Diese Arbeit wurde von der National Center for Research Resources und der National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, durch Zuschuss UL1TR000124 (FW) unterstützt; die Felix &amp; Mildred Yip Stiftungsprofessur und die Barnes Familie Fonds (zu DTWW), dem National Institute of Dental und kraniofaziale Forschung der National Institutes of Health unter Preis Anzahl T90DE022734 (MT). Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.

1. Magnetic Bead-basierten Exosom Extraction <ol><li> Pipettieren gut gemischte Lösung von 5 &amp; mgr; l Streptavidin-beschichteten magnetischen Mikropartikeln in 495 ul phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) -Puffer in einem Mikrozentrifugenröhrchen, um die Perlen zu resuspendieren. Verwendung eines Magnetgestell Waschen und Resuspendieren der Kügelchen mit 500 ul PBS dreimal. Das Gestell ist eine Anordnung von Magneten auf der Seite einer Gehäuseeinheit, die die Probe-Mikrozentrifugenröhrchen halten kann. <ol><li> Für jede Waschanlage, lassen Sie uns zuerst die Rohre sitzen auf dem Rack für 1 min, und dann mit einem Pipettenspitze vorsichtig den Überstand Puffer ohne die Perlen zu stören. </li><li> Die Röhrchen auf einer regulären Zahnstange ohne Magnete an der Seite. Fügen Sie 500 ul PBS in die Rohre, und verwenden Sie die Pipette, um die Lösung und Perlen zusammen mischen. Dann legen Sie die Rohre wieder auf dem Magnetgestell wieder trennen Sie die Perlen aus der Lösung. </li><li> Führen Sie diese Entfernung der Puffer über Magnetisierung und Resuspension in PBS eininsgesamt dreimal. Dies führt eine erste Wasch der magnetischen Teilchen. </li></ol></li><li> Resuspendieren der Kügelchen in 490 &amp; mgr; l PBS-Puffer, mit dem Rohr auf dem nicht-magnetisierten Teil der Magnetgestell gestellt. Pipette 5 ul biotinylierten Maus-anti-Mensch-CD63-Antikörper mit 1,0 mg / ml Ausgangskonzentration in dem Gemisch von Perlen. Verwenden Sie die Pipette, um die Perlen und Antikörper in Lösung zu mischen. </li><li> Legen Sie die Reaktionsgefäße mit Perle und biotinyliertem Antikörper-Gemisch auf eine Probe-Rotator. Festlegen der Rotator Parametern für die Probe für reziproke Rotator Drehung bei 90 ° Neigung für 5 sec und Vibrieren bei 5ºC für 1 sec. Drehen der Probe-Perlen-Mischung Röhrchen bei diesen Parametern für 30 min bei RT. </li><li> Entfernen ungebundener Antikörper nach der Konjugation. <ol><li> Nach 30 Minuten Dreh bei RT, legen Sie die Rohre wieder in den Magnetträger für 5 min. </li><li> Führen Sie drei Wäschen von Perlen durch Entfernen der flüssigen Phase mit einer Mikropipette und wäscht mit 500 μ; L PBS. Nach dem dreifachen Waschen, resuspendieren die Perlen in 490 ul von Casein-PBS und auf den unmagnetisierten Teil des Racks. </li></ol></li><li> Exosom Extraktion mit Antikörper-beschichteten Perlen. <ol><li> Beschriften Sie jedes Rohr mit gezielten Proben-ID. Pipettieren Sie 10 ul-Probe von Serum oder Speichel in das Reaktionsgefäß. Verwenden Sie die Pipette, um die Probe und magnetischen Beads durch mehrmaliges Pipettieren mischen. </li><li> Die Röhrchen mit der Probe und anti-Mensch-CD63-Antikörper-Perlen auf Rotator und drehen für 2 h bei RT. Verwenden Sie die gleichen Rotator Parameter wie in Schritt 1.2 beschrieben. </li><li> Nach 2 h der Probe drehen, führen eine dreifache Wasch durch Magnetisieren getrennte Kügelchen aus der Lösung, Entfernung flüssiger Phase mit Mikropipette und Resuspendieren Perlen in 500 ul Tris-HCl-Puffer. Die erhaltenen Perlen sind jetzt auf die Exosomen gebunden und sind bereit für das elektrische Feld Release und Messung. </li></ol></li></ol> 2. Elektrisches Feld induzierte Freigegeben einnd Messung exosomalen Inhalt <ol><li> Erste Beschichtung von Elektroden mit GADPH Primer <ol><li> Anwenden eines Kunststoff auch eine Elektrodenanordnung, um eine Kreuzkontamination der einzelnen Elektroden zu verhindern. Für dieses Experiment wurde mit einem 16-Sensor-Elektrodenanordnung mit jeder Einheit Elektrode in der Anordnung, die aus einem Arbeits-, Gegen- und Bezugselektrode des nackten Gold. </li><li> Bereiten Sie eine Mischung aus Lager 100 nM DNA-Sonde, 0,3 M KCl und 10 mM Pyrrol durch Pipettieren Lager Reagenzien in ein Rohr mit hochreinem destilliertem Wasser. Gründlich mischen durch Vortexen. HINWEIS: Für diese Studie entspricht die DNA-Sonde so ausgewählt, daß der GAPDH Referenzgens, die bekanntlich innerhalb von Exosomen vorliegen. Die Sondensequenz verwendet wird: 5&#39;-Biotin-AGGTCCACCACTGACACGTTG-3 &#39;. Verwenden Sie diese Mischung auf alle Elektroden. </li><li> Pipette 60 ul der Monomer-DNA Sondenmischung auf der Oberfläche jeder