Wir danken Frau Paula Roy für exzellente Fisch Tierhaltung und Steve Ekker für die Art Geschenk der pDB600 Plasmid. Diese Studien wurden durch einen Zuschuss zur SF aus NHGRI finanziert.

1. Auswahl und das Klonen von konservierten Sequenzen für die Prüfung <ol><li> Man muss zuerst potenzielle regulatorische Sequenzen für Funktionstests. Wir verlassen uns auf evolutionäre Sequenzanalyse Erhaltung als Kriterium, um Sequenzen zu wählen, und am häufigsten verwenden den Algorithmus PhastCons, die zugänglich wie ein Track auf der UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway) ist. Es gibt jedoch viele andere Algorithmen zur Verfügung Sequenzkonservierung über Artgrenzen zu bewerten. </li><li> Sobald wir unsere ausgewählten Sequenzen gestalten wir Primer an jeder Sequenz aus genomischer DNA zu amplifizieren. Primer so gewählt werden, die konservierte Region plus 30 oder mehr Basenpaare auf beiden Seiten zu verstärken. </li><li> Zur Verstärkung des ausgewählten Sequenzen verwenden wir die Takara LA TaqTM System. Andere Polymerasen funktionieren wird, aber es ist wichtig, eine Mischung, die ein Enzym mit Korrekturlesen Fähigkeit beinhaltet verwenden, um die Chancen von Fehlern während der Amplifikation eingeführt zu minimieren. Wir überprüfen die Amplicongröße durch Agarosegelelektrophorese. </li><li> Wir nutzen die pCR 8/GW/TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen), die PCR-Produkts in einem Eintrag Vektor, attL Rekombinationsstellen Klon, der Gateway-Eintrag Klon zu erzeugen. Das Klonen Reaktion ist effizienter mit frischen PCR-Produkt, so ist es am besten, um das Klonen innerhalb eines Tages der PCR führen. Transformation in DH5a Stämme durchgeführt, gefolgt von Spectinomycinresistenz Auswahl. </li><li> Wir prüfen das Produkt aus der TA-Klonierung durch Verdauung von ~ 500 ng des Plasmids mit EcoRI, um den Einsatz freizugeben, und bestätigen Sie die Größe des Einsatzes durch Agarosegelelektrophorese. Wir empfehlen die Sequenzierung der Insert-Sequenz und Orientierung zu überprüfen; Primer für die Amplifikation verwendet werden, können auch für die Sequenzierung eingesetzt werden. </li><li> Von den Eintrag zu klonen, ist die nicht-kodierenden konservierten Sequenz von LR-Rekombination zu unserem Gateway einsatzbereit Zielvektor, pGW_cfosGFP1 mit Gateway-LR Clonase II-Enzym-Mix (Invitrogen) gependelt. Transformation in DH5a Stämme durchgeführt, gefolgt von Ampicillinresistenz Auswahl. </li><li> Wir prüfen das Produkt aus der LR-Rekombination durch Verdauung von ~ 500 ng der Plasmid mit EcoRV, um den Einsatz freizugeben, und bestätigen Sie die Größe des Einsatzes durch Agarosegelelektrophorese. Sobald ein genaues Klon identifiziert worden ist, bereiten wir Plasmid-DNA mit dem Qiagen HiSpeed ​​® Plasmid Midi Kit. Wir weiteren Reinigung des Plasmids mit dem QIAquick PCR Purification Kit nach Herstellerangaben Protokolle und eluieren die DNA mit 30 ul RNase freiem Wasser. Das Plasmid wird zu einer Konzentration von 125 ng / ul und bei 4 ° C vor Injektionen verdünnt. </li><li> RNA kodieren funktionale TOL2 Transposase Enzym in vitro aus der pDB600 plasmid2 transkribiert. Wir reinigen das Plasmid mit dem Qiagen Midi-Prep-Kit, dann linearisieren 10-20 pg mit XbaI. Die mRNA-Synthese erfolgt nach dem mMESSAGE mMACHINE Kit-Protokoll (Ambion) durchgeführt. </li><li> Wir reinigen und Fällung der RNA nach Montageanweisungen. Wir resuspendieren RNA bis zu einer Endkonzentration von ~ 1μg/μl oder 20 ul für eine einzige Reaktion, in RNase freiem Wasser, und zu quantifizieren, durch UV-Spektroskopie. Wir analysieren auch ~ 1 g der RNA durch Agarosegelelektrophorese in voller Länge Transkription zu überprüfen. Obwohl ein Standard-TAE-oder TBE-Gel ist für diese Analyse angemessen, sollte die Denaturierung Probenpuffer mit der Transkription-Kit enthalten nach kit Anweisungen verwendet werden. </li><li> Wir testen jede neue Charge von Transposase RNA für die Wirksamkeit, indem Injektionen mit einem bekannten Plasmid (Abbildung 1). Nach der Überprüfung wird die RNA in kleine Portionen aufgeteilt und bei -80 ° C, um wiederholtes Auftauen und erneutes Einfrieren der einzelnen Aliquots zu vermeiden. <img src="/files/ftp_upload/1722/1722fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Zebrafisch-Embryo mit der Maus SOX10 Enhancer als Kontrolle. (Top) Hellfeldaufnahme (Bottom) GFP-Fluoreszenz Bild injiziert. Jede neue Charge von Transposase RNA ist für die Wirksamkeit getestet. </li></ol> 2. Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryonen für die Mosaik-transgenen Analyse <ol><li> Wir ziehen die Nadeln für die Mikroinjektion von 1,2 mm OD Filament Kapillare aus Glas auf einem Sutter P-97 Micropipette Puller, mit einem Programm entwickelt, um eine starke Spitze mit einem ziemlich scharfen Kegel auf intakte Chorion dringen Ertrag. Wir brechen die Spitzen von Hand unter einem Stereomikroskop mit einem äußeren Durchmesser von ca. 15 m, mit einem sauberen Rasierklinge und einem Mikrometer gleiten. Die Nadeln können am Vortag Injektionen und dort gespeichert werden in einer überdachten hält Teller sauber zu halten. </li><li> Wir halten an unserer Zebrafisch auf einer regelmäßigen Hell-Dunkel-Zyklus, der mit 14 Stunden Licht, unter Standard-conditions3. Der Tag vor der Durchführung microinjections, haben wir Fisch für zeitgesteuerte Paarungen in kleinen Aufzuchtbecken, jeweils bestehend aus einer Basis-Tank, einen geschlitzten einfügen, und einem Kunststoff-Deckel. Wir stellen drei Weibchen oder zwei Männchen pro tank in parallelen Reihen. </li><li> Am Morgen des microinjections, kurz nachdem das Licht beginnt, starten wir die Kombination von Männchen und Weibchen in einem sauberen System-behandeltem Wasser für die Eiererzeugung. Es ist wichtig, auf die Fische häufig zu überprüfen, und sammeln die Eier innerhalb von wenigen Minuten von der Verlegung zu gut synchronisiert Chargen zu bekommen. Eierproduktion kann für zwei vor drei Stunden aufrecht erhalten werden, indem sie weiterhin an die frische Gruppen von Fischen im Laufe des Vormittags zu kombinieren. </li><li> Mit einem breiten Bohrung, 5 1 / 4 &quot;Glas Pasteur Pipette mit einem Latex-Glühlampe, sortieren wir die gesammelten Embryonen in 60 x 15 mm Petrischalen, teilweise mit Embryo Medium2 gefüllt, in Gruppen von 50 Embryonen, und markieren Sie die Zeit auf gesammelten den Deckel von jedem Gericht. </li><li> Sobald die Fische begonnen haben über, bereiten wir frische Injektionslösung durch Mischen der folgenden in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis: <table border="1"><tbody><tr><td> Komponente </td><td></td></tr><tr><td> Transposon-Plasmid Lager (125ng/μl) </td><td> 1μl </td></tr><tr><td> Transposase RNA Lager (175ng/μl) </td><td> 1μl </td></tr><tr><td> Phenolrot Lager (2% in H 2 O) </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> RNase freies Wasser </td><td> 2.5μl </td></tr></tbody></table> Die Injektionsnadeln sind in Besitz Gerichte gelegt und gefüllt mit einer Pipette 500 nl Tropfen Injektionslösung auf das breite Ende jeder Nadel. Nachdem die Flüssigkeit an der Spitze durch Kapillarwirkung ist, können zusätzliche Lösung zu insgesamt von 1,5-2 ul hinzugefügt werden. Wir bereiten mindestens zwei Nadeln für jede Injektion Lösung. </li><li> Der gefüllte Nadel in der Hand gehalten Nadelhalter einer pneumatischen Pico-Pump-oder ähnlichen Druck-Injektor, konfiguriert und mit einem N2-Tank Anweisungen des Herstellers geladen werden. Wir kalibrieren Injektionsvolumina durch Messung des Durchmessers der Tröpfchen in Mineralöl auf einem Mikrometer schieben vertrieben. Typischerweise wird eine Injektion von 120 ms mit einem Druck von 20 psi Ertrag eines Tropfens von etwa 1 nl, aber leichte Variationen in Nadeldurchmesser werden diese Parameter beeinflussen und Neukalibrierung kann zwischen Nadeln erforderlich. </li><li> Die Injektionen werden unter einem Stereomikroskop bei 6-10-facher Vergrößerung durchgeführt. Wir verwenden ein Paar feine Pinzette auf den Embryo in Position zu halten, drücken Sie die Injektionsnadel mit gleichmäßigem Druck durch die Chorion und in den Dotter eines Embryos in der einen Zelle oder Anfang zwei Zellen der Bühne. Idealerweise positionieren wir die