We appreciate Dr. Jeong-Soo Lee for sharing the Tg(dbh:EGFP-MYCN) transgenic fish with us in our study. This work was supported by a grant 1K99CA178189-01 from the National Cancer Institute, a fellowship from the Pablove Foundation and the Friends for Life, and young investigator awards from the Alex's Lemonade Stand Foundation and the CureSearch for Children's Cancer Foundation.

HINWEIS: Alle Zebrafisch Studien und Pflege der Tiere wurden in Übereinstimmung mit der Mayo-Klinik Institut IACUC genehmigten Protokoll # A41213 getan. 1. DNA-Konstrukte für Transgenese <ol><li> Amplify ein 5,2-kb Dopamin beta-Hydroxylase (d &amp; bgr; h) Promotorbereich 8 mit dem CH211-270H11 BAC-Klon (von BACPAC Ressourcen-Center (BPRC)) als DNA-Template. Verwenden eines PCR-System geeignet für lange und genaue PCR-Amplifikation langer DNA-Matrizen und den folgenden Zyklus Programme für PCR: 94 ° C für 2 min, 10 Zyklen (94 ° C, 15 sec, 50 ° C, 30 sec, 68 &amp; deg; C, 8 min), gefolgt von 30 Zyklen (94 ° C, 15 sec, 53 ° C, 30 sec, 68 ° C, 8 min), 68 ° C, 4 min (Vorwärtsprimer 5&#39;-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTCCCCCTTTTTAGG-3 &#39; und Rückwärtsprimer 5&#39;- GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGTCGTCTTTTGA-3 &#39;). </li><li> Erstellen Sie die d &amp; bgr; h -pDONRP4-P1R Eintrag clone 8 mit kommerziellen rekombinanten Klonen System wie Multisite-Gateway. Mischen Sie 1 ul gereinigtes dβh PCR-Produkt (172 ng / ul), 1 ul (150 ng / ul) pDONRP4-P1R Donorvektor (zusammen mit anderen Gateway Vektoren sind großzügige Geschenke von Dr. Chi-Bin Chien, Univ. Of Utah) , 4 &amp; mgr; l TE-Puffer (pH 8,0) mit 2 ul BP Clonase Enzymmix, Inkubation 1 h bei 25 ° C und dann in One Shot TOP10 kompetente E. Transformation coli nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Generieren Sie die d &amp; bgr; h: EGFP-transgenen MYCN konstruieren 8 mit in Schritt 1.2 genannten rekombinanten Klonen System. Mischen Sie 1 ul jeder entry clone (150 ng / ul) mit einem 5,2-kb dβh Promotor (dβh -pDONR P4-P1R Konstrukt), EGFP fehlt ein Stop-Codon (PME-EGFP Konstrukt) und menschliche MYCN cDNA (ein großzügiges Geschenk von Dr. Hogarty an der Kinderklinik von Pennsylvania, MYCN-pDONRP2R-P3 Konstrukt), 1 ul (150 ng / ul) des modifizierten Zielvektor, der I-SceI-Erkennungsstellen (ein großzügiges Geschenk von Dr. C. Grabher, Karlsruher Institut für Technologie, Karlsruhe, Deutschland), 4 ul TE Puffer ( pH-Wert 8,0) mit 2 &amp; mgr; l LR Clonase Enzymmix, Inkubation 1 h bei 25 ° C und dann zu transformieren, um chemisch kompetente E. coli, wie One-Shot-Top-10 und folgen Sie dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Stellen mitf: mitf transgenen Konstrukt 8 durch Verdauen des PNP-mitf Vektor mit NotI und SalI Restriktionsenzyme für 2 h bei RT und durch Subklonieren des frei 2,65-kb (ein großzügiges Geschenk von Dr. D. Raible, Univ of Washington.) DNA-Fragment, das die MITF-Promotor und die kodierende Sequenz des Zebrafisch MITF Gen in die NotI und MluI-Stellen eines modifizierten pBluescript-Vektor, der flankierenden I-SceI-Erkennungsstellen enthält (ein großzügiges Geschenk von Dr. Hui Feng, Boston University), unter Verwendung von T4-DNA-Ligase gemß dem Protokoll des Herstellers. HINWEIS: Um die Effizienz der Erzeugung von stabilen MYCN exprimierenden Linien zu erhöhen, d &amp; bgr; h: EGFP-MYCN und mitf:. Mitf DNA-Konstrukte sind in einem Zellstadium Perlmutt Embryonen koinjiziert Perlmutt bezeichnet eine Art von mutierten Fische fehlt ein Neuralleiste stamm Melanophor während der Entwicklung 36. Somit kann die Erscheinung von Pigmentzellen in den injizierten Embryos schlägt die Integration MITF: MITF DNA-Konstrukte in das Genom. Es wurde gezeigt, dass zwei oder drei koinjiziert DNA-Konstrukte können in das Fischgenom 31 kointegriert werden. EGFP-MYCN Transgen und zur leichteren Identifizierung von MYCN stabile transgene Linie: So kann die Pigmentierung von mitf Ausdruck verursacht als Marker für die Integration der dβh dienen. </li><li> Mischen Sie die d &amp; bgr; h: EGFP-MYCN und mitf: mitf DNAKonstrukte in einem 3: 1-Verhältnis in einem Gesamtvolumen von 15 &amp; mgr; l Reaktion mit 1 &amp; mgr; l von I-SceI Enzym und 0,75 ul Puffer. Sicherzustellen, dass die Gesamtmenge an DNA in der Reaktion nicht 750 ng nicht überschreiten. </li><li> Führen Sie die I-SceI Verdauung bei RT für 4 h oder O / N. Am zweiten Tag