Goldelektrode. Untersuchen der Elektroden zu gewährleisten, dass eine ausreichende Abdeckung der Arbeits, counter und Referenzelektroden durch die flüssige Mischung. </li><li> Electropolymerize Monomer-Sondenmischung, um eine leitende Polymerschicht auf der Elektrodenoberfläche durch Anlegen einer zyklischen Rechteck (CSW) elektrische Feldprofil an die Elektrodenoberfläche zu schaffen. Dieses elektrische Feld besteht in der Anwendung 350 mV für 9 sec und sofort die Umstellung auf 950 mV für 1 s. Wenden Sie dieses zyklischen Rechteckprofil an die Elektrode 10 Zyklen, für insgesamt 100 sec der angelegten elektrischen Feldes. </li><li> Spülen Sensoroberfläche 3 mal mit destilliertem Wasser und mit Stickstoffgas trocken um Flüssigkeit von der Oberfläche der Elektrode zu entfernen. Sicherzustellen, daß die Flüssigkeit ordnungsgemäß von der Elektrode entfernt. </li></ol></li><li> Exosom Güter Entladen <ol><li> Last 5 ul 1 uM eines Detektors Sonde in 495 &amp; mgr; l der Kügelchen Exosom Gemisches und mit einer Pipette mischen. HINWEIS: Der Fühler ist ein DNA-Primer-Sequenz an eine Fluorescein-Molekül am 3&#39;-Ende konjugiert. Der Detektor probe Sequenz für diese Untersuchung verwendet wird, entspricht dem GAPDH mRNA in Exosomen gefunden. Die Sequenz des Fluorescein konjugierten Detektorsonde: 5&#39;-GCAGTGGGGACACGGAAGGCC-Fluorescein-3 &#39;. </li><li> Pipette 60 ul der Sonde und sicken Exosom Mischung auf eine Goldelektrode mit einer Magnetanordnung darunter. Diese Magnetanordnung besteht aus sechzehn 2,54 mm Durchmesser Neodymmagneten ausgerichtet, um den Arbeitselektroden des Sensors entsprechen. 2A veranschaulicht die Anordnung der Magnete und sicken exosome Lösung. </li><li> Sobald Probe auf der Elektrodenoberfläche geladen wird, gelten 20 Zyklen des CSW elektrisches Feld mit 9 sec bei -300 mV und 1 s bei +200 mV (200 s insgesamt). Die exosomalen Ladung, die freigesetzt wird, wird an die Primer auf der Oberfläche der Elektrode zu hybridisieren. Wenn Oberflächenmarker der Exosom sind Gegenstand der Untersuchung, überspringen Sie diesen Teil des Experiments. 2B veranschaulicht diesen Prozess. </li> &lt;li&gt; Wash-Off die ungebundenen Analyten auf der Elektrodenoberfläche durch dreifache Spülung der Elektrodenoberfläche mit destilliertem Wasser. Trocknen Sie die Elektrode mit Stickstoffgas. </li></ol></li><li> Reporter Antikörper und Readout <ol><li> Man gibt 60 &amp; mgr; l von 150 Einheiten / ml Anti-Fluorescein-Antikörper, konjugiert an Meerrettichperoxidase (HRP in 1: 1000 Verdünnung) in Casein / PBS verdünnt. </li><li> Verwenden eines ein elektrisches Feld angetrieben Konjugation an Komplex Anti-Fluorescein-HRP zu der Sonde Sandwich. Anwenden -200 mV für 1 Sekunde und +500 mV für 1 Sekunde für 5 Zyklen auf die Elektrodenoberfläche. 2A zeigt die Fänger- und Detektorsonde-Komplexe sowohl für ein Protein und Nukleinsäure-System. </li><li> Dreibettzimmer Waschsensoroberfläche mit destilliertem Wasser und mit Stickstoffgas trocken. </li><li> Nach dem Abwaschen von ungebundenem überschüssigem anti-Fluorescein-Antikörper, mit 60 &amp; mgr; l 3,3 &#39;, 5,5&#39;-Tetramethylbenzidin (TMB) -Substrat. Laden Sie dieses Substrat auf jede Sensorfläche mit einer Mehrkanalpipette. </li><li> Führen amperometrischen Auslesen des Stroms durch Messen des Elektrodenstroms bei -200 mV für 60 sec unter Verwendung einer elektro Potentiostat fähig gleichzeitige Messung von 16 Kanälen. 2C ist ein Beispiel der Stromverlauf während des Auslesens. </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52439/52439fig2highres.jpg" /> Abbildung 2. Komponenten Efirm Methode. (A) Verfahren zur Extraktion von Exosomen aus Biofluid mit anti-human CD63 beschichteten magnetischen Mikropartikeln und dann Entladen Exosom Fracht mit zyklischen Rechtecksignale an das Partikel-Exosom angewendet. (B) Schema der Elektrode Biosensor zum Nachweis von RNA / DNA / Protein-Targets von der frei Exosom verwendet. (C) repräsentatives Beispiel für amperometrische Auslesen aus dem Efirm Methodik, wo größere Stromstärke entspricht to höherer Gehalte eines Biomoleküls. Diese Zahl ist von Wei et al. 14 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52439/52439fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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M., Bailey, M. 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T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+exosomal+biomarker+by+electric+field-induced+release+and+measurement+(EFIRM).">Detection of exosomal biomarker by electric field-induced release and measurement (EFIRM).</a> Biosensors and Bioelectronics. 44, 115-121 (2013).</li></ol>