Nadelspitze in den Dotter knapp unterhalb der Blastomeren. Etwa 1 nl Injektionslösung ist ausgeschlossen und die Nadel zurückgezogen. Für jedes Konstrukt spritzen wir ≥ 200 Embryonen. Es ist auch sehr wichtig, für jede Kupplung von Embryonen gesammelt, um eine Schüssel mit injizierten Kontrolle Embryonen zu retten. </li><li> Nach Injektionen abgeschlossen sind sortieren wir die Embryonen, die durch das Entfernen unbefruchteten Eiern, Embryonen geschädigt, und scheiterte Injektionen (Embryonen ohne Phenolrot in Blastomeren). Wir haben dann inkubieren die Embryonen in Embryo Medium bei 28,5 ° C, bis die geeignete Zeit für Beobachtungen. </li></ol> 3. Die Analyse der Mosaik-Expressionsmuster <ol><li> Nach einer geeigneten Inkubationszeit, untersuchen wir die injizierten Embryonen für die Fluoreszenz. Der Zeitpunkt hängt von der normalen Expressionsmuster des endogenen Zebrafisch-Gen, aber wir sehen in der Regel durch die ersten 5 Tage nach der Befruchtung täglich. </li><li> Wir untersuchen die Embryonen für die Fluoreszenz auf einer Olympus MVX10 Makroskop für Epifluoreszenz ausgestattet, aber eine ähnliche Mikroskop in der Lage Low-Power-Bildgebung arbeiten. Wenn es eine große Zahl von Embryonen, die starben oder entwickelt ungewöhnlich in den ersten Tag sind bei der injizierten Kontrollen für die Kupplung, um zu sehen, wenn sie normal aussehen. Wenn die Kontrollen normalen aussehen, ist das häufigste Problem unzureichender Reinheit der injizierten DNA. Auch werden die Embryonen in einem frühen Stadium empfindlich auf die Gesamtmenge des injizierten Plasmid, so ist es möglich, dass die Quantifizierung ungenau war und zu viel DNA injiziert wurde. </li><li> Bei der Untersuchung der Embryonen im Hinterkopf behalten, dass sie alle Mosaik für die injizierten konstruieren. Es wird notwendig sein, um sorgfältig zu prüfen alle Embryonen, vor allem, wenn die erwartete Domäne des Ausdrucks klein ist. Denken Sie auch daran, dass der Ausdruck könnte dynamische, starke Fluoreszenz an Tag 1 könnte für Tag 2 und Embryonen negativ für die Expression der ersten 3 Tage vielleicht etwas an Tag 4 zeigen verschwinden. </li><li> Wir wählen einige Embryonen mit umfangreicher Ausdruck, und diese nutzen, um das Muster der Fluoreszenz durch photomicroscopy Dokument. Nach 5 Tagen von Beobachtungen, sollten die Embryonen in die Anlage zurückgeführt werden und aufgewachsen als Lager. In einigen Monaten, können die Erwachsenen für Keimbahn Übertragung der Transgene zu sehen sein. </li></ol> 4. Ergebnisse Wir sehen eine große variety von Mustern und Ebenen des Ausdrucks, abhängig von der Enhancer-Element analysiert. Wir sind in der Regel daran interessiert, sehr gewebespezifische Expressionsmuster und sind oft mit Schwerpunkt auf Gene in das Skelett zum Ausdruck gebracht. und sind oft mit Schwerpunkt auf Gene in das Skelett zum Ausdruck gebracht. Abbildung 2 zeigt Beispiele von Mosaik Expressionsmuster wir in unserer injizierten Embryonen beobachtet haben, mit Enhancer Regulation der Expression in Knorpel und Knochen. Schließlich machen einen erheblichen Teil der untersuchten Sequenzen nicht regulieren gewebespezifische Expression. Für diese haben wir am häufigsten sehen, nur sehr wenig Fluoreszenz, vielleicht ein paar verstreute Zellen pro Embryo. Weniger häufig, vielleicht sehen wir Fluoreszenz, sondern nur in zwei gemeinsamen Seiten für ektopische Expression, der Epidermis und der Skelettmuskulatur (Abbildung 3). <img src="/files/ftp_upload/1722/1722fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Beispiel von Knorpel und Knochen Expressionsmuster in injizierten Embryonen beobachtet. <img src="/files/ftp_upload/1722/1722fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Es gibt kaum eine Korrelation zwischen Lage der Enhancer in Bezug auf die Gen-und Regulation der Expression. Ein wesentlicher Teil der getesteten Sequenzen nicht regeln gewebespezifische Expression. Diese haben oft sehr wenig Fluoreszenz, oder zwei gemeinsame Standorte für ektopische Expression haben: der Epidermis und der Skelettmuskulatur. (Top) Hellfeldaufnahme (Bottom) GFP-Fluoreszenz Bild.

