können verwendet werden, um zu ermöglichen Spotting Hefe in regelmäßigen Abständen mit einem Mehrkanalpipette werden. Templates können ausgedruckt, ausgeschnitten und in das Innere der Petrischale mit Deckel versehen. Zeigen Petrischale mit WachstumMedium im Deckel mit Schablone angebracht. Vorlagen werden mit einer Einkerbung markiert, um Orientierung zu verfolgen. Es wird empfohlen, dass die Platten in Wachstumsassays verwendet in ähnlicher Weise mit einer Kerbe markiert werden, um die Orientierung zu verfolgen. Vorlagen für die Erkennung von vier (A) oder fünf (B) Reihenverdünnungen von Hefezellen zur Verfügung gestellt werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52428/150126 Fig 1.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um eine druckfähige Version dieser Figur mit 100-mm-Vorlagen zu sehen.</a> 2. Biochemische Bestätigung des Hefe-Wachstumstest <ol><li> Das Wachstum der Hefezellen und Post-Alkaline Proteinextraktion (von 31 modifiziert) <ol><li> Transform-Wildtyp und mutierten Hefe-Zellen mit einem Plasmid der instabilen Protein kodiert. </li><li> Beimpfen von Transformanten in 5 ml SD-Medium, das selektiv für Zellen, die Plasmid-Moleküle sind. Inkubieren über Nacht bei 30 ° C, rotiert. </li><li> Messen Sie die OD600 von jeder Nacht culture. HINWEIS: Nach Inkubation über Nacht, können die Zellen entweder in logarithmische oder stationäre Wachstumsphase sein, sollte aber eine OD 600 die Verdünnung bis zu einer OD 600 von 0,2 in 10 ml frisches Selektivmedium (Schritt 2.1.4) erlauben wird erreicht. Sehr langsam wachsenden Hefestämme können Inkubationszeiten von einer größeren Anzahl von Zellen benötigen länger als eine Nacht oder Inokulation empirisch bestimmt. </li><li> Verdünne Hefezellen bis zu einer OD 600 von 0,2 in 10 ml frischem selektivem Medium. </li><li> Weiter zu den Zellen bei 30 ° C inkubieren, Drehen oder Schütteln, bis Kulturen erreichen einer OD 600 zwischen 0,8 und 1,2 (dh sind Mitte logarithmischen Wachstums). Hinweis: Wenn der instabile Protein von Interesse unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors, kann die optimale Zeitsteuerung der Induktion der Proteinexpression und der Zellgewinnung nach den vorherigen Studien oder empirischen Beobachtungen variieren. </li><li> Sammeln 2,5 OD 600 Einheiten der Kultur in 15 ml konischenal Rohr durch Zentrifugation bei 5.000 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Überstand entfernen durch Pipettieren oder Absaugen. Hinweis: eine OD600-Einheit wird als die Menge der vorhandenen Hefe von 1 ml der Kultur bei einer OD 600 von 1,0 definiert. V = 2,5 OD 600 Einheiten / Mess OD 600: Das Volumen der Kultur (in ml) erforderlich, um 2,5 OD 600 Einheiten (V) zu ernten kann mit der folgenden Gleichung bestimmt werden </li><li> Zellen in 1 ml destilliertem Wasser. Übertragen suspendierten Zellen in ein Mikrozentrifugenrohr. </li><li> Pelle Zellen durch Zentrifugation bei 6.500 xg für 30 sec bei Raumtemperatur. Überstand entfernen durch Pipettieren oder Absaugen. </li><li> Zellen in 100 ul destilliertem Wasser durch Auf- und Abpipettieren oder Verwirbelung, und fügen Sie 100 ul 0,2 M NaOH. Mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren. Proben für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 18.000 x (von denen die meisten noch nicht veröffentlicht Proteine ​​und sind noch lebensfähig)g für 5 min. Überstand entfernen durch Pipettieren oder Absaugen. </li><li> Pellet in 50 bis 100 ul 1x Laemmli-Probenpuffer, die Zellen zu lysieren wird, durch Auf- und Abpipettieren oder Verwirbeln. HINWEIS: Die Entfernung des Alkaliüberstand nach Zentrifugation und anschließende Resuspension der Zellen in Laemmli-Probenpuffer extrahiert Proteine ​​bei einem pH-Wert mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) kompatibel mit einem Tris-Glycin-Laufpuffersystem und Western