David Wong ist Mitbegründer RNAmeTRIX Inc., ein Molekulardiagnostik-Unternehmen. PeriRx LLC lizenziert geistigen Eigenschaften, die zur molekularen Diagnostik von RNAmeTRIX. David Wong ist Berater PeriRx.

Wie die Ergebnisse zeigen, sind anti-human CD63-beschichteten magnetischen Nanopartikel in der Lage, spezifisch einzufangen kleine Partikel, die eine Größe im Bereich von 70 bis 100 nm haben. Diese erfassten Teilchens entspricht der zuvor beobachteten Profil Exosomen. Weiterhin ist die Verwendung von Niederspannungs CSW nach der Abscheidung der Teilchen dargestellt, um sie von der Perlenoberfläche zu entfernen und verursachen DNA Abbauprofile ähnlich zu derjenigen eines herkömmlichen Lysepuffer basiertes Verfahren ...

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Errata: Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Exosom Forschung ist ein aufstrebendes Gebiet der Untersuchung, die Lipid-Mikrobläschen, die RNA-1, 2-DNA und Protein 3 Fracht transportieren sucht. Frühere Untersuchungen von Exosom Biologie haben, um die Identifizierung von Exosomen in Körperflüssigkeiten wie Blut 4, 5 Urin, Muttermilch 6, und Speichel 7 geführt. Studien haben gezeigt, dass Exosomen spielen eine Rolle bei verschiedenen zellulären Wege, fernmedi Kommunikation zwischen verschiedenen Systemen des Körpers 8. Aufgrund der Rolle in Exosomen der interzellulären Kommunikation spielt, wird die Hypothese aufgestellt, dass sie Biomolekül Targets (Protein, RNA und DNA) mit Krankheitszuständen korreliert verpacken. In vitro 3 und Tiermodellstudien 9 angezeigt, um diese Hypothese zu bestätigen. Bei der Untersuchung exosomalen Inhalte für die Entdeckung neuer Biomarker, ist es notwendig, eine Methode für die selektive Exosom Isolation von Körperflüssigkeiten zu entwickeln, induzierte expulsiauf der Ladung von Exosomen und Quantifizierung von Exosom Biomolekülen. In dem Umfang der vorliegenden Arbeit wird Exosomen als eine Struktur mit einem Durchmesser von ca. 70-100 nm und besitzen Oberflächenmarker CD63 definiert werden. Forscher in der Regel zunächst zu reinigen Exosomen durch Ultrazentrifugation 10 und dann exosomalen Inhalte durch den Einsatz von Lysepuffer Sätze zu verarbeiten. Usage Lysepuffer Verfahren erfordert Inkubationszeiten reichen von Minuten bis Stunden. Dieser Vorgang kann möglicherweise Schaden zufügen Exosom Ladung und führen zu einer Verschlechterung zu probieren. B. Speichel exosome RNA über Lysepuffer in die umgebende extrazelluläre Umgebung freigesetzt besitzt eine Halbwertszeit von weniger als 1 min, wodurch Messung exosomalen RNA post Lysepuffer eine besonders schwierige Aufgabe, ohne den Zusatz von Stabilisierungsreagenzien 11. Das compoundierte Wirkung der Zugabe verschiedener Reagenzien zur Lyse und Stabilisierung können Mittel, die erschweren einzuführen und stören die analysis von exosomalen Inhalt. Eine alternative Vorgehensweise kann hilfreich für die schnelle Entladung exosomalen Inhalt und sicher die Erhaltung der Ladung zur Charakterisierung sein. In dieser Arbeit schlagen wir die Verwendung eines nicht-gleichmäßiges elektrisches Feld für die Freigabe exosomalen Inhalt. Elektrofelder bekannt, um die Fähigkeit zu polarisieren und stören die Lipid-Doppelschicht, die Zellmembranen bildet durchzuführen. Unsere experimentelle Arbeit untersucht Nutzung ungleichmäßige zyklischen Rechtecksignale (CSW) zur Unterbrechung der microvesicle Struktur der Exosomen und Freigabe geführt Fracht. Bei dieser Methode werden Spannungen in der mehrere hundert Millivolt-Bereich, was bedeutet, dass die meisten Biomoleküle nicht gestört werden. Wir zeigen, dass die Verwendung einer zyklischen Rechteckwellen in der Lage ist, um die Freisetzung von Speichel exosome mRNA-Gehalt in das umgebende Fluidumgebung zu betätigen. Diese Version von exosomalen Inhalt ist nahtlos mit einem Elektrodensystem, die verwendet werden können, um die Biomarker-Expressionsniveaus zu quantifizieren integriert 12,13. Dieses vorgeschlagene Verfahren ermöglicht eine schnelle, empfindliche und Lysepuffer kostenlose Analyse Exosom Inhalt. