この作品は、（FW）のグラントUL1TR000124を通じて、トランスレーショナル科学、国立衛生研究所を進めるための研究資源のための国立センター、国立センターによってサポートされていました。フェリックス＆ミルドレッド·イップ寄附教授職と（DTWWへ）バーンズファミリー基金、（MT）の賞数T90DE022734下の国立衛生研究所の歯科·頭蓋顔面研究所研究所。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。

1.磁気ビーズベースのエキソソームの抽出<ol><li>ビーズを再懸濁し微小遠心管にリン酸緩衝生理食塩水（PBS）バッファーの495μlの中にストレプトアビジン被覆磁性微粒子を5μlのよく混合溶液をピペットで。磁気ラックを使用して3回洗浄し、500μlのPBSでビーズを懸濁します。ラックは、サンプル微小遠心管を保持することができる収納部側の磁石のアレイである。 <ol><li>各洗浄のために、最初のチューブは1分間のラックの上に座るし、その後慎重にビーズを乱すことなく上澄み液を除去するためのピペットチップを使用してみましょう。 </li><li>側の磁石せずに定期的なラックにチューブを置きます。チューブに500μlのPBSを追加し、一緒に解決し、ビーズを混合するために、ピペットを使用しています。その後、再び溶液からビーズを分離するための磁気ラック上に戻ってチューブを置く。 </li><li> PBS aの磁化と再懸濁を介してバッファのこの削除を実行します合計3回。これは、磁性粒子の最初の洗浄を行います。 </li></ol></li><li>磁気ラックの非磁化部分に配置されたチューブを、PBS緩衝液490μlの中にビーズを再懸濁する。ビーズの混合物中に1.0 mg / mlのストック濃度でビオチン化マウス抗ヒトCD63抗体のピペットで5μL。溶液中のビーズと抗体を混合するためにピペットを使用してください。 </li><li>サンプル回転子上のビーズとビオチン化抗体混合物を用いてマイクロチューブを置きます。 5秒間傾けると1秒間5℃で振動90°で相互の回転のためのサンプル回転子のための回転子のパラメータを設定します。 RTで30分間、これらのパラメータでサンプル·ビーズ混合管を回転させます。 </li><li>共役した後、未結合抗体を除去する。 <ol><li> RTで回転の30分に続いて、5分間のバック磁気ラック内のチューブを配置します。 </li><li>マイクロピペットを用いて、液相を除去することにより、ビーズの3回の洗浄を行い、500μで洗浄、PBSのリットル。トリプル洗浄後、490カゼイン-PBSのμLとラックの磁化されていない部分に所定の位置にビーズを再懸濁します。 </li></ol></li><li>抗体コートビーズを使用したエキソソーム抽出。 <ol><li>ターゲットを絞ったサンプルIDを各チューブにラベルを付けます。マイクロ遠心チューブに血清または唾液10μlのサンプルをピペットで。数回ピペッティングしてサンプルとした磁気ビーズを混合するためにピペットを使用してください。 </li><li>ローテーター上のサンプルと抗ヒトCD63抗体ビーズを有する管を配置し、室温で2時間回転させる。ステップ1.2で説明したのと同じ回転子パラメータを使用してください。 </li><li>回転サンプルの2時間に続いて、溶液からビーズを分離するために磁化するマイクロピペットで液相を除去し、トリス塩酸緩衝液500μlでビーズを再懸濁することにより、トリプル洗浄を行う。結果として得られるビーズは今エキソソームに結合させ、電界放出および測定のための準備ができているされている。 </li></ol></li></ol> 2.電界誘起リリースNDエキソソーム量の測定<ol><li> GADPHプライマーを有する電極の初期のプレコーティング<ol><li>プラスチックウェルに個別電極の交差汚染を防ぐために電極アレイを適用する。この実験では、裸の金製の作業、カウンタ、および基準電極からなるアレイ内のそれぞれの単位電極16センサ電極アレイを使用する。 </li><li>超純蒸留水でチューブに株式試薬をピペッティングすることにより100 nMのDNAプローブ、0.3 MのKCl、および10mMのピロールの原料混合物を準備します。ボルテックスで完全に混合。 注：この研究のために選択されたDNAプローブは、エキソソーム内に存在することが知られているGAPDHを参照遺伝子に対応する。使用したプローブ配列は5&#39;-ビオチンAGGTCCACCACTGACACGTTG-3 &#39;。すべての電極上でこの混合物を使用してください。 </li><li>ピペットで各金電極の表面にモノマー-DNAプローブ混合物を60μl。作業、cは適切な範囲があることを保証するために電極を調べる液体混合物によるounter、及び基準電極。 </li><li> Electropolymerizeモノマープローブの混合物は、電極表面に周期的な方形波（CSW）電界プロファイルを適用することにより、電極表面上に導電性高分子層を作成する。この電界は9秒350 mVのを適用すると、すぐに1秒間950 mVのへの切り替えで構成されています。印加電界の100秒、合計10サイクルの電極は、この環状の方形波プロファイルを適用する。 </li><li>電極の表面から液体を除去するために蒸留水および窒素ガスで乾燥して、センサ表面を3回すすぐ。液体が適切に電極から削除されていることを確認してください。 </li></ol></li><li>エキソソーム貨物アンロード<ol><li>ビーズ - エキソソーム複雑な混合物の495μLにロード検出プローブの1μMの5μlのと混合するピペットを使用しています。 注記：検出プローブは、3 &#39;末端にフルオレセイン分子に結合DNAプライマー配列である。検出器PROBこの研究のために使用される電子シーケンスはエキソソーム内にあるGAPDH mRNAに対応している。フルオレセイン結合検出プローブの配列は以下のとおりである：5&#39;-GCAGTGGGGACACGGAAGGCC-フルオレセイン-3 &#39;。 </li><li>ピペットの下に磁石アレイと金電極表面へのプローブとビーズ - エキソソーム複雑な混合物60μlの。この磁石アレイは、センサの作用電極に対応するように整列16 2.54ミリメートルの直径のネオジム磁石で構成されています。 図2（a）は、磁石とビーズエキソソームソリューションの配置を示している。 </li><li>サンプルは電極表面にロードされると、-300 Mvで9秒、200 MV（200秒の合計）で1秒でCSW電界の20サイクルを適用します。解放されるエキソソーム貨物は電極の表面にプライマーにハイブリダイズするであろう。エキソソームの表面マーカーは、調査の対象である場合、実験のこの部分をスキップする。 図2Bは、このプロセスを示している。 </li> &lt;李&gt;ウォッシュオフ三重蒸留水で電極表面を洗浄することにより、電極表面に結合していない分析物。窒素ガスで電極を乾燥させる。 </li></ol></li><li>レポーター抗体および読み出し<ol><li> （：1,000希釈1にHRP）カゼイン/ PBSで希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼに結合し150単位/ mlの抗フルオレセイン抗体60μlのを追加します。 </li><li>プローブサンドイッチに複雑な抗フルオレセインHRPに電界駆動型共役を使用してください。電極表面に5サイクルのために1秒1秒、500 mVのために-200 mVのを適用します。 図2（a）は、タンパク質および核酸システムの両方のための捕捉および検出プローブ複合体を示しています。 </li><li>蒸留水と窒素ガスとの乾燥を使用してトリプル洗浄センサー表面。 </li><li>未結合の過剰抗フルオレセイン抗体の洗浄除去に続いて、3,3 &#39;、5,5&#39;-テトラメチルベンジジン（TMB）基質の60μlを添加する。マルチチャンネルピペットを使用して、各センサー表面上に、この基板をロードします。 </li><li> 16チャネルの同時測定が可能な電気化学ポテンショスタットを用いて60秒間-200 Mvで電極電流を測定することにより、現在の電流測定読み出しを実行します。 図2Cは、読み出し時の電流プロファイルの一例である。 </li></ol></li></ol><img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52439/52439fig2highres.jpg" /> EFIRM法の図2のコンポーネント。（A）抗ヒトCD63被覆した磁性微粒子を使用して、生体液からエキソソームを抽出した後、粒子-エキソソーム複雑に適用される周期的な方形波を用いたエキソソーム貨物をアンロードする方法。解放エキソソームからRNA / DNA /タンパク質標的を検出するために使用される電極バイオセンサーの（B）のスキーム。 （C）より大きい電流の大きさをtに対応EFIRM法、電流測定からの読み出しの代表例生体分子のより高いレベルoをこの図は、Wei らからである。14 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52439/52439fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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デビッド·ウォンはRNAmeTRIX社、分子診断会社の共同創設者である。 PeriRx LLCはRNAmeTRIXから分子診断に関連する知的財産のサブライセンス。デビッド·ウォンはPeriRxにコンサルタントです。