Blotting. </li><li> Um vollständig zu denaturieren, Inkubation Lysate bei 95 ° C für 5 min. HINWEIS: Aggregation neigende Proteine ​​(zB Proteine ​​mit mehreren Transmembransegmente) können unlöslich werden, wenn sie bei 95 ° C inkubiert. Daher sollte Lysate bei niedrigeren Temperaturen inkubiert werden (zB 37 ° C - 70 ° C) für 10 bis 30 min, wie empirisch ermittelt, für die Analyse von solchen Proteinen. </li><li> Kühle Lysaten durch Anordnen auf Eis für 5 min. </li><li> Zentrifuge Lysate bei 18000 g für 1 min bei Raumtemperatur, um unlösliches Material zu pelletisieren. Trennen Sie den Überstand (in Lösung extrahierte Protein) durch SDS-PAGE vor der anschließenden Western Blot-Analyse (Abschnitt 2.2). Alternativ Shop Lysate bei -20 ° C. </li></ol></li><li> Vertreter Western Blot Protokoll <ol><li> Laden empirisch ermittelten Volumen Lysate in einem SDS-PAGE-Gel. </li><li> Führen Gel bei 200 V, bis Farbstofffront den Boden des Gels erreichte. </li><li> Transferproteine ​​aus Gel auf Polyvinylidenfluorid (PVDF) -Membran durch Nasstransfer bei 20 V für 60 bis 90 min bei 4 ° C. </li><li> Block Membran durch Inkubation in 5% Magermilch in Tris-gepufferter Saline (TBS), schaukeln, für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Dekantieren Blockierungslösung. </li><li> Dazu werden die Membranen mit primärem Antikörper, der für das Protein von Interesse (oder Epitoptag davon) in 1% Magermilch in TBS mit 0,1% Tween-20 (TBS / T) für 1 h bei Raum temperatur, schaukeln. </li><li> Dekantier-Antikörperlösung und Waschen der Membran 3 x 5 min mit TBS / T bei Raumtemperatur schaukeln. </li><li> Dazu werden die Membranen mit geeigneten Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörpers in 1% Magermilch in TBS / T für 1 Stunde bei Raumtemperatur schaukeln. Hinweis: Da Fluorophore sind lichtempfindlich, sollte Verdünnungen fluorophorkonjugierten Antikörper im Dunkeln hergestellt werden. Zusätzlich sollte die Inkubation von Membranen in Gegenwart von fluorophorkonjugierten Antikörpern in lichtundurchlässigen Behältern auftreten. Dies kann durch Umwickeln Inkubationsschalen in Aluminiumfolie durchgeführt werden. </li><li> Dekantier-Antikörperlösung und Waschen der Membran 3 x 5 min mit TBS / T bei Raumtemperatur schaukeln. </li><li> Erwerben Bild der Membran unter Verwendung von Li-Cor Odyssey CLx und Bild Studio-Software (oder einem vergleichbaren bildgebenden Geräten und Software), entsprechend den Empfehlungen des Herstellers. </li><li> Nach Abbilden Membran inkubieren der Membran mit einem primären Antikörper, der spezifisch für einen Lasting Kontrollprotein in 1% Magermilch in TBS / T für 1 Stunde bei Raumtemperatur schaukeln. </li><li> Dekantier-Antikörperlösung und Waschen der Membran 3 x 5 min mit TBS / T bei Raumtemperatur schaukeln. </li><li> Dazu werden die Membranen mit geeigneten Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörpers in 1% Magermilch in TBS / T für 1 Stunde bei Raumtemperatur schaukeln. </li><li> Dekantier-Antikörperlösung und Waschen der Membran 3 x 5 min mit TBS / T bei Raumtemperatur schaukeln. </li><li> Erwerben Bild der Membran unter Verwendung von Li-Cor Odyssey CLx und Bild Studio-Software (oder einem vergleichbaren bildgebenden Geräten und Software), entsprechend den Empfehlungen des Herstellers. </li></ol></li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die hier vorgestellte Methode erlaubt die schnelle Bestimmung und biochemischen Bestätigung genetischen Erfordernisse für den Proteinabbau in Hefezellen. Diese Experimente unterstreichen den Nutzen und die Kraft der Hefe als Modell eukaryotischen Organismus (mehrere ausgezeichnete Bewertungen von Hefe Biologie und Zusammenstellungen von Protokollen für die Handhabung, Speicherung und Manipulation von Hefezellen (zB 41 bis 44) sind für die Ermittler neue für den Organismus verfügbar). Die Techni...