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52439/52439fig1highres.jpg" /> Abbildung 1. Übersicht über Efirm-Workflow.. Die Efirm Verfahren wird im Großen und Ganzen in die drei Hauptphasen, die zur Reinigung und Analyse von Exosomen notwendig sind geteilt. Das CSW auf Basis exosomalen Content-Release und Analyseverfahren wird in Verbindung mit CD63-spezifischen magnetischen Mikrokügelchen für Exosom Isolierung verwendet. Diese CD63-Affinität Perlen ermöglichen die selektive Isolierung von Exosomen aus Speichelproben (und andere Körperflüssigkeiten). Nach der Inkubation und Gewinnung von Exosomen mit den magnetisierten Kügelchen werden die Perlen mit dem elektrochemischen Sensor-System für die CSW basierte Content-Release und Analyse Teil des Experiments migriert. Abbildung 1 gibt einen Überblick über die Arbeitfließt der Efirm Verfahren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="802">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:157px;">Company</td>
			<td style="width:132px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Genefluidics, USA</td>
			<td style="width:132px;">&#160;RS-1000-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">16X Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips</td>
			<td style="width:157px;">Genefluidics, USA</td>
			<td>SC1000-16X-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Biotinylated anti-human CD63 Antibody</td>
			<td style="width:157px;">Ancell, USA</td>
			<td style="width:132px;">215-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>65601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Neodynium Magnetics ( 1/10&#34; dia. x 1/32&#34; thick)</td>
			<td style="width:157px;">K&#38;J Magnetics, USA</td>
			<td>DH101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">Ultrapure Distilled Water</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies, USA</td>
			<td>10977-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Mettler Toldeo 3M KcL Solution</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific, USA</td>
			<td>1911512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Pyrrole</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:132px;">W338605-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments</td>
			<td style="width:157px;">Roche, Germany</td>
			<td>11426346910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:347px;">3, 3&#8242;, 5, 5&#8242; tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity)&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Neogen, Usa</td>
			<td style="width:132px;">330175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">Phosphate Buffered Saline Solution</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies, USA</td>
			<td align="right" style="width:132px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Casein/PBS</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific, USA</td>
			<td>37532</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of exosomal biomarker by electric field-induced release and measurement (efirm)