wird die I-SceI- verdauten DNAs bereit sind für die Mikroinjektion oder bei -20 ° C für die Injektion in der Zukunft gespeichert werden. Bewahren Sie die I-SceI Enzym bei -80 ° C in kleinen Aliquots seiner Enzym zu gewährleiste. </li><li> Subklonieren die menschliche ALKF1174L und Wildtyp-ALK-Gen aus dem pcDNA3-Vektor (ein großzügiges Geschenk von Dr. George am Dana-Farber Cancer Institute) 7 in EcoRI- und NotI-Stellen eines pENTRY1A Vektor (ein großzügiges Geschenk von Dr. C. Grabher, Karlsruher Institut für Technologie, Karlsruhe, Deutschland) unter Verwendung von T4-DNA-Ligase gemß dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Generieren Sie die d &amp; bgr; h: ALKF1174L &lt;/ Em&gt; oder dβh: ALKWT transgene Konstrukte mit dem rekombinanten dessen Einzelheiten in Protokoll 1.2 erwähnt. Kurz gesagt, kombiniert drei Eingabe Klone dβh -pDONRP4-P1R, ALKF1174L- pENTRY1A (oder ALKWT -pENTRY1A) und P3E-polyA, in die modifizierte Zielvektor, der I-SceI-Erkennungsstellen (ein großzügiges Geschenk von Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institut für Technologie, Karlsruhe, Deutschland), mit LR Clonase Enzym-Mischung, nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Mischen Sie die d &amp; bgr; h: ALKF1174L (oder dβh: ALKWT) und dβh: mCherry DNA-Konstrukte zu einem 3: 1-Verhältnis und linearisieren sie mit I-SceI Enzym wie in PROTOKOLL 1,5-1,6 beschrieben. </li></ol> 2. Mikroinjektion <ol><li> Verwenden Sie Glasmikropipetten mit 1,0 mm Durchmesser für alle Injektionen 37. Brechen Sie die Spitze der Glasmikropipetten mit einer Rasierklinge vor der Injektion. Kalibrieren Sie das Injektionsvolumen von spritzening H 2 O in einen Tropfen Mineralöl. Der Durchmesser der resultierenden Tröpfchen und einstellen Mikroinjektor (Druck oder die Dauer der Druckimpuls), um sicherzustellen, dass das Injektionsvolumen von weniger als 10% des gesamten Zellvolumens von einem zell Embryonen. </li><li> Fügen Sie eine zusätzliche 0,5 ml frisches I-SceI Enzym (5 Einheiten / ul) in 5 ul Injektionslösung, die DNA-Konstrukte direkt vor der Injektion die Effizienz der Transgenese 38 zu erhöhen. Injizieren 50-80 pg linearisierter DNA-Konstrukte in das Zytoplasma einer Zelle-Embryonen. Um den Erfolg von Injektions sicherzustellen, mischen die Probe mit 0,25% Phenolrot zur Visualisierung. Wenn Zellen rot nach der Injektion, bedeutet dies, die Mikroinjektion erfolgreich ist. Um eine hohe Erfolgsquote für die Erzeugung transgener Fische zu gewährleisten, haben wir spritzen typischerweise bis zu 500 Embryonen. </li><li> Um transgene Fische stabil exprimieren MYCN erzeugen, coinject das linearisierte d &amp; bgr; h: EGFP-MYCN und MITF: MITF-DNA-Konstrukten (in einer 3: 1-Verhältnis) in Embryonen der Pigmentierung Mutante Perlmuttzebrafisch beim Ein-Zell-Stadium. Die Expression Mitf dient als Reporter für die Integration der transgenen Konstrukte im Fischgenom. </li><li> Für Mosaikexpression von ALK in dem Wildtyp oder MYCN transgenen Embryos, Co-Injektion das linearisierte d &amp; bgr; h: ALK F1174L (oder dβh: ALKWT) mit dβh: mCherry DNA-Konstrukte (bei ​​einem Verhältnis 3: 1) in die Ein-Zelle Embryonen aus der Zucht von F1 heterozygot Tg (dβh: EGFP-MYCN) erhaltenen transgenen Fisch mit Wildtyp AB Fische. So die Hälfte der Nachkommen transgen sind für MCYN und die Hälfte sind Wildtyp. </li></ol> 3. Bildschirm für stabile oder Mosaic transgene Fische <ol><li> Um die Effizienz der Identifizierung von stabilen MYCN -exprimierenden Leitungen zu erhöhen, zu betäuben vorwiegend injiziert Perlmutt Embryonen Tricaine (0,02%) at Tage 3-5 des postfertilization und Bildschirm für die Pigmentierung. Übertragen Sie die Embryonen mit Pigmentierung auf eine neue Petrischale mit frischen Ei Wasser und heben Sie sie bis zur Geschlechtsreife für weitere Überprüfungen für den Gründer Fisch, der den d &amp; bgr; h durchzuführen: EGFP-MYCN Transgen in den Keimzellen. </li><li> So ermitteln Sie den Gründer mit Keimbahntransmission von EGFP-MYCN, Outcross pigmentierte F0 wachsene Fische mit Wildtyp AB Fische und Bildschirm für EGFP-positiven Embryonen im 1-2 Tage nach der Befruchtung für weitere Genotypisierung. Legen Sie eine einzelne EGFP-positiven F1 Embryo in ein PCR-Röhrchen und entfernen Sie alle Flüssigkeit. In 50 ul von gDNA Extraktionspuffer, die 12,5 ul der 4x Lysepuffer, 35 ul H 2 O und 2,5 ul Proteinase K (10 mg / ml), um Embryo