結果が示すように、抗ヒトCD63被覆した磁性ナノ粒子は、具体的には70〜100ナノメートルの範囲のサイズを有する小さな粒子を捕捉することができる。この捕獲粒子は、エキソソームの以前に観察されたプロファイルと一致している。さらに、粒子の捕捉以下の低電圧CSWの使用は、ビーズ表面から削除し、貨物放出のための伝統的な溶解緩衝液ベースの方法と類似のDNAの分解プロフィールを引?...

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52439">Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)</a>. The disclosures were updated.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52439">Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)</a>.

Errata: Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

エキソソーム研究は、RNA 1、DNA 2、およびタンパク質3貨物を運ぶ脂質微小胞を調べ、調査の新興分野である。エキソソーム生物学の以前の研究は、血液4、尿5、母乳6、および唾液7などの生体液中のエキソソームの同定につながった。研究では、遠隔体8の異なるシステム間の通信を瞑想、エキソソームは、異なる細胞経路に役割を果たすことが実証されている。ロールのエキソソームは細胞間コミュニケーションにおいて役割を果たすので、それらは疾患状態と相関して生体分子標的（タンパク質、RNA、およびDNA）をパッケージ化することができると仮定される。 インビトロ 3および動物モデル9の研究は、この仮説を裏付けるように見える。バイオマーカー発見のためのエキソソームコンテンツを調査において、それは生体液から選択エキソソームを単離するための方法論を開発することが必要である、誘起expulsiエキソソームからの貨物、およびエキソソーム生体分子の定量化の上で。この作業の範囲では、エキソソームは、構造体は、約70~100ナノメートルの直径を有し、表面マーカーCD63を有するとして定義される。 研究者は、通常、最初の超遠心分離10によってエキソソームを精製した後、溶解バッファーキットの使用を通じてエキソソームコンテンツを処理する。溶解緩衝液法の使用は、数分から時間の範囲のインキュベーション時間を必要とする。このプロセスは、潜在的にエキソソーム貨物を害する劣化をサンプリングする可能性がある。例えば、周囲の細胞外環境への溶解緩衝液を介して放出唾液エキソソームRNAは、エキソソームRNA溶解後の測定が安定化試薬11を添加せずに、特に困難な作業バッファ作る、1分間の下での半減期を有している。溶解および安定化のための様々な試薬を加えるの配合効果が複雑にエージェントを導入し、ANALYを妨害する可能性がエキソソームコンテンツのSIS。別のアプローチは、迅速にエキソソームコンテンツをアンロードし、安全に特徴づけのために貨物を保持するのに役立つことができる。 本研究では、エキソソーム内容物の放出のために不均一な電界の使用を提案する。電気フィールドが分​​極し、細胞膜を構成する脂質二重層を破壊する能力を運ぶことが知られている。私たちの実験的な作品は、エキソソームの微小胞の構造を破壊し、運ば貨物を解放するために、不均一な周期的な方形波（CSW）の使用方法を探ります。この方法は、ほとんどの生体分子が中断されないことを意味し、数百ミリボルトの範囲で電圧を使用しています。我々は、環状方形波の使用は、周囲の流体環境に唾液エキソソームのmRNA内容物の放出を作動することができることを実証する。エキソソームコンテンツのこのリリースは、シームレスに、バイオマーカーの発現レベルを定量するために使用することができ、電極システムに統合されている12,13。この提案された方法は、エキソソームコンテンツの迅速、高感度、および溶解バッファー無料で分析することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52439/52439fig1highres.jpg" /> EFIRMワークフロー図1.概要。。EFIRM法が広くエキソソームを精製し、分析するために必要な三つの主要段階に分けられる。 このCSWベースエキソソームコンテンツ放出および分析方法は、エキソソームを単離するためのCD63特異的磁気ビーズと組み合わせて使用​​される。これらのCD63-親和性ビーズは、唾液サンプル（および他の生体液）からのエキソソームの選択的な単離を可能に。インキュベーションおよび磁化ビーズを使用してエキソソームの抽出に続いて、ビーズは、 図1を参照 。内容物の放出実験の分析部をベースCSWための電気化学センサーシステムに移行作業の概要を示しているEFIRM方法のフローチャート。