Exosomen sind mikrovesikulären Strukturen, die eine Vermittlerrolle in der interzellulären Kommunikation spielen. Es ist von Interesse, um die innere Ladung von Exosomen studieren, um festzustellen, ob sie Krankheit diskriminierenden Biomarker tragen. Zur Durchführung exosomalen Analyse ist es notwendig, ein Verfahren zur Extraktion und Analyse von Exosomen Ziel biofluids ohne Beschädigung der internen Inhalte zu entwickeln. Elektrisches Feld-induzierte Freisetzung und Messung (Efirm) ist ein Verfahren zur spezifischen extra Exosomen aus biologischen Flüssigkeiten, Entladen ihre Ladung, und testen ihre internen RNA / Proteingehalt. Verwendung eines anti-human CD63 spezifische Antikörper magnetische Mikroteilchen werden Exosomen zuerst aus Biofluiden fällt. Nach der Extraktion, Niederspannungs-Elektro zyklischen Rechtecksignale (CSW) angewendet, um die Vesikelmembran stören und Fracht entladen. Der Inhalt der Exosom, mit DNA-Primer oder Antikörper auf einer Elektrodenoberfläche für qua immobilisierten hybridisiertenntification molekularer Inhalte. Die Efirm Methode ist für die Extraktion von Exosomen und Entladen von Fracht zur Analyse ohne Lysepuffer vorteilhaft. Dieses Verfahren ist in der Lage, die spezifische Detektion von beiden RNA und Protein Biomarker Ziele in der Exosomen. Efirm extrahiert Exosomen speziell auf ihre Oberflächenmarker basiert im Gegensatz zur Größe basierte Techniken. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und Assay zeigen die Funktionalität des Verfahrens für die Exosom Erfassung und Analyse. Die Efirm Methode wurde die Analyse von 9 Mäusen mit menschlichen Lungenkrebs H640-Zellen injiziert (eine Zelllinie transfiziert, um die Exosom Marker menschlichen CD63-GFP exprimieren) um ihre exosome Profil gegen 11 Mäusen, die Kochsalzlösungskontrollen getestet exosomalen. Erhöhte exosomalen Biomarker (Referenz-Gen GAPDH und Proteinoberflächenmarker CD63 Menschen-GFP) gefunden für das H640 injizierten Mäusen in beiden Serum und Speichelproben. Außerdem saliva und Serumproben wurde gezeigt, dass die Linearität (R = 0,79) haben. Diese Ergebnisse lassen auf die Lebensfähigkeit der Speichel exosome Biomarker zum Nachweis von distalen Krankheiten.

Validierung Exosom Erfassung von Perlen Mit TEM Isolierung der Exosomen aus Speichel unter Verwendung von Anti-Mensch-CD63 magnetischen Kügelchen wurde folgender Extraktionsvorschrift unter Verwendung der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bestätigt. TEM zeigt magnetische Beads mit 70-100 nm Granulat unmittelbar benachbarten (siehe 3A und 3B), was mit der bekannten Profil der Exosomen. Keine 70-100 nm Granulat wurde für die magnetis...

