authors gratefully acknowledge funding support from the Molly Towell Perinatal Research Foundation, Canadian Institutes of Health Research (CIHR), and Fonds de Recherche du Qu&#233;bec &#8211; Sant&#233; (FRQS) (to MGF) and CIHR-Quebec Training Network in Perinatal Research (QTNPR) (to LDD).
The authors wish to thank Esther Simard, Marco Bosa, Carl Bernard and Carmen Movila for technical assistance.

Tierpflege folgte den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care und der Genehmigung durch die Université de Montréal Council on Animal Care (Protokoll # 10-Rech-1560). Detaillierte Informationen über Materialien und Methoden ist in der Tabelle 1 angegeben. 1. Anästhesie <ol><li> Legen Sie eine Single-Lumen-Katheter in eine Halsschlagader. </li><li> Sedieren das Mutterschaf mit Acepromazin (Atravet 10 mg / ml) 2 mg intravenös etwa 30 min vor der Einleitung der Narkose, um Spannungen mit der Prozedur, die wiederum reduziert Cortisolspiegel zu reduzieren. </li><li> Verabreichen Diazepam (Diazepam 5 mg / ml) 20 mg Ketamin (Ketalar 100 mg / ml), 4-5 mg / kg und Propofol (Propofol 10 mg / ml) 0,5 bis 1 mg / kg intravenös an allgemeine Betäubung. </li><li> Legen Sie eine Atemwegsaustauschkatheter in die Luftröhre mit Hilfe eines Laryngoskops mit einer Wisconsin-Typ Klinge (Extralange 350 mm Linkshänder Blade), um mit der Intubation zu unterstützen. Schieben des Silizium Endotrachealtubus (9 bis 12 mm Innendurchmesser) von dem Atemweg Austauschkatheter in die Luftröhre. Diese Technik ermöglicht die Intubation Prozess. Pumpen Sie die Manschette des Endotrachealtubus sorgfältig, um den Druck-induzierten Ulzera der Luftröhre zu vermeiden und fixieren das Rohr auf den Kopf des Mutterschaf. </li><li> Verbinden Sie den Tubus auf die Atemkreis des Narkosegerät und beginnt sofort mit der mechanischen Beatmung. Ventilatoreinstellungen anzupassen, um eine P a CO 2 innerhalb der normalen Grenzen von 35 bis 45 mmHg zu erhalten. </li><li> Setzen Sie einen Katheter in die A. auricularis (22 bis 20 g; 1 in [0,9 x 25 mm], um 1.16 in [1.1 x 30 mm]) und eine Verbindung zu nicht konformen Schlauch an direkten arteriellen Blutdruck zu überwachen. </li><li> Verwenden Sie ein Multiparameter-physiologischen Monitor an das Elektrokardiogramm, direkte arterielle Blutdruck, Sauerstoffsättigung (SpO 2), Kapnographie aufnehmen (P ET CO 2), und die Temperatur alle 5 min. Übertragen Sie alle physiologic Daten über ein serielles Kabel an eine zentrale physiologische Daten Sammelcomputer. Aufrechterhaltung der normalen Körpertemperatur mit Hilfe eines Umlaufwasserdecke. </li><li> Verwalten eines ausgewogenen polyionische Lösung bei 10 ml / kg für die erste Stunde der Narkose und dann auf 5 ml / kg / h zu verringern. </li><li> Verwalten Trimethoprim-Sulfadoxin 5 mg / kg IV des Mutterschaf gerade vor dem Hautschnitt als Antibiotikaprophylaxe. </li><li> Verwenden Sie Standard-aseptischer Techniken bei allen chirurgischen Manipulationen des Mutterschaf und Fötus. </li><li> Barrier Krankenschwester die Mutterschafe zu allen Zeiten. Dies schließt auch den nicht-chirurgischen Personals. Dadurch wird der enzootischen Potenzial zB Coxiella burnetii zu minimieren. Mit Handschuhen und Masken (N-95-Typ) zu allen Zeiten. </li></ol> 2. Überblick über das chirurgische Verfahren <ol><li> Machen Sie eine 20 cm Mittelschnitt durch den unteren Bauchwand unmittelbar kranial des Euters durch die Linea alba, um Bauchmuskelschäden zu minimieren. <ol><li> Retract das große Netz kranial und die Gebärmutterhörner werden manuell palpiert. Abtasten jedes Horn aus dem Körper des Uterus auf die Spitze des Horns zu bemerken, die Zahl der Feten und ihrer Größe. Wenn es mehr als ein Fötus, wählen Sie die größere Fötus durch die Auswertung manuell die Kopfgröße und die Breite zwischen den Umlaufbahnen. </li><li> Halten Sie den Kopf des Fötus gewählt fest durch die Gebärmutter teilweise nach außen verlagert. Führen Sie eine 10 cm hysterotomy auf der großen Krümmung mit Metzenbaumschere. Setzen Sie sofort über den Kopf eine nicht-Latex-sterile OP-Handschuh mit steriler Kochsalzlösung gefüllt ist, als ob es eine Hand waren. Alternativ können Sie angefeuchteten 4x4, um die fetale Kopf feucht zu halten. Sichern Sie die Gebärmutter, um die Bauchwand. <ol><li> Exteriorisieren der rechten und linken Brust Gliedmaßen und ziehen Sie den Fötus vorsichtig aus der Gebärmutter bis zum Schwertfortsatz. </li></ol></li><li> Legen