<ol>
	<li>Fisher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+biological+relevance+of+putative+enhancers+using+Tol2+transposon-mediated+transgenesis+in+zebrafish.">Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1297-12 (2006).</li><li>Balciunas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+a+high+cargo-capacity+transposon+for+genetic+applications+in+vertebrates.">Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates.</a> PLoS Genet. 2 (11), e169-169 (2006).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. , (1995).</li></ol>

Wir haben den Ansatz in unserem Labor für die effiziente Analyse potentieller Enhancer mit Zebrafisch Transgenese verwendet demonstriert. Meistens benutzen wir diesen Ansatz für Gewebe-spezifische Enhancer mit menschlichen Genen assoziiert zu suchen. Trotz des Fehlens von klar Sequenzhomologie die meiste Zeit zwischen Mensch und Fisch nicht-kodierenden Sequenzen, finden wir, dass dieser Ansatz ist in der Regel bei der Identifizierung von Mitteln für die Gene von Interesse, um uns erfolgreich. Die kritischen Faktoren ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Takara LA Taq</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Takara Bio Inc</td>
<td>RR02M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pCR8/GW/TOPO TA Cloning Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>K2500-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gateway LR Clonase II enzyme Mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11791-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Library efficiency competent cells DH5&alpha;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12535-019</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Library efficiency competent cells DB3.1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11782-018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>mMESSAGE mMACHINE Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM1340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HiSpeed Plasmid Midi Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>12643</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>QIAquick PCR Purification Kit </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>28104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pneumatic PicoPump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>SYS-PV820</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