enthält. Inkubieren der Reaktion für 2-3 h bei 55 ° C, gefolgt von 10 Minuten Inkubation bei 98 ° C zur Inaktivierung von Proteinase K. Zu 50 ml 4x Lysepuffer machen, 500 &amp; mgr; l von 1 M Tris (pH 8,4), 2,5 ml 1 M KCl to 47 ml H 2 O. HINWEIS: Nach dem F0 MYCN stabile transgene Fische mit Wildtyp AB Fische gezüchtet, die alle die Nachkommen pigmentiert sind. So Pigmentierung nicht als Marker zur Identifizierung von MYCN- positive Fisch servieren. Während in der MYCN transgene Fische wird das EGFP-MYCN Fusionsprotein im PSNS exprimiert, einschließlich der sympathischen Neuronen des oberen Halsganglien und sequentiellen Ganglien des sympathischen Kette und den nicht PSNS dopaminergen Neuronen wie die Medulla oblongata und Kopfganglien 8. So kann die Expression von EGFP als Marker zur Identifizierung der MYCN stabilen transgenen Embryos dienen. </li><li> Verwenden Sie 2 ul von gDNA aus der pigmentierten F1 Embryo als Vorlage extrahiert Primer MYCN -test F1: 5&#39;-CTG CTT GAG GAG AAC CTG TG-3 &#39;; MYCN -R3: 5&#39;-AGG CAT CGT TTG AGG ATC AG-3 &#39;, und das folgende Programm Witzh die GC-RICH PCR System: 1 Zyklus 95 ° C für 3 min, 25 Zyklen von 95 ° C für 30 sec, 58 ° C für 30 sec, und 72 ° C für 3 min. Wir Genotyp typischerweise 14-16 pigmentierten Embryonen aus einer Paarung, die Anwesenheit von integrierten MYCN Transgen in den pigmentierten Embryonen wurden über 6 Gründer Fisch überexprimieren MITF und MYCN wurden durch dieses Verfahren identifiziert bestätigen. </li><li> Heben Sie den Rest der EGFP-positiven F1-Embryonen. Fin Clip und Genotyp sie bei 2-3 Monate alt Verwendung des obigen Protokolls, um die Integration des Transgens in MYCN Fisches weiter zu bestätigen. Breed F1 MYCN stabile transgene Fische mit Wildtyp AB Fische. Co-spritzen den linearisiert d &amp; bgr; h: ALK F1174L (oder dβh: ALKWT) mit dβh: mCherry DNA-Konstrukte in den einzelligen Embryonen in Protokoll 2.4 beschrieben. </li><li> Sortieren Sie die MYCN exprimierenden Embryos im Experiment in PROTOKOLL 2.4 beschrieben mit einem stereoskopischen Fluorescence Mikroskop und Bildschirm, die in erster Linie injizierten Embryonen an den Tagen 1-3 von postfertilization für die Expression von EGFP-MYCN im PSNS. Dann, während der Tage 2-5 des postfertilization, betäuben die Embryonen mit Tricaine (0,02%) und sortieren diese MYCN- positive oder negative Embryonen wieder basierend auf der Expression von mCherry im PSNS Verwendung eines stereoskopischen Fluoreszenzmikroskop. Die Expression mCherry dient als Marker für die Coexpression von ALK in Geweben der Mosaikprimär injizierten Tieren. HINWEIS: ~ 600 Nachkommen aus der Zucht von MYCN stabile transgene Fische mit Wildtyp-Fisch resultierenden Pro Gruppe wurden mit den linearisierte DNA-Konstrukte injiziert, einschließlich d &amp; bgr; h: ALK F1174L und dβh: mCherry, dβh: ALKWT und dβh: mCherry oder dβh : mCherry allein sind. Mosaik Expression mCherry in 70-90% des hauptsächlich eingespritzten Fische beobachtet werden. Die Hälfte einer ein-Drittel des injizierten Fische überlebten durch die Larvenstadium zur Tumor Uhr. </li><li> Heben Sie die gesamte mCherry + MYCN + und mCherry + MYCN - Embryonen gemäß den Standardprotokollen aus der Zebrafisch-Buch 39 und überwachen Tumor Beginn beginnend bei 5 Wochen postfertilization. </li></ol> 4. Tumor Watch in Mosaic transgene Fische <ol><li> Überwachen mCherry- positive primär injiziert Fisch alle 2 Wochen ab 5 Wochen postfertilization zum Nachweis von Tumor Beginn. </li><li> Anesthetize Fisch mit Tricaine (0,02%) und der Bildschirm für die Anwesenheit von mCherry - und EGFP-exprimierenden Tumoren in den PSNS unter Nikon SMZ-1500 stereoskopischen Fluoreszenzmikroskop mit einer Digitalsicht DS-U1-Kamera ausgestattet. </li><li> Um zu bestätigen, ob die Tumoren der ALK Transgen exprimieren, isolieren mCherry- und EGFP-positive Massen für ALK Genotypisierung PCR. </li><li> Unter Verwendung von PCR, verstärken genomischer DNAALK P7:: 5&#39;-AGG CCA GGT GTC CGG AAT GC-3 &#39;und ALK P18: 5&#39;-TGT CTT CAG GCT GAT GTT GC-3&#39; und die folgende PCR-Reaktion: 1 Zyklus aus entwickelten Tumoren mit den folgenden Primern extrahiert von 94 ° C für 5 min, 30 Zyklen (94 ° C für 30 sec, 55 ° C für 30 sec, und 72 ° C für 60 sec). Dann Folge das PCR-Produkt mit ALK P7 Primer weiter die Existenz von mutierten oder Wildtyp-ALK in den mCherry-positiven Tumoren bestätigen. </li></ol>