Polyvinyl Katheter in die rechte und linke Armvene und Arterien mit einem Standard-Cut-down-Technik. Legen another Polyvinylkatheter in die Amnionhöhle durch Fixieren ihrer &#39;Ende mit dem Brustbein des Fötus. <ol><li> Verwenden Sie nur sterile Katheter. Wir empfehlen Gassterilisation in Ihrem Standard-Anlage. Befestigen Sie jede Katheters mit einer Nadel und die Nadel in einen doppelten Hahn für eine spätere Entnahme von Blut oder Drucküberwachung zu ermöglichen. </li></ol></li><li> Naht Edelstahl-Elektroden, um den Hammergriff, Schwertfortsatz und zu jedem Punkt der Schulter, um die EKG-Überwachung (EKG). </li><li> Bringen Sie den Fötus in die Gebärmutter. Alle Katheter und Elektroden Ausfahrt über eine kleine Stichinzision in der linken Flanke. </li><li> Schließen Sie die Laparotomie mit einem Drei-Schicht-Verschluss. Naht der Bauchwand mit einem synthetischen resorbierbaren Monofilamentnahtmaterial USP 2 in einer einfachen kontinuierlichen Weise. Schließen Sie den subkutanen Raum mit einem synthetischen resorbierbaren geflochtenen Naht USP 0 in einem einfachen kontinuierlichen Weise. Verwenden chirurgischem Edelstahl Klammern, um den Hautschnitt zu schließen. </li></ol></li><li&gt; Beschreibung der chirurgischen Prozedur <ol><li> Entfernen Wolle durch Rasieren das Schwertfortsatz auf die Brustdrüse und entlang der Falte der Flanke auf jeder Seite mit einer Klinge # 40 Reinigen Sie das ventrale Abdomen dann gründlich mit einer 4% Chlorhexidingluconat und einer weichen Bürste für 3 min. <ol><li> Führen Sie eine Standard-sterile Peeling mit Chlorhexidingluconat 4% von der Mitte des Bauches und Fortschritte in einer Kreisel Mode für 3 min. Gießen Sie steriler Kochsalzlösung auf den Bauch, um das Desinfektionsmittel Seife entfernen. Für den letzten Schritt des chirurgischen Vorbereitung, führen drei alternative Passagen Chlorhexidingluconat-Lösung 2% Isopropylalkohol 70%. </li></ol></li><li> Sicherstellen, dass die Tiefe der Anästhesie ausreichende vor der Inzision. Einen Standard Laparotomieschnitts vom Nabel nur Schädel an das Euter durch die Linea alba, um Bauchmuskelschäden zu minimieren. </li><li> Führen Sie einen langen Schwammzange in den Bauch auf der linken Bauchwand bisder geplanten Austrittsstelle für Katheter im paracostal Region. <ol><li> Stecken Sie die Spitzen der Pinzette gegen die Wand, bis eines Assistenten kann es zu lokalisieren und bestätigen Sie die entsprechende Website. Öffnen Sie leicht (1 cm) der Backen der Zange und lassen Sie den Assistenten machen einen 2 cm voller Dicke Stichinzision. </li><li> Exteriorisieren die Spitzen der Pinzette durch den Einschnitt, wieder zu öffnen, und sanft erfassen die Katheter mit der Zange, die wird schließlich aus dem Bauch durch die ventrale Bauchschnitt gezogen. Zu beachten ist, einige Gruppen zu implantieren, die Katheter und dann exteriorisieren ihnen. Dies hat den Nachteil, dass intra fötalen EKG-Überwachung ist nicht möglich. </li></ol></li><li> Tasten Sie die Gebärmutter, um fötalen Position und Zahlen zu ermitteln. Bestimmen Sie die größte Fötus mit der interaurale erreichbar. Einzuschneiden der Gebärmutterwand auf der großen Krümmung über dem Rücken des Kopfes, die Vermeidung der Keimblättern. <ol><li> Legen Sie eine stumpfendige Kanüle durch die Plazentamembranen, um eine Uhr zu erhaltenniotic Flüssigkeitsprobe frei von Blutungen. Einzuschneiden die Plazentamembranen mit einer Schere. </li></ol></li><li> Exteriorisieren die Schädel Hälfte des Fötus durch diesen Einschnitt. Legen Sie eine sterile nicht Latex chirurgische Handschuh mit steriler Kochsalzlösung bei 37 ° C über den Fötus Kopf gefüllt zur Aufrechterhaltung der Normothermie. <ol><li> Während der Entfernung des fetalen Oberkörper aus der Gebärmutter, haben der Assistent halten Sie die Babcock herauf, um den Verlust von Fruchtwasser zu verhindern. Dann, wiederum unter Verwendung Babcock Zange klemmen die fötalen Membranen und Gebärmutterwand zur Haut Bauch Kontamination mit Fruchtwasser zu verhindern. </li><li> Expose nur die Teile des fetalen Körpers, die instrumentiert werden und die restlichen Teile in der Gebärmutter zu halten oder mit feuchten und warmen (37 ° C) sterilen Tüchern abgedeckt, die jeweils benötigen. </li></ol></li><li> Entführen die beiden Brust Gliedmaßen, um die Exposition gegenüber der Oberarmarterie zu erleichtern und Vene auf bilateraler Ebene. Einzuschneiden entlang der medialen Seite von