mosaic zebrafish transgenesis for evaluating enhancer sequences

Die Fertigstellung des menschlichen Genoms, zusammen mit dem vieler anderer Arten, hat die Herausforderung zuzuschreiben bestimmte Funktion nicht kodierende Sequenzen hervorgehoben. Ein prominenter Funktion von den nicht codierenden Teil des Genoms ist es, Gentranskription regulieren, jedoch gibt es keine wirksamen Methoden, um im Großen und Ganzen vorherzusagen cis-regulatorische Elemente aus primären DNA-Sequenz. Wir haben ein effizientes Protokoll entwickelt, um funktionell zu bewerten potentielle cis-regulatorische Elemente durch Zebrafisch Transgenese. Unser Ansatz bietet erhebliche Vorteile gegenüber Zellkultur-Techniken für entwicklungspolitisch wichtige Gene, da sie Informationen über die räumliche und zeitliche Genregulation bietet. Umgekehrt ist es schneller und kostengünstiger als vergleichbare Experimente in transgenen Mäusen, und wir routinemäßig anwenden, um Sequenzen aus dem menschlichen Genom isoliert. Hier zeigen wir unseren Ansatz zur Auswahl von Elementen für die Prüfung auf der Grundlage Folge Erhaltung und unser Protokoll für das Klonen Sequenzen und Mikroinjektion sie in Zebrafisch-Embryonen.

Watch this Scientific Journal Video about Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences at JoVE.com

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences

Wir zeigen unseren Ansatz zur Suche nach potenziellen Enhancer-Elemente aus entwicklungsmäßig regulierten Genen und der Bewertung ihrer Funktion durch Mosaik Zebrafisch Transgenese.

Mosaic Zebrafisch Transgenese zur Beurteilung Enhancer-Sequenzen

The completion of the human genome sequence, along with that of many other species, has highlighted the challenge of ascribing specific function to non ...

mosaic-zebrafish-transgenesis-for-evaluating-enhancer-sequences

Research

JoVE Journal

Biology

13.9K Aufrufe.  University of Pennsylvania. Wir zeigen unseren Ansatz zur Suche nach potenziellen Enhancer-Elemente aus entwicklungsmäßig regulierten Genen und der Bewertung ihrer Funktion durch Mosaik Zebrafisch Transgenese.

Serie: Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences

Zebrafish Brain Ventricle Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved cavities within the brain that are filled with cerebrospinal fluid.  In zebrafish, after neural tube formation, the neuroepithelium undergoes a series of constrictions and folds while it fills with fluid resulting in brain ventricle formation.  In order to understand the process of ventricle formation, and the neuroepithelial shape changes that occur at the same time, we needed a way to visualize the ventricle space in comparison to the brain tissue.  However, the nature of transparent zebrafish embryos makes it difficult to differentiate the tissue from the ventricle space.  Therefore, we developed a brain ventricle injection technique where the ventricle space is filled with a fluorescent dye and imaged by brightfield and fluorescent microscopy.  The brightfield and the fluorescent images are then processed and superimposed in Photoshop.  This technique allows for visualization of the ventricle space with the fluorescent dye, in comparison to the shape of the neuroepithelium in the brightfield image.  Brain ventricle injection in zebrafish can be employed from 18 hours post fertilization through early larval stages.  We have used this technique extensively in our studies of brain ventricle formation and morphogenesis as well as in characterizing brain morphogenesis mutants (1-3).

After neural tube formation, the neuroepithelium constricts and folds while the tube fills with embryonic cerebrospinal fluid (eCSF) to form the embryonic brain ventricles. We developed this ventricle injection technique to better visualize the fluid filled space in contrast to the neuroepithelial shape in a live embryo.

Zebrafisch Gehirn Ventrikel Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved ...

Forschung

Biologie

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression analyses by RNA interference and stable transgenesis remain limited in many species due to the particular anatomy and molecular cellular biology of the organism. For example, outside of the crown group Caenorhabditis that includes Caenorhabditis elegans3, stably transmitted transgenic lines in non-Caenorhabditis species have not been reported in this specious phylum (Nematoda), with the exception of Strongyloides stercoralis4 and Pristionchus pacificus5. To facilitate the expanding role of P. pacificus in the study of development, evolution, and behavior6-7, we describe here the current methods to use microinjection for making transgenic animals and gene knock down by RNAi. Like the gonads of C. elegans and most other nematodes, the gonads of P. pacificus is syncitial and capable of incorporating DNA and RNA into the oocytes when delivered by direct microinjection. Unlike C. elegans however, stable transgene inheritance and somatic expression in P. pacificus requires the addition of self genomic DNA digested with endonucleases complementary to the ends of target transgenes and coinjection markers5. The addition of carrier genomic DNA is similar to the requirement for transgene expression in Strongyloides stercoralis4 and in the germ cells of C. elegans. However, it is not clear if the specific requirement for the animals' own genomic DNA is because P. pacificus soma is very efficient at silencing non-complex multi-copy genes or that extrachromosomal arrays in P. pacificus require genomic sequences for proper kinetochore assembly during mitosis. The ventral migration of the two-armed (didelphic) gonads in hermaphrodites further complicates the ability to inject both gonads in individual worms8. We also demonstrate the use of microinjection to knockdown a dominant mutant (roller,tu92) by injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the gonads to obtain non-rolling F1 progeny. Unlike C. elegans, but like most other nematodes, P. pacificus PS312 is not receptive to systemic RNAi via feeding and soaking and therefore dsRNA must be administered by microinjection into the syncitial gonads. In this current study, we hope to describe the microinjection process needed to transform a Ppa-egl-4 promoter::GFP fusion reporter and knockdown a dominant roller prl-1 (tu92) mutant in a visually informative protocol.