<table><tbody><tr><td>Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface&amp;nbsp;</td><td>Genefluidics, USA</td><td>&amp;nbsp;RS-1000-16</td><td></td></tr><tr><td>16x Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips</td><td>Genefluidics, USA</td><td>SC1000-16X-B</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated anti-human CD63 Antibody</td><td>Ancell, USA</td><td>215-030</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Invitrogen, USA</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>Neodynium Magnetics (1/10&quot; dia. x 1/32&quot; thick)</td><td>K&amp;amp;J Magnetics, USA</td><td>DH101</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure Distilled Water</td><td>Life Technologies, USA</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>Mettler Toldeo 3 M KCl Solution</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>1911512</td><td></td></tr><tr><td>Pyrrole</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>W338605-100g</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments</td><td>Roche, Germany</td><td>11426346910</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;prime;,5,5&amp;prime;-tetramethylbenzidine substrate (TMB/H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, low activity)</td><td>Neogen, Usa</td><td>330175</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline Solution</td><td>Life Technologies, USA</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Casein/PBS</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>37532</td><td></td></tr></tbody></table>

detection of exosomal biomarker by electric field-induced release and measurement (efirm)

エキソソームは、細胞間コミュニケーションにおける仲介の役割を果たして微小胞構造体である。彼らは病気差別バイオマーカーを運ぶかどうかを決定するエキソソームの内部の貨物を研究するために重要である。エキソソーム分析を行うためには、内部コンテンツに損傷を与えることなく、標的生体液からエキソソームを抽出し、分析するための方法を開発する必要がある。 電界誘起放出および測定（EFIRM）は、特に、生体液からのエキソソームを抽出し、その積荷を降ろして、その内部RNA /タンパク質含有量を試験するための方法である。抗ヒトCD63特異的抗体磁性微粒子を用いて、エキソソームは、まず生体液から沈殿させる。抽出後、低電圧電気サイクリック方形波（CSW）は、小胞膜を破壊し、貨物搬出を引き起こすために適用される。エキソソームの内容は、資格でのために電極表面上に固定化されたDNAプライマーまたは抗体とハイブリダイズさせる分子コンテンツのntification。 EFIRM方法は、エキソソームを抽出し、溶解緩衝液なしの分析のために貨物をアンロードするために有利である。この方法は、エキソソームの両方のRNA及びタンパク質バイオマーカー標的の特異的な検出を行うことができる。サイズベースの技術とは対照的にEFIRMは、具体的には、それらの表面マーカーに基づいて、エキソソームを抽出する。 透過型電子顕微鏡（TEM）およびアッセイは、エキソソームキャプチャおよび分析のための方法の機能性を実証する。 EFIRM法は、生理食塩水コントロールを受けた11匹のマウスに対して彼らエキソソームプロファイルをテストするために、ヒト肺癌H640細胞を注射した9匹のマウス（エキソソームマーカー、ヒトCD63-GFPを発現するようにトランスフェクト細胞株）の分析をエキソソームに適用した。エキソソームのバイオマーカーのレベルの上昇（参照遺伝子GAPDHおよびタンパク質表面マーカーのヒトCD63-GFP）は、H640の両方の血清および唾液サンプルをマウスに注射するために見出された。さらに、SalIでvaの血清試料を、直線性（R = 0.79）を有することが実証された。これらの結果は、遠位疾患の検出のための唾液エキソソームのバイオマーカーの生存のために示唆している。

TEMを用いてビーズのエキソソームキャプチャの検証 抗ヒトCD63磁気ビーズを使用して、唾液からのエキソソームの単離は、透過型電子顕微鏡（TEM）画像を用いて抽出プロトコールに従って検証した。 TEMはすぐに、（ 図3A、および3B参照 ）は、隣接するエキソソームの既知のプロファイルと一致して70〜100 nmの顆粒とした磁気ビーズを...

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Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

電界誘起リリースおよび測定によるエキソソームのバイオマーカーの検出（EFIRM）

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

detection-exosomal-biomarker-electric-field-induced-release

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

18.4K ビュー.  University of California, Los Angeles. Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves. 