sowohl Antebrachiums und Pflegevollständig um die Oberarmarterie und Vene zu sezieren. </li><li> Legen Polyvinyl Katheter in den rechten und linken Arm-Arterien und links Armvene mit einem Standard-Cut-down-Technik. <ol><li> Befreien Sie das Schiff, um von benachbarten Gewebe über 1 cm katheterisiert werden. Ligieren der distale Abschnitt des Gefäßes mit einem geflochtenen synthetischen resorbierbaren USP 2-0 Naht. Preplace eine Ligatur am proximalen Aspekt des Schiffes aber halten Sie es losgebunden. <ol><li> Verwendung CASTRO Schere, geschnitten das Gefäß quer zu etwa 30% seines Durchmessers. Stoppen Sie den Blutfluss teilweise durch Ziehen an der proximalen Naht. Stecken Sie den Katheter in proximaler Richtung. </li></ol></li><li> Legen Sie die Polyvinyl-Katheter bis zu 8 cm proximal oder bis Widerstand erkannt und ziehen Sie dann leicht zurück. Zeitlich sichern den proximalen Teil des Katheters mit einer Gefäßklemme. Stellen eine weitere Naht um sowohl den proximalen und distalen Seite des Katheters. Ein Assistent wird kontinuierlich aspirating und Spülen des Katheters, um die Durchgängigkeit des Katheters zu gewährleisten. </li><li> Schließen Sie die fetale Haut mit einem USP 2-0 geflochtenen synthetischen resorbierbaren Nahtmaterial, mit einer fortlaufenden Naht Muster. </li></ol></li><li> Auf der rechten und der linken Schulter, Manubrium und Schwertfortsatz, befestigen eine isolierte Edelstahl-Elektrode, um die Überwachung des fötalen ECG zu erleichtern. </li><li> Naht der Fruchtwasserdruck und Sampling-Katheter mit dem Brustbein. Dieser Katheter ist an seinem Ende gefenstert. </li><li> Sicherung aller der Katheter auf dem Rücken des Fötus unter Verwendung einer USP 2-0 geflochtenen synthetischen resorbierbaren Nahtmaterial. </li><li> Vor dem Austausch des Fötus zurück in die Gebärmutter, zu verwalten Clenbuterol 30 ug IV langsam über 15 Minuten zu Hypotonie zu vermeiden und Gebärmutter Entspannung. </li><li> Naht der Eihäute mit USP 4-0 geflochtenen synthetischen resorbierbaren Nahtmaterial mit einem durchgehenden Muster. Integrieren Sie nur einen Katheter oder eine Elektrode in einer Zeit, in die closure, um einen dichten Verschluß zu gewährleisten. Verwenden Sie einen Doppelschicht-Cushing-Muster respektieren Halsted Prinzipien, um die Gebärmuttermuskelschicht zu schließen mit einem USP 0 geflochtenen synthetischen resorbierbaren Nahtmaterial. Begraben die chirurgische Knoten sorgfältig. </li><li> Unter Verwendung einer Tabaksbeutelnaht Muster, sichern alle Katheter und EKG-Kabel wie sie aus der linken paracostal Einschnitt. </li><li> Unter Verwendung eines USP 2 Monofilament synthetischen resorbierbaren Nahtmaterial sichern die Linea alba mit einem kontinuierlichen Muster. Schließen Sie die subkutanen Gewebe unter Verwendung USP 2-0 geflochtenen synthetischen resorbierbaren Nahtmaterial mit einem durchgehenden Muster. Sichern Sie die Hautschicht mit chirurgischen Klammern. </li><li> Verabreichen 250 mg Ampicillin intravenös und wieder über die Frucht Katheter in die Amnionhöhle. Ersetzen Sie verlorene Fruchtwasser mit warmem Salzlösung. </li><li> Legen Sie alle exteriorisiert Katheter und EKG-Elektroden in einen Ort Beutel, um die Sterilität zu erhalten. Legen Sie einen glatt um den Oberkörper des Mutterschaf, alle Katheter eine Sicherungd Elektroden auf den Körper des Mutterschaf. </li><li> Stoppen Vollnarkose und extubieren die ewe einmal Kehlkopfreflexe wieder normalisiert haben. </li><li> Schicken Sie das Mutterschaf zu einer Stoffwechselkäfig, sobald sie stabil folgenden Vollnarkose. Das Mutterschaf in der metabolischen Käfig für die Dauer des Experiments liegen. Das Mutterschaf sollten in der Lage zu stehen, sich hinzulegen und zu essen ad libitum während der Überwachung des nicht-narkotisierten Fötus ohne sedierende die Mutter zu sein. </li><li> Für die folgenden drei Tagen zu verabreichen Antibiotika prophylaktisch auf das Mutterschaf (Trimethoprim sulfadoxine 5 mg / kg) und Fetus (250 mg Ampicillin intravenös und wieder über das Fruchtwasser Katheter). </li><li> Bewerten Sie die Stoffwechsellage der beiden Mutterschaf und Fötus mit Blutgasanalysen. </li><li> Spülen Sie alle Katheter mit dem minimalen Volumen von heparinisierter Kochsalzlösung möglich ist. Achtung - Sie überschreiten nicht die tägliche Dosis von Heparin und Flüssigkeiten zulässig für den Fötus. Es ist möglich, Flüssigkeitsüberbelastung den Fötus. Flush langsam