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish.">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. 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R., Takahashi, K., Futreal, P. A., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+patterns+of+somatic+mutations+in+cancer.">Emerging patterns of somatic mutations in cancer.</a> Nat Rev Genet. 14 (10), 703-718 (2013).</li><li>Sander, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+disruption+in+somatic+zebrafish+cells+using+engineered+TALENs.">Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

In dieser repräsentativen Studie verwendeten wir transiente Co-Injektion und Co-Expression von aktivierten ALK mit dem mCherry Reportergens in MYCN exprimierenden transgene Fische, um zu zeigen, dass diese Gene zusammenarbeiten, um deutlich zu beschleunigen den Ausbruch von Neuroblastom, im Einklang mit unseren früheren Feststellung in Verbindung stabil transgene Fische Koexpression beide aktiviert ALK und MYCN 8. Dieses Mosaik transgenen Ansatz besitzt mehrere d...

Krebserkrankungen sind progressive Erkrankungen, die durch die Anhäufung von pathologischen Mutationen, Deletionen und Chromosomen gewinnt mit der Zeit gekennzeichnet. Diese genetischen Anomalien können mehrere zelluläre Prozesse, die vom Zellzyklus, Zelltod, energetische Metabolismus und Zusammensetzung des Zytoskeletts zu Reaktionen wie Hypoxie Stress beeinflussen. Daher spiegelt die Tumorgenese kollektive Aktionen von mehreren genetischen Veränderungen in einem breiten Spektrum von biologischen Prozessen. Neue integrative genomische Forschung, einschließlich Sequenzierung ganzer Genome, Exoms Sequenzierung, die gezielte Sequenzierung, deep sequencing und genomweiten Assoziationsstudien haben eine wachsende Zahl von neuen genetischen Veränderungen im Wesentlichen alle Arten von Tumoren 1-4 identifiziert. In vielen Fällen gemeinsam auftreten die genetischen Läsionen in einem nicht-zufälligen Weise 5-8, was darauf hindeutet, ihre Zusammenarbeit bei der Krankheitsentstehung. Sezieren der onkogenen Rollen der großen Palette von aberrant exprimierter Gene resultierenden from diese genomische Veränderungen ist notwendig, um neue therapeutische Strategien zu entwickeln und um die Antworten von Tumorzellen gegenüber diesen Substanzen zu verstehen, aber das hat sich als eine schwierige Aufgabe sein, die eine sehr robuste Tiermodellsysteme für die Durchführung von Hochdurchsatz-funktionelle Genomanalyse vivo. Obwohl Säugetiere, insbesondere Nagetiere, sind bevorzugte Modelle in der Krebsbiologie hat der Zebrafisch begonnen, erhebliche Aufmerksamkeit zu erregen. Die Knochenfische Zebrabärbling (Dario rerio) als Modellorganismus für die Entwicklungsstudie seit 1960 im Einsatz und wurde zum ersten Mal auf die Untersuchung von Tumor Pathogenese 1982 9-11 angewendet. Einfache Wartung, geringe Körpergröße, und hohe Fruchtbarkeit machen den Zebrafisch ein robustes Modell für eine groß angelegte Vorwärts genetischen Screens von Mutationen, die abnorme und pathologische Phänotypen 10 verleihen identifizieren. Die optische Transparenz der Zebrafischembryonen ist ein weiteres wichtiges Merkmal unterstützt breitere Verwendung dieser Krebs-Modell, wiesie ermöglicht in vivo-Bildgebung, um durchgeführt, um die Tumorentwicklung in Echtzeit 9 zu finden, eine Anwendung, die bei Nagern 12 relativ schwer werden. Neueste vergleichende Genomik Analyse der Zebrafisch Referenzgenom (ZV9) ergab 26.206 Protein kodierende Gene, mit 71% mit menschlichen Orthologe, von denen 82% sind mit krankheitsassoziierten Genen im Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) Datenbank 13 korreliert, 14. Folglich ist die Zebrafisch wurde verwendet, um diverse Arten von menschlichen Krebsarten, einschließlich Neuroblastom Muster 8, T-Zell-akute lymphatische Leukämie (T-ALL), 15,16, 17,18 Melanom, Ewing-Sarkom 19, Rhabdomyosarkom 20,21, Pankreaskarzinom 22, 23 und Leberzellkarzinom myeloischen malignen Erkrankungen, 24,25, und wurde ausgewählt, wie ein Krebs-Modell für die Xenotransplantation studiert 11,26. Eine stabile transgeneAnsatz im Zebrafisch wird häufig verwendet, um die Wirkung der Verstärkung-of-Funktion von Genen in der normalen Entwicklung oder Pathogenese 27,28 studieren. Ein solches Modell (Figur 1A) zu entwickeln, injiziert man ein DNA-Konstrukt, das das Gen von Interesse durch einen gewebespezifischen Promotor in die Ein-Zellen Wildtyp-Embryonen angetrieben enthält. Drei bis vier Monate nach der Injektion, wenn die injizierten Embryos geschlechtsreif sind, werden sie mit Wildtyp-Fischen ausgekreuzt, um diejenigen, die die Integration des DNA-Konstrukts