Selektive Proteinabbau ist für eukaryontische Leben und veränderten Proteinabbau trägt zu einer Reihe von Erkrankungen, einschließlich verschiedene Arten von Krebs, neurodegenerativen Erkrankungen, Herz-Kreislaufkrankheiten und Mukoviszidose 1-5. Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS), die selektive Proteinabbau katalysiert, ist eine aufstrebende therapeutisches Ziel für diesen Bedingungen 10.6. Ubiquitin-Ligase kovalent an Polymere der 76-Aminosäure-Ubiquitin an Proteine ​​11. Proteine, die mit Polyubiquitinketten markiert wurden, werden erkannt und durch die ~ 2,5 Megadalton 26S Proteasom proteolysiert 12. Studien im Modell eukaryotischen Organismus Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe) initiiert wurden grund bei der Aufklärung von Proteinabbaumechanismen in eukaryotischen Zellen. Der erste Beweis physiologischen Substrat der USV war die Hefe Transkriptionsrepressor MATα2 13, 14, und viele hoch konservierte Komponenten des UPS wurden zuerst identifiziert oder gekennzeichnet Hefe (zB 15-26). Entdeckungen in diesem vielseitigen und genetisch manipulierbaren Modellorganismus hergestellt werden wahrscheinlich weiterhin wichtige Einblicke in konservierten Mechanismen des Ubiquitin-vermittelten Abbau liefern. Anerkennung und Abbau der meisten UPS Substrate erfordern die konzertierte Aktion von mehreren Proteinen. Daher ist ein wichtiges Ziel bei der Charakterisierung des geregelten Abbau einer bestimmten instabilen Protein die genetischen Erfordernisse für die Proteolyse zu bestimmen. Klassische Ansätze (zB Pulse-Chase und Cycloheximid-Chase-Experimente 27) zur Überwachung der Proteinabbau in Säugetier- oder Hefezellen sind mühsam und zeitaufwendig. Während diese Art von Methode bereitzustellen hochempfindliche Einrichtung zum Erfassen des Proteinabbaus für eine schnelle Analyse des Proteinabbaus oder Groß screeni sind sie nichtng für Mutationen, die den Proteinabbau zu verhindern. Hier wird ein Wachstum der Hefe-basierenden Assay zur schnellen Identifizierung von genetischen Erfordernisse für den Abbau von instabilen Proteinen präsentiert. Im Hefewachstum basiertes Verfahren zur Analyse von Protein-Abbau, ein instabiles Protein von Interesse (oder Abbausignals) fusioniert, im Rahmen, ein Protein, das für das Wachstum der Hefe unter bestimmten Umständen erforderlich ist. Das Ergebnis ist ein künstliches Substrat, das als ein mächtiges Werkzeug, um die genetischen Voraussetzungen des Proteinabbaus der instabilen Protein von Interesse festzustellen, dienen können. Zweckmßigerweise beherbergen am häufigsten verwendeten Labor Hefestämme eine Gruppe von Mutationen in Genen, die Stoffwechselenzyme in der Biosynthese von bestimmten Aminosäuren oder stickstoffhaltigen Basen (zB 20,28-30) beteiligt kodiert. Diese Enzyme sind für die zelluläre Proliferation in Abwesenheit von exogen bereitgestellt Metaboliten in deren Synthese der Enzyme beteiligt. Sometabolische Enzyme können so als Wachstumsbasis Reporter für den Abbau von instabilen Proteinen, denen sie fusioniert sind. Die genetischen Voraussetzungen für den Proteinabbau kann leicht erklärt werden, da Mutationen, die Proteolyse zu verhindern, können Zellen, die das Abbau Reporter, unter selektiven Bedingungen wachsen. Einen Wachstumsvorteil ist ein indirekter Hinweis auf eine bestimmte Mutation erhöht die Häufigkeit des Proteins von Interesse. Allerdings ist direkte biochemische Analyse erforderlich, um zu bestätigen, dass eine Mutation ermöglicht Wachstum durch erhöhte Protein-Ebene und nicht durch indirekte oder Artefakt Ursachen. Die Wirkung einer Mutation auf Proteinmenge kann durch Western-Blot-Analyse der Steady-State-Protein-Spiegel in den Zellen, und tun nicht die bestimmte Mutation beherbergen bestätigt werden. Ein Verfahren für die schnelle und effiziente Gewinnung von Hefeproteinen (sequentielle Inkubation der Hefezellen mit Natriumhydroxid und Probenpuffer) in einer geeigneten Formfür die Analyse durch Western-Blot wird ebenfalls vorgestellt 31. Zusammen stellen diese Experimente ermöglichen die schnelle Identifizierung von Kandidatenregulatoren der Proteinabbau.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator&#39;s laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator&#39;s laboratory.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-amino-1H-1,2,4-triazole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC264571000</td>
			<td>Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088726001</td>
			<td>May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1X Laemmli sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable borosilicate glass tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-32</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180)</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>51028068</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td>M1053-0450</td>
			<td>Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td>M1053-4004</td>
			<td>For use with tube roller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1581.001</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman Neo P8x200N, 20-200 &#956;l</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F14403</td>
			<td>Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman Neo P8x20N, 2-20 &#956;l</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F14401</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate imaging system (e.g. 
			Gel Doc XR+ System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8195</td>
			<td>A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5427 000.216&#160;</td>
			<td>Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 mL microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-Place</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>F-35-6-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.205</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22364120</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog Dri-Bath Heater</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1172011AQ</td>
			<td>Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>9140-01</td>
			<td>Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td>Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>459250</td>
			<td>Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21065</td>
			<td>Will vary by lab and application</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