einmalTag ~ 5 ml NaCl pro Zeile nach der Antibiotika-Prophylaxe. </li></ol></li><li> Datenerfassung und Analyse <ol><li> Während der Operation wahlweise Aufzeichnung der mütterlichen und fetalen EKG und Herzfrequenz sowie mütterlichen arteriellen Blutdruck und Atemwegsdruck (Paw) kontinuierlich (Abbildung 1). Verwenden Sie das Leben Monitorfenster, um alle Daten außer mütterlichen EKG zu erwerben. Futtermittel, die solche Daten in Analog-Digital-Wandler zusammen mit fetale und maternale EKG-Signale; geben mütterlichen und fetalen EKG zunächst in 1901 Vorverstärker. Die Bilanz und zeigt alle Daten in Herstellersoftware. </li><li> Nehmen Sie einen 1 mL arteriellen Probe gleichzeitig vom Mutterschaf und Fötus für die arterielle Blutgasanalyse, Laktat, Glukose und stützen überschüssige Bestimmung (im Plasma) am Beginn der fetalen Chirurgie (unmittelbar nach dem Einsetzen des ersten Arterienkatheter) und nach dem Schließen der Gebärmutter . </li><li> Während der postoperativen Erholung, werfen Sie einen 3 ml fetalen Blutprobe, um die IL-6 und TNF-α Inflamm messenAtory Profile. Zentrifuge das Plasma bei 4 ° C (4 min, 4.000 x g) Dekantieren und Speichern der Plasma bei -80 ° C für die nachfolgenden ELISA-Tests. Anmerkung: Für den Zweck der berichteten repräsentative Ergebnisse, sechs Tage nach der Operation wurden die Tiere unter Verwendung von intravenöser Injektion von 20 ml Natriumpentobarbital getötet. Fetale Wachstum wurde von Körper, Gehirn, Leber und Müttergewichte bewertet. Die Dauer der Probezeit wird natürlich variieren je nach der für den jeweiligen Forschungsfrage gewählte Design ab und kann 6 Wochen zu erreichen ~. </li></ol></li><li> Zytokin Analysen (optionaler Schritt) <ol><li> Bestimmen Cytokinkonzentrationen (IL-6, TNF-α) im Plasma unter Verwendung eines Schaf-spezifischer Sandwich-ELISA. Precoat-Maus-Anti-Schaf-monoklonale Antikörper (Fang-Antikörper-IL-6) oder Maus-anti-Rinder-monoklonalen Antikörper (TNF-α) in einer Konzentration 4 ug / ml auf ELISA-Platten bei 4 ° C für O / N nach 3mal Waschen mit Waschpuffer (0,05% Tween 20 in PBS, PBST). </li><li>Die Platten für 1 h mit 1% BSA in PBST. 3 Mal Waschen Sie die Platten mit Waschpuffer. </li><li> Verwenden rekombinanter Proteine ​​Schafe (IL-6, TNF-α) als Standard-ELISA, bereiten eine serielle Verdünnungen reichen von Standard 1 von 2.000 ng / ml bis Standard 7 von 31,25 pg / ml. </li><li> Last 50 ul Serien verdünnten Protein Standards und Proben pro Well und Inkubation für 2 h bei RT, waschen Sie die Platten 3-mal. Führen Sie alle Standards und Proben in zweifacher Ausfertigung. </li><li> Je 50 &amp; mgr; l von Kaninchen-Anti-Schaf-polyklonaler Antikörper (Nachweis-Antikörper IL-6) oder Kaninchen-anti-Rinder-polyklonalen Antikörpers (TNF-α) in einer Verdünnung von 1: 250 in den Vertiefungen und Inkubieren für 30 min bei RT. 5 mal Waschen Sie die Platten mit Waschpuffer. </li><li> Dann werden 50 ul des Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-HRP konjugiert (Verdünnung 1: 5000) für 30 min. </li><li> Inkubieren mit 50 &amp; mgr; l TMB-Substrat-Lösung pro Well. </li><li> Stoppen Farbentwicklungsreaktion zum gewünschten Zeitpunkt mit 25 ul 2 N Schwefelsäure. </li><li> Lesen Sie die plAtes auf ELISA-Plattenlesegerät bei 450 nm, mit einem 570 nm Wellenlängenkorrektur. Anmerkung: In unseren Assays die Empfindlichkeit der IL-6 ELISA war 16 pg / ml, die Empfindlichkeit von TNF-a ELISA betrug 13,9 pg / ml. Für alle Tests wurde die Intra-Assay und Inter-Assay-Variationskoeffizienten &lt;5% und &lt;10% betragen. </li></ol></li><li> Statistische Auswertungen Hinweis: Die genauen statistischen Methoden werden auf der Fragestellung ab. Hier berichten wir über die verwendet werden, um signifikante Unterschiede bei den in Tabelle 2 angegebenen Blutgase Prüfverfahren. <ol><li> Testen normalen Datenverteilung mit Kolmogorov-Smirnov-Test, gefolgt von parametrisch oder nicht-parametrische Tests mit Anpassung für multiple Vergleiche, als angemessen. </li><li> Verwenden K-Mittel-Cluster-Analyse, um die Föten in der Kohorte, die spontan hypoxischen waren und legt die jeweiligen pO 2 und O 2 Sat-Werte (betrachten pO 2 &lt;20 mmHg oder O 2 Sa &lt;55%, wie Fetal Hypoxie). 44-48 </li><li> Verwenden statistischer Software wie SPSS für die Analysen. </li><li> Vorliegenden Daten als Mittelwert ± Standardabweichung mit statistischen Unterschiede bei p &lt;0,05 als signifikant angesehen. </li></ol></li></ol>