in ihrer Keimbahn, die sie als Gründer Fisch Bildschirm Lizenzen. Viele Faktoren, wie beispielsweise die Kopienzahl und die Integrationsstelle des Transgens, beeinflussen die Expression des Transgens in stabilen transgenen Linien. Somit, um eine transgene Tumormodell zu entwickeln, haben, mehreren stabilen transgenen Linien Expression eines einzelnen Onkogen, zunächst erzeugt und für die Linie, die das Transgen in einer Ebene, die zu Tumorentstehung führen könnte exprimieren gescreent werden. Allerdings, wenn die Überexpression eines Kandidaten oncogene toxisch für Keimzellen, ist es schwierig, eine stabile transgene Linie erzeugt durch direkte Überexpression des Transgens 29. Daher kann dieser Ansatz sehr zeitaufwändig sein, mit einem hohen Risiko des Scheiterns, um ein geeignetes Modell Krebs erzeugen. Hier zeigen wir eine alternative Strategie, die auf Mosaik transiente Transgenese (1B), die einzigartige Vorteile gegenüber herkömmlichen stabilen Transgenese für funktionelle genomische Untersuchung in vivo zur Verfügung stellt. In diesem Ansatz werden eine oder mehrere transgene Konstrukte in der Ein-Zell-Stadium von transgenen und Wildtyp-Embryos injiziert. Die injizierten DNA-Konstrukte, die Transgene sind dann mosaik und zufällig in den Primär injiziert Fisch integriert, was zu einer gemischten Genotypen in mehreren Zellpopulationen in den einzelnen Fisch 30. Außerdem Koinjektion von mehreren DNA-Konstrukte in einem Zellembryonen zu Co-Integration in die gleiche Zelle an zufälligen Stellen, so dass man trace die Zellen mit Expression von Transgenen und erkunden Sie die Wechselwirkungen verschiedener Gene im Krankheitsentstehung in den Mosaik-Tiere 31. Als Beweis für das Prinzip, transient wir im peripheren sympathischen Nervensystems (PSNS) unter der Kontrolle des Dopamin-beta-Hydroxylase (d &amp; bgr; h) Promotors in Wildtyp-Fisch und transgene Fische überexprimierenden MYCN überexprimiert Mutation aktiviert ALK (F1174L) mit mCherry Reportergens. ALK, das einen Rezeptor-Tyrosin-Kinase kodiert, ist das am häufigsten mutierte Gen in Hochrisiko-Neuroblastom 5-7,32,33. ALK (F1174L), als eine der häufigsten und potente somatischen aktivierenden Mutationen ist in überrepräsentiert MYCN- verstärkt Neuroblastom-Patienten mit hohem Risiko und wirkt synergistisch mit MYCN Expression auf Neuroblastom Tumorentstehung in der stabilen transgenen Mäusen und transgenen Zebrafisch Modelle 8,34,35 beschleunigen. Durch Mosaiktransiente Überexpression von ALK (F1174L) mit mCherry im MYCN transgene Fische, rekapituliert wir die Beschleunigung der in der stabilen transgenen Fischen Überexpression sowohl ALK (F1174L) und MYCN beobachteten Tumor Beginn, was darauf hindeutet, dass das Mosaik Transgenese Strategie kann schnell und effizient eingesetzt werden Bewertung der relativen Beiträge mehrerer Onkogene in Tumorinitiation in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="663">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:171px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Expand Long Template PCR System&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Roche Applied Science, IN</td>
			<td style="width:119px;">11681834001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pCR-TOPO vector&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:119px;">451641</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:171px;">New England Biolabs, MA</td>
			<td style="width:119px;">M0202M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gateway LR Clonase II enzyme 
			Mix</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen, CA</td>
			<td>11791-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gateway&#174; BP Clonase&#174; II enzyme mix</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen, CA</td>
			<td>11789-020</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">GC-RICH PCR System&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Roche Applied Science, IN</td>
			<td>12 140 306 001</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Meganuclease I-SceI&#160;</td>
			<td style="width:171px;">New England Biolabs, MA</td>
			<td>R0694S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Nikon, NY</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon digital sight DS-U1 camera</td>
			<td style="width:171px;">Nikon, NY</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mosaic zebrafish transgenesis for functional genomic analysis of candidate cooperative genes in tumor pathogenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic &#8220;drivers&#8221; among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