growth-based determination and biochemical confirmation of genetic requirements for protein degradation in saccharomyces cerevisiae

Geregelten Proteinabbau ist entscheidend für praktisch jede Zellfunktion. Vieles von dem, was über die molekularen Mechanismen und genetischen Erfordernisse für eukaryotische Proteinabbau bekannt wurde zunächst in Saccharomyces cerevisiae hergestellt. Klassische Analysen der Proteinabbau haben biochemische Pulse-Chase und Cycloheximid-Chase-Methoden verlassen. Während diese Techniken empfindliche Mittel zur Beobachtung des Proteinabbaus sind mühsam, zeitaufwendig und niedrigem Durchsatz. Diese Ansätze sind nicht geeignet, um eine schnelle und großflächige Screening auf Mutationen, die den Proteinabbau zu verhindern. Hier wird ein Wachstum der Hefe-basierenden Assay für die leichte Identifizierung von genetischen Erfordernisse für den Proteinabbau beschrieben. In diesem Test wird ein Reporterenzym für das Wachstum unter bestimmten Selektionsbedingungen erforderlich, um ein instabiles Protein fusioniert ist. Zellen, denen das endogene Reporter-Enzym exprimieren, aber das Fusionsprotein unter sele wachsenctive Bedingungen nur, wenn das Fusionsprotein stabilisiert ist (dh, wenn der Proteinabbau gefährdet ist). Bei dem hier beschriebenen Wachstumstest werden Verdünnungsreihen von Wildtyp und mutierten Hefezellen ein Plasmid ein Fusionsprotein kodiert, auf selektiven und nicht-selektiven Medium entdeckt. Wachstum unter selektiven Bedingungen entspricht Abbau Beeinträchtigung von einer bestimmten Mutation. Erhöhte Proteinmenge sollte biochemisch bestätigt werden. Ein Verfahren zur schnellen Extraktion von Hefe-Proteinen in einer für die Elektrophorese und Western-Blotting Form wird auch gezeigt. Ein Wachstum basierende Auslesen für die Proteinstabilität, kombiniert mit einer einfachen Protokoll für die Proteinextraktion zur biochemischen Analyse, erleichtert die schnelle Identifizierung von genetischen Erfordernisse für den Proteinabbau. Diese Techniken können angepaßt, um den Abbau einer Vielzahl von kurzlebigen Proteinen zu überwachen. In dem dargestellten Beispiel des HIS3-Enzym, das für die Biosynthese von Histidin erforderlich ist, fusioniertum deg1 -Sec62. deg1 -Sec62 ist für den Abbau gezielt nach der aberrant die Endoplasmatischen Retikulum Translokon einrastet. Zellen, die deg1 -Sec62-His3 konnten unter selektiven Bedingungen wachsen, wenn das Protein stabilisiert wurde.

Diese Methodik zu veranschaulichen, hat das HIS3-Enzyms zu dem Carboxy-Terminus des Modells endoplasmatischen Retikulum (ER) assoziierte Abbau fusioniert (ERAD) -Substrat deg1 -Sec62 (2A) zu deg1 -Sec62-His3 schaffen (Figur 3) . deg1 -Sec62 eine Gründungsmitglied einer neuen Klasse von ERAD Substrate, die folgenden persistenten, anomale Verbindung mit dem Translokon ausgerichtet sind, wird der Kanal in erster Linie für die Bewegung Proteine ​​durch die E...

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Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Growth-basierte Bestimmung und biochemische Bestätigung der genetischen Voraussetzungen für Proteinabbau in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

growth-based-determination-biochemical-confirmation-genetic

Research

JoVE Journal

Biology

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

9.7K Aufrufe.  Ball State University. This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Serie: Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Präparation Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Forschung

Biologie

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray-Analyse für Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Eine Fluoreszenz-Mikroskopie Assay zur Überwachung Mitophagy in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Expression und Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulatorprotein in Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Biochemische und High Throughput Mikroskopische Beurteilung der Fettmasse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Gekoppelt Assays zur Überwachung Proteinrückfaltung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Die Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembran Regulator-Protein in Ausgedrückt<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.