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Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

Der Nachweis von exosomalen Biomarker von Electric Field-induzierte Freisetzung und Messung (Efirm)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

detection-exosomal-biomarker-electric-field-induced-release

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

18.4K Aufrufe.  University of California, Los Angeles. Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves. 

Serie: Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to the complexity of development on alternate platforms. BioScale's proprietary Acoustic Membrane MicroParticle (AMMP) technology allows sandwich immunoassays to be easily developed for use on the ViBE platform, providing better sensitivity, reproducibility, and automated operation. Provided as an example, this protocol outlines the procedure for developing a custom Chinese Hamster Ovary- Host Cell Protein (CHO-HCP) assay. The general principles outlined here can be followed for the development of a wide variety of immunoassays.
An AMMP assay measures antigen concentration by measuring changes in oscillation frequency caused by the binding of microparticles to the sensor surface to calculate. It consists of four major components: (1) a cartridge that contains a functionalized eight sensor chip (2) antibody labeled magnetic microparticles, (3) hapten tagged antibody that binds to the surface of the functionalized chip (4) samples containing the antigen of interest. BioScale's biosensor is a resonant device that contains eight individual membranes with separate fluidic paths. The membranes change oscillation frequency in response to mass accumulating on the surface and this frequency change is used to quantitate the amount of added mass.
To facilitate use in a wide variety of immunoassays the sensor is functionalized with an anti-hapten antibody. Assay specific antibodies are modified through the covalent conjugation of a hapten tag to one antibody and biotin to the other. The biotin label is used to bind the antibody to streptavidin coupled magnetic beads which, in combination with the hapten-tagged antibody, are used to capture the analyte in a sandwich. The complex binds to the chip through the anti-hapten/hapten interaction. At the end of each assay run the sensors are cleaned with a dilute acid enabling the sequential analysis of columns from a 96-well plate.
Here, we present the method for developing a custom CHO-HCP AMMP assay for bioprocess development. Developing AMMP assays or modifying existing assays into AMMP assays can provide better performance (reproducibility, sensitivity) in complex samples and reduced operator time. The protocol shows the steps for development and the discussion section reviews representative results. For a more in-depth explanation of assay optimization and customization parameters contact BioScale. This kit offers generic bioprocess development assays such as Residual Protein A, Product titer, and CHO-HCP.

Development of custom assays on the ViBE platform for more sensitive, reproducible, automated results in complex matrices is described. The universal cartridge allows assays to be easily adapted for use with custom assays. This versatility enables rapid development and validation of novel assays or automated versions of existing manual assays, exemplified in this video.

Entwickeln von benutzerdefinierten Chinesischen Hamsters-Wirtszellprotein Assays mit Akustikvlies Mikropartikeltechnologie

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Forschung

Biotechnik

Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium. We have developed tissue surface tensiometry (TST) specifically to measure the surface free energy of interaction between cells. The biophysical concepts underlying TST have been previously described in detail1,2. The method is based on the observation that mutually cohesive cells, if maintained in shaking culture, will spontaneously assemble into clusters. Over time, these clusters will round up to form spheres. This rounding-up behavior mimics the behavior characteristic of liquid systems. Intercellular binding energy is measured by compressing spherical aggregates between parallel plates in a custom-designed tissue surface tensiometer. The same mathematical equation used to measure the surface tension of a liquid droplet is used to measure surface tension of 3D tissue-like spherical aggregates. The cellular equivalent of liquid surface tension is intercellular binding energy, or more generally, tissue cohesivity. Previous studies from our laboratory have shown that tissue surface tension (1) predicts how two groups of embryonic cells will interact with one another1-5, (2) can strongly influence the ability of tissues to interact with biomaterials6, (3) can be altered not only through direct manipulation of cadherin-based intercellular cohesion7, but also by manipulation of key ECM molecules such as FN8-11 and 4) correlates with invasive potential of lung cancer12, fibrosarcoma13, brain tumor14 and prostate tumor cell lines15. In this article we will describe the apparatus, detail the steps required to generate spheroids, to load the spheroids into the tensiometer chamber, to initiate aggregate compression, and to analyze and validate the tissue surface tension measurements generated.

We describe a method of measuring binding energy, expressible as tissue surface tension, between cells within 3D tissue-like aggregates. Differences in tissue surface tension have been demonstrated to correlate with invasiveness of lung, muscle, and brain tumors, and are fundamental determinants of establishing spatial relationships between different cell types.