Um zu untersuchen, ob die Überexpression von Mutation aktiviert ALK F1174L oder Wildtyp-ALK konnte mit MYCN in Neuroblastom-Induktions zusammenzuarbeiten, überexprimiert wir entweder aktivierten menschlichen ALK oder Wildtyp-menschlichen ALK unter der Kontrolle der d &amp; bgr; h Promotor in der PSNS transgener Fische überexprimierenden MYCN. Eine der folgenden Konstrukte, dβh - ALKF1174L oder dβh - in einzelligen Wildtyp oder...

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Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis | Developmental Biology | Video

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Mosaic Zebrafisch Transgenese für Funktionelle Genomanalyse Candidate Cooperative Gene in Tumor Pathogenese

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

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11.0K Aufrufe.  Mayo Clinic College of Medicine, Center for Individualized Medicine. The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Serie: Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the cardiac transcriptome from being masked by the global embryonic transcriptome, it is necessary to collect sufficient numbers of hearts for further analyses. Furthermore, as zebrafish cardiac development proceeds rapidly, heart collection and RNA extraction methods need to be quick in order to ensure homogeneity of the samples. Here, we present a rapid manual dissection protocol for collecting functional/beating hearts from zebrafish embryos. This is an essential prerequisite for subsequent cardiac-specific RNA extraction to determine cardiac-specific gene expression levels by transcriptome analyses, such as quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The method is based on differential adhesive properties of the zebrafish embryonic heart compared with other tissues; this allows for the rapid physical separation of cardiac from extracardiac tissue by a combination of fluidic shear force disruption, stepwise filtration and manual collection of transgenic fluorescently labeled hearts.