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Das Anästhetikum und chirurgischen Verfahren vorgestellt, das für die Herstellung eines Tiermodells zur Untersuchung der Physiologie und Pathophysiologie fötalen erforderlich sind: die chronisch mit Instrumenten nicht-narkotisierten fetalen Schafen. Vier kritischen Schritte in dem Protokoll hervorzuheben. Erstens, vorbei an den Katheter und Elektroden durch das mütterliche Flanke: Es ist wichtig, dass dies sofort getan an inneren Organen Verletzungen zu vermeiden. Zweitens Befestigen des...

Eine Vielzahl von Tiermodellen gibt es für die Untersuchung der normalen und kompromittiert Schwangerschaften, einschließlich Labornagern, nicht-menschlichen Primaten und Hauswiederkäuer. 1.2.3.4.5 Die chronisch instrumentierten trächtigen Schafen wurde ausgiebig seit 50 Jahren als verwendet ein Modell der menschlichen fötalen Entwicklung und antwortet pathophysiologische Stimuli, wie Lipopolysaccharid (LPS). 6-10 Die Läsionen nach der LPS-Exposition zu imitieren, was genau in Frühgeborenen mit Periventrikuläre Leukomalazie, was auf eine ähnliche Reifungsprofil beider Arten gesehen. 11, 12 Andere Komplikationen während der Schwangerschaft auch im Detail, wie die Entdeckung, dass vorgeburtliche Glukokortikoide fördern Lungenentwicklung 13-15 und das Verständnis der Auswirkungen der intrauterinen Wachstumsretardierung (IUGR) auf den Fötus 16,17 sucht. Die umfangreiche Verwendung von fetalen Schafmodell aufgrund der uniq istue amenability des nicht-narkotisierten fetalen Schaf zur chirurgischen Anordnung und Wartung von Katheter und Elektroden, so dass sich wiederholende Blutentnahme Aufzeichnung bioelektrische Aktivität, Anlegen elektrischer Stimulation und in vivo bildgebenden Verfahren. 18 Telemetrie ist auch möglich, wenn auch weniger häufig verwendete doch aufgrund der höheren Komplexität als auch die Einrichtung als Anfangs und Wartungskosten. 19 Darüber hinaus ist das fetale Schafmodell sehr vielseitig, da viele Variationen der Instrumentierung möglich, je nach den Maßnahmen von Interesse. Beispielsweise ist es möglich, über mehrere Tage bis Wochen aufzuzeichnen multivariate Signale in Echtzeit wie fötalem Atembewegungen, elektrische Gehirnaktivität, Herzkreislaufreaktionen, Elektrokardiogramm, regionalen Blutfluss in einem Bereich von Organen mit Strömungssonden oder Mikrokügelchen, usw. Dank Diese Vielseitigkeit, eine breite Palette von Studien durchgeführt worden, einschließlich der Entwicklung der cardiovascular System 20,21, Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren (HPA) Achse 22, die Entwicklung des Gehirns 23 und Schlafzustände Entwicklung insbesondere 24, Auswirkungen von Hypoxie / Asphyxie 25, therapeutischen Hypothermie 26, Entzündung 6-11, Kombination von 27, Glucocorticoide 28,29, Anti-Depressiva 30, bronchopulmonalen Dysplasie (BPD) 31,32, fötale Programmierung 33,34,35,36,37,38,39 oder Entwicklung neuartiger fetale Überwachung Modalitäten vor und während der Geburt zu aber Namen ein einige Bereiche der Untersuchung. 40,41,42,43 Das übergeordnete Ziel des vorgestellten Verfahrens ist es, grundlegende Implementierung dieser vielseitigen Modells zeigen. Es ermöglicht die Einrichtung einer Vielzahl von akuten und chronischen experimentelle Protokolle studieren fetalen Physiologie und Pathophysiologie an der integrativen, Orgel, zellulärer und molekularer Ebene.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACE Light source</td>
			<td>Schott-Fostec</td>
			<td>A20500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060 - 11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled dissecting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15006 - 09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003 - 12</td>
			<td>alternating dissecting tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved scalpel blades #12</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10012 - 00</td>
			<td>alternating dissecting tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16044 - 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S &#38; T suture tying forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00272 - 13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont SS forceps - angled</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11203 - 25&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braided silk suture size 6-0</td>
			<td>Teleflex Medical</td>
			<td>07 - 30&#160; - 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Tape</td>
			<td>transpore</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride 100 mg/ml</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC 0409 - 2051 - 05</td>
			<td>Final Does is 80 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tranqui Ved Injection (xylazine 100 mg/ml)</td>