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Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released from many cell types and play a pivotal role in regulating cell-cell communication and a diverse range of biological processes. Many different methods for the characterization of EVs have been described. However, most of these methods have the disadvantage that the preparation and characterization of the samples are very time-consuming, or it is extremely difficult to analyze specific markers of interest due to their small size and due to the lack of discrete populations. While methods for analysis of EVs have been considerably improved over the last decade, there is still no standardized method for characterization of single EVs. Here, we demonstrate a semi-automated method for characterization of single EVs by fluorescence-based nanoparticle-tracking analysis. The protocol that is presented addresses the common problem of many researchers in this field and provides the complete workflow for rapid isolation of EVs and characterization with PKH67, a general cell membrane linker, as well as with specific surface markers such as CD63, CD9, vimentin, and lysosomal-associated membrane protein 1 (LAMP-1). The presented results show a high level of reproducibility, as confirmed by other methods, such as Western blotting. In the conducted experiments, we exclusively used EVs isolated from human serum samples, but this method is also suitable for plasma or other body fluids and can be adjusted for characterization of EVs from cell culture supernatants. Irrespective of the future progress of research on EV biology, the protocol that is presented here provides a rapid and reliable method for rapid characterization of single EVs with specific markers.

In this protocol, we describe the complete workflow for rapid isolation of extracellular vesicles from human whole blood and characterization of specific markers by fluorescence-based nanoparticle-tracking analysis. The presented results show a high level of reproducibility and can be adjusted to cell culture supernatants.

ナノ粒子追跡によるひと血中の細胞小胞単一の急速な蛍光特性評価

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

生化学

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have witnessed a tremendous increase in interest in EVs. EVs have been shown to play important roles in various physiological and pathological processes, including coagulation, immune responses, and cancer. In addition, EVs have potential as therapeutic agents, for instance as drug delivery vehicles or as regenerative medicine. Because of their small size (50 to 1,000 nm) accurate quantification and size profiling of EVs is technically challenging.
This protocol describes how tunable resistive pulse sensing (tRPS) technology, using the qNano system, can be used to determine the concentration and size of EVs. The method, which relies on the detection of EVs upon their transfer through a nano sized pore, is relatively fast, suffices the use of small sample volumes and does not require the purification and concentration of EVs. Next to the regular operation protocol an alternative approach is described using samples spiked with polystyrene beads of known size and concentration. This real-time calibration technique can be used to overcome technical hurdles encountered when measuring EVs directly in biological fluids.

Extracellular vesicles play important roles in physiological and pathological processes, including coagulation, immune responses, and cancer or as potential therapeutic agents in drug delivery or regenerative medicine. This protocol presents methods for the quantification and size characterization of isolated and non-isolated extracellular vesicles in various fluids using tunable resistive pulse sensing.

調整可能な抵抗パルスセンシングを使用して定量化し、細胞外小胞の大きさ、プロファイリング

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

生物工学

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC) Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective tyrosine kinase inhibitors (TKIs). To optimize the use of these TKIs, the discovery of new biomarkers for early detection and disease progression is mandatory. These plasma-isolated exosomes can be used as a non-invasive and repeatable way for the detection and follow-up of these biomarkers. One ml of plasma from 12 NSCLC patients, with different mutations and treatments (and 6 healthy donors as controls), were used as exosome sources. After RNAse treatment, in order to degrade circulating miRNAs, the exosomes were isolated with a commercial kit and resuspended in specific buffers for further analysis. The exosomes were characterized by western blotting for ALIX and TSG101 and by transmission electron microscopy (TEM) analysis, the standard techniques to obtain biochemical and dimensional data of these nanovesicles. Total RNA extraction was performed with a high yield commercial kit. Due to the limited miRNA-content in exosomes, we decided to perform retro-transcription PCR using an individual assay for each selected miRNA. A panel of miRNAs (30b, 30c, 103, 122, 195, 203, 221, 222), all correlated with NSCLC disease, were analyzed taking advantage of the remarkable sensitivity and specificity of Real-Time PCR analysis; mir-1228-3p was used as endogenous control and data were processed according to the formula 2-&#916;&#916;ct 13. Control values were used as baseline and results are shown in logarithmic scale.

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer NSCLC Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

This protocol describes the feasibility to perform miRNA profiling in exosomes, released in plasma of NSCLC patients, through a commercial exosome isolation kit with Proteinase K and RNAse treatments, in order to avoid circulating miRNAs contamination and evaluate their biomarker features in NSCLC.