To analyse cardiac gene expression profiles during zebrafish heart development, total RNA has to be extracted from isolated hearts. Here, we present a protocol for collecting functional/beating hearts by rapid manual dissection from zebrafish embryos to obtain cardiac-specific mRNA.

Großzebrafisch Embryonale Herz Dissection für Transkriptionsanalyse

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Technik auf Zielmikroinjektions an die Entwicklungs<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and behavioral phenotypes. The remarkably diverse phenotypes that have evolved as marine populations adapt to countless freshwater environments, combined with the ability to cross marine and freshwater forms, provide a rare vertebrate system in which genetics can be used to map genomic regions controlling evolved traits. Excellent genomic resources are now available, facilitating molecular genetic dissection of evolved changes. While mapping experiments generate lists of interesting candidate genes, functional genetic manipulations are required to test the roles of these genes. Gene regulation can be studied with transgenic reporter plasmids and BACs integrated into the genome using the Tol2 transposase system. Functions of specific candidate genes and cis-regulatory elements can be assessed by inducing targeted mutations with TALEN and CRISPR/Cas9 genome editing reagents. All methods require introducing nucleic acids into fertilized one-cell stickleback embryos, a task made challenging by the thick chorion of stickleback embryos and the relatively small and thin blastomere. Here, a detailed protocol for microinjection of nucleic acids into stickleback embryos is described for transgenic and genome editing applications to study gene expression and function, as well as techniques to assess the success of transgenesis and recover stable lines.

Transgenic manipulations and genome editing are critical for functionally testing the roles of genes and cis-regulatory elements. Here a detailed microinjection protocol for the generation of genomic modifications (including Tol2-mediated fluorescent reporter transgene constructs, TALENs, and CRISPRs) is presented for the emergent model fish, the threespine stickleback.

Mikroinjektions für Transgenese und Genome Editing in Threespine Stichlinge

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into the developing oocyte. Because these events rely on maternal products which typically act very soon after fertilization-that preexist inside the egg, standard approaches for expression and functional reduction involving the injection of reagents into the fertilized egg are typically ineffective. Instead, such manipulations must be performed during oogenesis, prior to or during the accumulation of maternal products. This article describes in detail a protocol for the in vitro maturation of immature zebrafish oocytes and their subsequent in vitro fertilization, yielding viable embryos that survive to adulthood. This method allows the functional manipulation of maternal products during oogenesis, such as the expression of products for phenotypic rescue and tagged construct visualization, as well as the reduction of gene function through reverse-genetics agents.

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

An optimized protocol for the in vitro maturation of zebrafish oocytes used for the manipulation of maternal gene products is presented here.

Funktionelle Manipulation der mütterlichen Gene Produkte verwenden<em&gt; In Vitro</em&gt; Oozytenreifung in Zebrabärbling

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy. The sub-diffraction limit resolution capabilities of super-resolution light microscopes allow improving the accuracy of the correlated data. Briefly, 110 nanometer thick cryo-sections are transferred to a silicon wafer and, after immunofluorescence staining, are imaged by super-resolution light microscopy. Subsequently, the sections are preserved in methylcellulose and platinum shadowed prior to imaging in a scanning electron microscope (SEM). The images from these two microscopy modalities are easily merged using tissue landmarks with open source software. Here we describe the adapted method for the larval zebrafish retina. However, this method is also applicable to other types of tissues and organisms. We demonstrate that the complementary information obtained by this correlation is able to resolve the expression of mitochondrial proteins in relation with the membranes and cristae of mitochondria as well as to other compartments of the cell.

This protocol describes the necessary steps to obtain subcellular protein localization results on zebrafish retina by correlating super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy images.

Korrelative Höchstauflösung und Elektronenmikroskopie Protein Lokalisierung im Zebrafisch Netzhaut zu lösen

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method requires a more technically demanding operation and involves complicated procedures, especially when used in larvae due to their small size, relatively thin and fragile cuticle, and high mortality, which limit its application. In contrast, viral vectors for gene delivery have been developed to surmount extracellular and intracellular barriers. These systems have the advantages of easy manipulation, high gene transduction efficiency, long-term maintenance of gene expression, and the ability to produce persistent effects in vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) are mosquito-specific, small single-stranded DNA viruses that can effectively deliver foreign nucleic acids into mosquito cells; however, the replacement or insertion of foreign genes to create recombinant viruses typically causes a loss of packaging and/or replication abilities, which is a barrier to the development of these viruses as delivery vectors.
Herein, we report using an artificial intronic small-RNA expression strategy to develop a non-defective recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo delivery system. Detailed procedures for the construction, packaging and quantitative analysis of the rAaeDV vectors, and for larval infection are described.
This study demonstrates, for the first time, the feasibility of developing a non-defective recombinant MDV micro RNA (miRNA) expression system, and thus providing a powerful tool for the functional analysis of genes in mosquito and establishing a basis for the application of viral paratransgenesis for controlling mosquito-borne diseases. We demonstrated that Aedes albopictus 1st instar larvae could be easily and effectively infected by introducing the virus into the water body of the larvae breeding site and that the developed rAaeDVs could be used to overexpress or knock down the expression of a specific target gene in larvae, providing a tool for the functional analysis of mosquito genes.