			<td>Vecdo</td>
			<td>NDC 50989 - 234 - 11</td>
			<td>Final Does is 10 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive orange 14</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>R - 8254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringers Solution Components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution is gas equilibrated with 95% O2 and 5% Co2, final pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Final Concentration: 118 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217 - 3</td>
			<td>Final Concentration: 4.7 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79 - 500</td>
			<td>Final Concentration: 2.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P -285</td>
			<td>Final Concentration: 1.2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>Jan-00</td>
			<td>Final Concentration: 0.57 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP 310 - 500</td>
			<td>Final Concentration: 5.95 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Final Concentration: 5.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LifeWindow</td>
			<td>Digicare Biomedical Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CED bioamplifier and ADC units</td>
			<td>Cambridge Electronic Design Limited, 
			Unit 4, Science Park, 
			Milton Road, 
			Cambridge CB4 0FE 
			ENGLAND.</td>
			<td>Bioamp: 1902; ADC: micro1401; Data acquisition software: Spike 2, V7.13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurolog analog signal bioamplifier</td>
			<td>Digitimer Ltd 
			37 Hydeway 
			Welwyn Garden City 
			Hertfordshire, AL7 3BE, England</td>
			<td>NL108A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABL800Flex</td>
			<td>Radiometer Canada; 200 Aberdeen Dr, London, ON N5V 4N2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5804R</td>
			<td>Eppendorf Canada; 2810 Argentia Road, #2 
			Mississauga, Ontario, L5N 8L2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arrow Jugular Catheterization Set</td>
			<td>Arrow International, Inc., 2400 Bernville Road, Reading, PA 19605 USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atravet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diazepam</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Ketalar</td>
			<td></td>
			<td>100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propofol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SurgiVeT</td>
			<td>Endotracheal Tubes; Smiths Medical ASD, Inc. St. Paul, MN 55112, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cook Airway Exchange Catheter with RAPI-FIT Adapters</td>
			<td>Cook Critical Care 750, Bloomington IN 47402-0489 USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispomed Ventilator</td>
			<td>Dispomed Ltd., 745 Nazaire-Laurin, Joliette, Quebec J6E 0L6</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insyte-W</td>
			<td>Becton Dickinson, Infusion Therapy Systems Inc., 9450 S State St, Sandy Utah 84070 USA</td>
			<td></td>
			<td>22 to 20 G; 1 in [0.9 x 25 mm] to 1.16 in [1.1 x 30 mm]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edwards Lifesciences Ref: PX272 Pressure monitoring kit with TruWave Disposable Pressure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LifeWindow LW6000</td>
			<td>Digicare Biomedical Technology 107 Commerce Road, Boynton Beach, FL 33426-9365 USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gaymar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Babcock</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl catheters</td>
			<td>SCI (Scientific Commodities Inc.)</td>
			<td></td>
			<td>2 meters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-0 Vicryl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrocardiogram (ECG)</td>
			<td>LIFYY, Metrofunk Kabel-Union, Berlin, Germany</td>
			<td></td>
			<td>four copper electrodes in single sheath, 2 meters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-O Vicryl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 Vicryl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDS II USP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethoprim sulfadoxine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopcock</td>
			<td>Argon Medical, Cat&#160;041220001A</td>
			<td></td>
			<td>Double 4-way Stopcock with male luer lock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>Tyco Healthcare 8881202389</td>
			<td></td>
			<td>Monoject aluminum hub blunt needles, 22Gx, 0.7mmx 38.1mm: for fetal arterial and venous catheters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>Tyco Healthcare 8881202322</td>
			<td></td>
			<td>Monoject aluminum hub blunt needles, 16Gx, 1.6mmx38.1mm: for amniotic catheters</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