定量PCRを通じて非小細胞肺癌（NSCLC）患者の血漿中のエキソソームのmiRNA解析：実行可能な液体生検ツール

The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective ...

医学

Using Nanoplasmon-Enhanced Scattering and Low-Magnification Microscope Imaging to Quantify Tumor-Derived Exosomes

Infected or malignant cells frequently secrete more exosomes, leading to elevated levels of disease-associated exosomes in the circulation. These exosomes have the potential to serve as biomarkers for disease diagnosis and to monitor disease progression and treatment response. However, most exosome analysis procedures require exosome isolation and purification steps, which are usually time-consuming and labor-intensive, and thus of limited utility in clinical settings. This report describes a rapid procedure to analyze specific biomarkers on the outer membrane of exosomes without requiring separate isolation and purification steps. In this method, exosomes are captured on the surface of a slide by exosome-specific antibodies and then hybridized with nanoparticle-conjugated antibody probes specific to a disease. After hybridization, the abundance of the target exosome population is determined by analyzing low-magnification dark-field microscope (LMDFM) images of the bound nanoparticles. This approach can be easily adopted for research and clinical use to analyze membrane-associated exosome biomarkers linked to disease.

Clinical translation of exosome-derived biomarkers for diseased and malignant cells is hindered by the lack of rapid and accurate quantification methods. This report describes the use of low-magnification dark-field microscope images to quantify specific exosome subtypes in small volume serum or plasma samples.

Nanoplasmon の散乱と低倍率の顕微鏡イメージングによる腫瘍由来エキソソームの定量化

Infected or malignant cells frequently secrete more exosomes, leading to elevated levels of disease-associated exosomes in the circulation. These exosomes ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

エキソソームの定量化とサイズの測定のための革新的方法

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

生物学

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving area of research. There are many different methods for EV isolation, each with distinct advantages and disadvantages that affect the downstream yield and purity of EVs. Thus, characterizing the EV prep isolated from a given source by a chosen method is important for interpretation of downstream results and comparison of results across laboratories. Various methods exist for determining the size and quantity of EVs, which can be altered by disease states or in response to external conditions. Nanoparticle tracking analysis (NTA) is one of the prominent technologies used for high-throughput analysis of individual EVs. Here, we present a detailed protocol for quantification and size determination of EVs isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma using a breakthrough technology for NTA representing major advances in the field. The results demonstrate that this method can deliver reproducible and valid total particle concentration and size distribution data for EVs isolated from different sources using different methods, as confirmed by transmission electron microscopy. The adaptation of this instrument for NTA will address the need for standardization in NTA methods to increase rigor and reproducibility in EV research.

We demonstrate how to use a novel nanoparticle tracking analysis instrument to estimate the size distribution and total particle concentration of extracellular vesicles isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma.

細胞外小胞の定量とサイズ決定のためのナノ粒子追跡解析

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular communication in various research fields; cancer biology, neuroscience, and drug delivery. Many EV uptake assays have been reported in the literature; however, there is a lack of practical, detailed experimental methodology. EV uptake can be assessed by fluorescently labeling EVs to detect their location within cells. Distinguishing between internalized EVs in cells and the superficial EVs on cells is difficult, yet critical, to accurately determine the EV uptake. Therefore, an assay that efficiently quantifies EV uptake through three-dimensional (3D) fluorescence confocal microscopy is proposed in this work. Fluorescently labeled EVs were prepared using a nano-filtration-based microfluidic device, visualized by 3D confocal microscopy, and then analyzed through advanced image-processing software. The protocol provides a robust methodology for analyzing EVs on a cellular level and a practical approach for efficient analysis.

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Extracellular vesicles (EVs) contribute to cellular biology and intercellular communications. There is a need for practical assays to visualize and quantify EVs uptake by the cells. The current protocol proposes the EV uptake assay by utilizing three-dimensional fluorescence imaging via confocal microscopy, following EV isolation by a nano-filtration-based microfluidic device.

共焦点顕微鏡イメージング解析による細胞外小胞取り込みアッセイ

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular ...