We report using an artificial intronic small RNA expression strategy to develop a non-defective recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo delivery system. A detailed procedure for the construction, packaging, and quantitative analysis of the rAaeDV vectors as well as for larval infection is described.

Verwendung von einem rekombinanten Moskito Densovirus als gen Lieferung Vektor für die funktionelle Analyse von Genen in Mückenlarven

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in developmental biology for decades. Traditionally, most gene expression studies relied on visual evaluation of the ISH signal, a method that is prone to bias, particularly in cases where sample identities are known a priori. We have previously reported on a method to circumvent this bias and provide a more accurate quantification of ISH signals. Here, we present a simple guide to apply this method to quantify the expression levels of genes of interest in ISH-stained embryos and correlate that with their corresponding genotypes. The method is particularly useful to quantify spatially restricted gene expression signals in samples of mixed genotypes and it provides an unbiased and accurate alternative to the traditional visual scoring methods.

Gene editing technologies have enabled researchers to generate zebrafish mutants to investigate gene function with relative ease. Here, we provide a guide to perform parallel embryo genotyping and quantification of in situ hybridization signals in zebrafish. This unbiased approach provides greater accuracy in phenotypical analyses based on in situ hybridization.

Genotypisierung und Quantifizierung der In-Situ-Hybridisierungsfärbung in Zebrafischen

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and molecular complexity of skeletal elements increases with development. Tissue heterogeneity, such as at the interface of cartilaginous and osseous elements with each other or with surrounding tissues, is one obstacle to the study of developing cartilage and bone. Our protocol provides a rapid method of tissue processing and isolation of cartilage and bone that yields high quality RNA for gene expression analysis. Fresh frozen tissues of mouse embryos are sectioned and brief cresyl violet staining is used to visualize cartilage and bone with colors distinct from surrounding tissues. Slides are then rapidly dehydrated, and cartilage and bone are isolated subsequently by LCM. The minimization of exposure to aqueous solutions during this process maintains RNA integrity. Mouse Meckel&rsquo;s cartilage and mandibular bone at E16.5 were successfully collected and gene expression analysis showed differential expression of marker genes for osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, and chondrocytes. High quality RNA was also isolated from a range of tissues and embryonic ages. This protocol details sample preparation for LCM including cryoembedding, sectioning, staining and dehydrating fresh frozen tissues, and precise isolation of cartilage and bone by LCM resulting in high quality RNA for transcriptomic analysis.

This protocol describes laser capture microdissection for the isolation of cartilage and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Cartilage and bone can be rapidly visualized by cresyl violet staining and collected precisely to yield high quality RNA for transcriptomic analysis.

Laser Capture Mikrodissektion von Maus embryonalen Knorpel und Knochen für Die Genexpressionsanalyse

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine mammary gland is composed of two distinct epithelial cell compartments, serving different functions: the outer, contractile myoepithelial compartment and the inner, secretory luminal compartment. Here, we describe a method by which the cells comprising these compartments are isolated and then combined to investigate their individual lineage contributions to mammary gland morphogenesis and differentiation. The method is simple and efficient and does not require sophisticated separation technologies such as fluorescence activated cell sorting. Instead, we harvest and enzymatically digest the tissue, seed the epithelium on adherent tissue culture dishes, and then use differential trypsinization to separate myoepithelial from luminal cells with ~90% purity. The cells are then plated in an extracellular matrix where they organize into bilayered, three-dimensional (3D) organoids that can be differentiated to produce milk after 10 days in culture. To test the effects of genetic mutations, cells can be harvested from wild type or genetically engineered mouse models, or they can be genetically manipulated prior to 3D culture. This technique can be used to generate mosaic organoids that allow investigation of gene function specifically in the luminal or myoepithelial compartment.

The mammary gland is a bilayered structure, comprising outer myoepithelial and inner luminal epithelial cells. Presented is a protocol to prepare organoids using differential trypsinization. This efficient method allows researchers to separately manipulate these two cell types to explore questions concerning their roles in mammary gland form and function.

Generierung von Mosaik-Mammary-Organoiden durch Differential-Trypsinisierung

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...