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

In model organisms, transgenesis can manipulate gene functions while RNAi can knockdown specific mRNA transcripts 1-2. This protocol aims to illustrate the techniques needed to introduce stably transmitted DNA and transient double stranded RNA into the necromenic nematode Pristionchus pacificus for studies in evolutionary, developmental, and behavioral biology.

RNAi-vermittelte Gene Knockdown und Transgenese durch Mikroinjektion in die Necromenic Nematode Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in die Adult Zebrafisch Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in das Regenerations Adult Zebrafisch Leitwerk

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

Laser-Schädigung der Zebrafisch Embryonale Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

Die Tomate / GFP-FLP / FRT Verfahren zur Live-Imaging von Mosaic Erwachsene<em&gt; Drosophila</em&gt; Sehzellen

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

Mammalian spermatogenesis is a complex differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous tubules of the testes. Currently, there is no reliable cell culture system allowing for spermatogenic differentiation in vitro, and most biological studies of spermatogenic cells require tissue harvest from animal models like the mouse and rat. Because the testis contains numerous cell types - both non-spermatogenic (Leydig, Sertoli, myeloid, and epithelial cells) and spermatogenic (spermatogonia, spermatocytes, round spermatids, condensing spermatids and spermatozoa) - studies of the biological mechanisms involved in spermatogenesis require the isolation and enrichment of these different cell types. The STA-PUT method allows for the separation of a heterogeneous population of cells - in this case, from the testes - through a linear BSA gradient. Individual cell types sediment with different sedimentation velocity according to cell size, and fractions enriched for different cell types can be collected and utilized in further analyses. While the STA-PUT method does not result in highly pure fractions of cell types, e.g. as can be obtained with certain cell sorting methods, it does provide a much higher yield of total cells in each fraction (~1 x 108 cells/spermatogenic cell type from a starting population of 7-8 x 108 cells). This high yield method requires only specialized glassware and can be performed in any cold room or large refrigerator, making it an ideal method for labs that have limited access to specialized equipment like a fluorescence activated cell sorter (FACS) or elutriator.

The STA-PUT method allows for the separation of different populations of spermatogenic cells based on size and density.

Die Trennung der Spermatogenese Zelltypen Mit STA-PUT Velocity Sedimentation

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

Automatisierte Analyse von dynamischen Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signale in Bildsequenzen

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity greatly impacts cell behavior to regulate normal and pathologic processes including cell proliferation, differentiation, adhesion signaling and directional migration. In this regard, the innate ability of certain cell types to migrate towards a stiffer, or less compliant matrix substrate is referred to as durotaxis. This phenomenon plays an important role during embryonic development, wound repair and cancer cell invasion. Here, we describe a straightforward assay to study durotaxis, in vitro, using polydimethylsiloxane (PDMS) substrates. Preparation of the described durotaxis chambers creates a rigidity interface between the relatively soft PDMS gel and a rigid glass coverslip. In the example provided, we have used these durotaxis chambers to demonstrate a role for the cdc42/Rac1 GTPase activating protein, cdGAP, in mechanosensing and durotaxis regulation in human U2OS osteosarcoma cells. This assay is readily adaptable to other cell types and/or knockdown of other proteins of interests to explore their respective roles in mechanosignaling and durotaxis.

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.

Ein vereinfachtes System zur Bewertung der Zell Mechanosensing und Durotaxis<em&gt; In-vitro-</em

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...