Die Messung der Aggregate Zusammenhalt durch Gewebeoberfläche Tensiometrie

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium.  We ...

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the central nervous system1,2. These endogenous EFs are generated by cellular regulation of ionic transport combined with the electrical resistance of cells and tissues. It has been reported that applied EF treatment can promote functional repair of spinal cord injuries in animals and humans3,4. In particular, EF-directed cell migration has been demonstrated in a wide variety of cell types5,6, including neural progenitor cells (NPCs)7,8. Application of direct current (DC) EFs is not a commonly available technique in most laboratories. We have described detailed protocols for the application of DC EFs to cell and tissue cultures previously5,11. Here we present a video demonstration of standard methods based on a calculated field strength to set up 2D and 3D environments for NPCs, and to investigate cellular responses to EF stimulation in both single cell growth conditions in 2D, and the organotypic spinal cord slice in 3D. The spinal cordslice is an ideal recipient tissue for studying NPC ex vivo behaviours, post-transplantation, because the cytoarchitectonic tissue organization is well preserved within these cultures9,10. Additionally, this ex vivo model also allows procedures that are not technically feasible to track cells in vivo using time-lapse recording at the single cell level. It is critically essential to evaluate cell behaviours in not only a 2D environment, but also in a 3D organotypic condition which mimicks the in vivo environment. This system will allow high-resolution imaging using cover glass-based dishes in tissue or organ culture with 3D tracking of single cell migration in vitro and ex vivo and can be an intermediate step before moving onto in vivo paradigms.

This protocol demonstrates methods used to establish 2D and 3D environments in custom-designed electrotactic chambers, which can track cells in vivo/ex vivo using time-lapse recording at the single cell level, in order to investigate galvanotaxis/electrotaxis and other cellular responses to direct current (DC) electric fields (EFs).

Electric Field-gesteuerte gerichtete Wanderung von neuralen Vorläuferzellen in 2D-und 3D-Umgebungen

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with conventional one-sample-at-a-time synthesis techniques, a more recent high-throughput approach has been developed enabling the synthesis and testing of large libraries of polyanhydrides1. This will facilitate more efficient optimization and design process of these biomaterials for drug and vaccine delivery applications. The method in this work describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries. In this robotically operated method (Figure 1), linear actuators and syringe pumps are controlled by LabVIEW, which enables a hands-free automated protocol, eliminating user error. Furthermore, this method enables the rapid fabrication of micro-scale polymer libraries, reducing the batch size while resulting in the creation of multivariant polymer systems. This combinatorial approach to polymer synthesis facilitates the synthesis of up to 15 different polymers in an equivalent amount of time it would take to synthesize one polymer conventionally. In addition, the combinatorial polymer library can be fabricated into blank or protein-loaded geometries including films or nanoparticles upon dissolution of the polymer library in a solvent and precipitation into a non-solvent (for nanoparticles) or by vacuum drying (for films). Upon loading a fluorochrome-conjugated protein into the polymer libraries, protein release kinetics can be assessed at high-throughput using a fluorescence-based detection method (Figures 2 and 3) as described previously1. This combinatorial platform has been validated with conventional methods2 and the polyanhydride film and nanoparticle libraries have been characterized with 1H NMR and FTIR. The libraries have been screened for protein release kinetics, stability and antigenicity; in vitro cellular toxicity, cytokine production, surface marker expression, adhesion, proliferation and differentiation; and in vivo biodistribution and mucoadhesion1-11. The combinatorial method developed herein enables high-throughput polymer synthesis and fabrication of protein-loaded nanoparticle and film libraries, which can, in turn, be screened in vitro and in vivo for optimization of biomaterial performance.

This method describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries.

Kombinatorische Synthese von und High-Throughput-Protein Release von Polymer Film-und Nanopartikel-Bibliotheken

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is subject to chemical and mechanical signals, and the mechanisms by which it senses and responds to mechanical signals are poorly understood. Elucidating the role of forces in cell maturation will enable the design of scaffolds that can promote cell adhesion and cytoskeletal coupling to the substrate, and therefore improve the capacity of different neuronal types to regenerate after injury.
Here, we describe a method to apply simultaneous force spectroscopy measurements during laser induced cell lesion. We measure tension release in the partially lesioned axon by simultaneous interferometric tracking of an optically trapped probe adhered to the membrane of the axon. Our experimental protocol detects the tension release with piconewton sensitivity, and the dynamic of the tension release at millisecond time resolution. Therefore, it offers a high-resolution method to study how the mechanical coupling between cells and substrates can be modulated by pharmacological treatment and/or by distinct mechanical properties of the substrate.