instrumentation of near-term fetal sheep for multivariate chronic non-anesthetized recordings

The chronically instrumented pregnant sheep has been used as a model of human fetal development and responses to pathophysiologic stimuli such as endotoxins, bacteria, umbilical cord occlusions, hypoxia and various pharmacological treatments. The life-saving clinical practices of glucocorticoid treatment in fetuses at risk of premature birth and the therapeutic hypothermia have been developed in this model. This is due to the unique amenability of the non-anesthetized fetal sheep to the surgical placement and maintenance of catheters and electrodes, allowing repetitive blood sampling, substance injection, recording of bioelectrical activity, application of electric stimulation and in vivo organ imaging. Here we describe the surgical instrumentation procedure required to achieve a stable chronically instrumented non-anesthetized fetal sheep model including characterization of the post-operative recovery from blood gas, metabolic and inflammation standpoints.

38 schwangere zeit vom Mutterschafe wurden bei 128 ± 2 Tagen der Trächtigkeit instrumentiert (DGA ~ 0,88 Trächtigkeit tige 145 DGA) mit arteriellen, venösen und Frucht Katheter und Elektrokardiogramm (EKG) Elektroden mit steriler Technik unter Vollnarkose (sowohl Mutterschaf und Fötus ). Im Falle einer Zwillingsschwangerschaft wurde der größere Fetus basierend auf Palpation und der Schätzung der intertemporalen Durchmesser gewählt wird; alternativ kann der Fötus instrumentiert werden nach dem Zufallsprinzip au...

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Instrumentation of Near-term Fetal Sheep for Multivariate Chronic Non-anesthetized Recordings

Die chronisch instrumentierten nicht-narkotisierten fetaler Schafsmodell wird verwendet, um die menschliche Entwicklung des Fötus in Gesundheit und Krankheit zu studieren, weil es chirurgische Platzierung und Wartung von Katheter und Elektroden, repetitive Blutentnahme, Substanz Injektion, Aufnahme der bioelektrischen Aktivität und in vivo-Bildgebung ermöglicht. Wir beschreiben die erforderlich ist, um dieses Modell zu etablieren Verfahren.

Besetzung des Kurzfristige Fetal Schafe für Multivariate Chronische Non-narkotisierten Recordings

The chronically instrumented pregnant sheep has been used as a model of human fetal development and responses to pathophysiologic stimuli such as ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.3K Aufrufe.  CHUV, Université de Montréal, St-Hyacinthe, QC.  Die chronisch instrumentierten nicht-narkotisierten fetaler Schafsmodell wird verwendet, um die menschliche Entwicklung des Fötus in Gesundheit und Krankheit zu studieren, weil es chirurgische Platzierung und Wartung von Katheter und Elektroden, repetitive Blutentnahme, Substanz Injektion, Aufnahme der bioelektrischen Aktivität und in vivo-Bildgebung ermöglicht. Wir beschreiben die erforderlich ist, um dieses Modell zu etablieren Verfahren. 

Serie: Instrumentation of Near-term Fetal Sheep for Multivariate Chronic Non-anesthetized Recordings

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

Herstellung und Kultur von Myogenic Vorläuferzellen / Primär-Myoblasten aus Skelettmuskel von adulten und im Alter von Menschen

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

Isolierung und Charakterisierung von mesenchymalen Stromazellen aus Nabelschnur und Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types that are distinct not only in molecular and morphological features but also in physiological properties. These differences reflect their diverse functions, which together establish the necessary microenvironment for the post-testicular sperm development in the epididymal lumen. The understanding of the biophysical properties of the epididymal epithelial cells is critical for revealing their functions in sperm and reproductive health, under both physiological and pathophysiological conditions. While their functional properties have yet to be fully elucidated, the epididymal epithelial cells can be studied using the patch-clamp technique, a tool for measuring the cellular events and the membrane properties of single cells. Here, we describe the methods of cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides.