Single-Particle Interferometric Reflectance Imaging Characterization of Individual Extracellular Vesicles and Population Dynamics

Extracellular vesicles (EVs) are nanometer-sized vesicles with a lipid bilayer that are secreted by most cells. EVs carry a multitude of different biological molecules, including protein, lipid, DNA, and RNA, and are postulated to facilitate cell-to-cell communication in diverse tissues and organs. Recently, EVs have attracted significant attention as biomarkers for diagnostics and therapeutic agents for various diseases. Many methods have been developed for EV characterization. However, current methods for EV analysis all have different limitations. Thus, developing efficient and effective methods for EV isolation and characterization remains one of the crucial steps for this cutting-edge research field as it matures. Here, we provide a detailed protocol outlining a single-particle interferometric reflectance imaging sensor (SP-IRIS), as a method that is capable of detecting and characterizing EVs from unpurified biological sources and purified EVs by other methodologies. This advanced technique can be used for multi-level and comprehensive measurements for the analysis of EV size, EV count, EV phenotype, and biomarker colocalization.

<meta charset="utf8"></head><body>単一粒子干渉反射率イメージング:個々の細胞外小胞と集団動態の特性評価

This protocol presents single-particle interferometric reflectance imaging that is designed for the multi-level and comprehensive measurements of extracellular vesicles (EV) size, EV count, EV phenotype, and EV biomarker colocalization.

単一粒子干渉反射率イメージング:個々の細胞外小胞と集団動態の特性評価

Extracellular vesicles (EVs) are nanometer-sized vesicles with a lipid bilayer that are secreted by most cells. EVs carry a multitude of different ...

Multimodal Analytical Platform on a Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip for the Analysis of Extracellular Vesicle Subsets

Extracellular vesicles (EVs) are membrane-derived, tiny vesicles produced by all cells that range from 50 to several hundreds of nanometers in diameter and are used as a means of intercellular communication. They are emerging as promising diagnostic and therapeutic tools for a variety of diseases. There are two main biogenesis processes used by cells to produce EVs with differences in size, composition, and content. Due to their high complexity in size, composition, and cell origin, their characterization requires a combination of analytical techniques. This project involves the development of a new generation of multiparametric analytical platforms with increased throughput for the characterization of subpopulations of EVs. To achieve this goal, the work starts from the nanobioanalytical platform (NBA) established by the group, which allows an original investigation of EVs based on a combination of multiplexed biosensing methods with metrological and morphomechanical analyses by atomic force microscopy (AFM) of vesicular targets trapped on a microarray biochip. The objective was to complete this EV investigation with a phenotypic and molecular analysis by Raman spectroscopy. These developments enable the proposal of a multimodal and easy-to-use analytical solution for the discrimination of EV subsets in biological fluids with clinical potential

This paper proposes a new generation of multiparametric analytical platforms with increased throughput for the characterization of extracellular vesicle subsets. The method is based on a combination of multiplexed biosensing methods with metrological and morphomechanical analyses by atomic force microscopy, coupled with Raman spectroscopy, to qualify vesicular targets trapped on a microarray biochip.

細胞外小胞サブセット解析のための多重化表面プラズモン共鳴イメージングチップ上のマルチモーダル解析プラットフォーム

Extracellular vesicles (EVs) are membrane-derived, tiny vesicles produced by all cells that range from 50 to several hundreds of nanometers in diameter ...

電界誘起リリースおよび測定によるエキソソームのバイオマーカーの検出（EFIRM）

要約

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ナノ粒子追跡によるひと血中の細胞小胞単一の急速な蛍光特性評価

調整可能な抵抗パルスセンシングを使用して定量化し、細胞外小胞の大きさ、プロファイリング

定量PCRを通じて非小細胞肺癌（NSCLC）患者の血漿中のエキソソームのmiRNA解析：実行可能な液体生検ツール

Nanoplasmon の散乱と低倍率の顕微鏡イメージングによる腫瘍由来エキソソームの定量化

エキソソームの定量化とサイズの測定のための革新的方法

細胞外小胞の定量とサイズ決定のためのナノ粒子追跡解析

共焦点顕微鏡イメージング解析による細胞外小胞取り込みアッセイ

単一粒子干渉反射率イメージング:個々の細胞外小胞と集団動態の特性評価

単一粒子干渉反射率イメージング:個々の細胞外小胞と集団動態の特性評価

細胞外小胞サブセット解析のための多重化表面プラズモン共鳴イメージングチップ上のマルチモーダル解析プラットフォーム