We measured the tension release in an axon that was partially lesioned with a laser dissector by simultaneous force spectroscopy measurement performed on an optically-trapped probe adhered to the membrane of the axon. The developed experimental protocol evaluates the axon adhesion to the culture substrate.

Messung der Spannungsstifte Während Laser Induced Axon Läsion Axonal Haftung auf dem Substrat und auswerten zu Pikonewton Millisekundenauflösung

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Optische Detektion von<em&gt; E. coli</em&gt; Bakterien durch Mesoporous Silicon Biosensoren

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. In this article we outline a valid and reliable technique to prepare and test permeabilized skeletal muscle fibers in vitro.

Die Messung der isometrischen Maximalkraft von permeabilisierten Skelettmuskelfasern generiert

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Fabrication of a Dipole-assisted Solid Phase Extraction Microchip for Trace Metal Analysis in Water Samples

This paper describes a fabrication protocol for a dipole-assisted solid phase extraction (SPE) microchip available for trace metal analysis in water samples. A brief overview of the evolution of chip-based SPE techniques is provided. This is followed by an introduction to specific polymeric materials and their role in SPE. To develop an innovative dipole-assisted SPE technique, a chlorine (Cl)-containing SPE functionality was implanted into a poly(methyl methacrylate) (PMMA) microchip. Herein, diverse analytical techniques including contact angle analysis, Raman spectroscopic analysis, and laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry (LA-ICP-MS) analysis were employed to validate the utility of the implantation protocol of the C-Cl moieties on the PMMA. The analytical results of the X-ray absorption near-edge structure (XANES) analysis also demonstrated the feasibility of the Cl-containing PMMA used as an extraction medium by virtue of the dipole-ion interactions between the highly electronegative C-Cl moieties and the positively charged metal ions.

The fabrication protocol of a dipole-assisted solid phase extraction microchip for the trace metal analysis is presented.

Die Herstellung einer Dipole-unterstützte Festphasenextraktion Microchip für die Spurenanalyse in Wasserproben

This paper describes a fabrication protocol for a dipole-assisted solid phase extraction (SPE) microchip available for trace metal analysis in water ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Nachweis von Endotoxin im Nano-Rezepturen mit Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Electric-Field-Induced Neural Precursor Cell Differentiation in Microfluidic Devices

Physiological electric fields (EF) play vital roles in cell migration, differentiation, division, and death. This paper describes a microfluidic cell culture system that was used for a long-term cell differentiation study using microscopy. The microfluidic system consists of the following major components: an optically transparent electrotactic chip, a transparent indium-tin-oxide (ITO) heater, a culture media-filling pump, an electrical power supply, a high-frequency power amplifier, an EF multiplexer, a programmable X-Y-Z motorized stage, and an inverted phase-contrast microscope equipped with a digital camera. The microfluidic system is beneficial in simplifying the overall experimental setup and, in turn, the reagent and sample consumption. This work involves the differentiation of neural stem and progenitor cells (NPCs) induced by direct current (DC) pulse stimulation. In the stem cell maintenance medium, the mouse NPCs (mNPCs) differentiated into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes after the DC pulse stimulation. The results suggest that simple DC pulse treatment could control the fate of mNPCs and could be used to develop therapeutic strategies for nervous system disorders. The system can be used for cell culture in multiple channels, for long-term EF stimulation, for cell morphological observation, and for automatic time-lapse image acquisition. This microfluidic system not only shortens the required experimental time, but also increases the accuracy of control on the microenvironment.

In this study, we present a protocol for the differentiation of neural stem and progenitor cells (NPCs) solely induced by direct current (DC) pulse stimulation in a microfluidic system.

Elektrisch-Feld-induzierte neuronale Vorläuferzelldifferenzierung in mikrofluidischen Geräten

Physiological electric fields (EF) play vital roles in cell migration, differentiation, division, and death. This paper describes a microfluidic cell ...