We present a protocol that combines cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of the primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides. This protocol allows for investigation of the functional properties of primary epididymal epithelial cells to further elucidate the physiological role of the epididymis.

Ganzzellige Patch-Clamp Aufnahmen von isolierten primären Epithelzellen aus dem Epididymis

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental neurobiology. Rather than use an animal model or genetically modified induced pluripotent cells, human neural stem cells provide an effective in vitro system to examine the effects of treatments, screen drugs, or examine individual differences. Here, we provide the detailed protocols for methods used to expand human fetal brain neural stem cells in culture with serum-free media, to differentiate them into various neuronal subtypes and astrocytes via different priming procedures, and to freeze and recover these cells. Furthermore, we describe a procedure of using human fetal brain neural stem cells to study Zika virus infection.

This article details the methods that are used to expand human fetal brain neural stem cells in culture, as well as how to differentiate them into various neuronal subtypes and astrocytes, with an emphasis on the use of neural stem cells to study Zika virus infection.

Zika-Virus-Infektion der kultivierten menschlichen fetalen Gehirns neurale Stammzellen für Immunocytochemical Analyse

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular mechanisms of CHDs is&#160;crucial for inventing new preventive and therapeutic strategies. Mutant mouse models are powerful tools to discover new&#160;mechanisms&#160;and environmental stress modifiers that drive cardiac development and their potential&#160;alteration in CHDs. However, efforts to establish the causality of these putative contributors have been limited to histological&#160;and molecular studies&#160;in non-survival animal experiments, in which&#160;monitoring the key physiological and hemodynamic parameters is&#160;often absent. Live imaging technology has become an essential tool to establish the&#160;etiology of CHDs. In particular,&#160;ultrasound imaging can be used prenatally without surgically exposing the fetuses,&#160;allowing maintaining&#160;their baseline physiology while monitoring the impact of environmental stress&#160;on the hemodynamic and structural aspects of cardiac chamber development. Herein, we use the High-Frequency Ultrasound (30/45)&#160;system to examine the cardiovascular system in fetal mice at E18.5 in utero at the baseline and in response to prenatal hypoxia exposure. We demonstrate the feasibility of the system to measure cardiac chamber size, morphology, ventricular function, fetal heart rate, and umbilical artery flow indices, and their alterations in fetal mice exposed to systemic chronic hypoxia in utero in real time.

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

High-frequency ultrasound imaging of the fetal mouse has improved imaging resolution and can provide precise non-invasive characterization of cardiac development and structural defects. The protocol outlined herein is designed to perform real-time fetal mice echocardiography in vivo.

Fetale kardiovaskuläre Bildgebung mit einem Hochfrequenz-Ultraschall (30 / 45MHZ) Maus

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances early in the gestation. The rationale behind IUT for therapeutic purposes is based on the small size of the fetus, the fetal immunologic immaturity, the accessibility and proliferative nature of the fetal stem or progenitor cells, and the potential to treat a disease or the onset of symptoms prior to birth. Taking advantage of these normal developmental properties of the fetus, the delivery of hematopoietic stem cells (HSC) via an IUT has the potential to treat congenital hematologic disorders such as sickle cell disease, without the required myeloablative or immunosuppressive conditioning required for postnatal HSC transplants. Similarly, the accessibility of progenitor cells in multiple organs during development potentially allows for a more efficient targeting of stem/progenitor cells following an IUT of viral vectors for gene therapy or genome editing. Additionally, IUT can be used to study normal developmental processes including, but not limited to, the development of immunologic tolerance. The murine model provides a valuable and affordable means to understanding the potential and limitations of IUT prior to pre-clinical large animal studies and an eventual clinical application. Here, we describe a protocol for performing an IUT in the murine fetus through intravenous and intra-amniotic routes. This protocol has been used successfully to elucidate the necessary conditions and mechanisms behind in utero hematopoietic stem cell transplantation, tolerance induction, and in utero gene therapy.

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

We describe a protocol for performing an in utero transplantation (IUT) through intravenous and intra-amniotic routes of injection in the murine model. This protocol can be used to introduce cells, viral vectors, and other substances into the unique immune-tolerant fetal environment.

Intravenöse und Intra-Fruchtwasser In der Gebärmutter Transplantation in den Mausmodell

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

Ultrasound imaging is a widespread method used to detect organ anomalies and tumors in human and animal tissues. The method is non-invasive, harmless, and painless, and the application is easy, fast, and can be done anywhere, even with mobile devices. During pregnancy, ultrasound imaging is standardly used to closely monitor fetal development. The technique is important to assess intrauterine growth restriction (IUGR), a pregnancy complication with short- and long-term health consequences for both the mother and fetus. Understanding the process of IUGR is indispensable for developing effective therapeutic strategies. 
The ultrasound system used in this manuscript is an ultrasound device produced for the analysis of small animals and can be used in various research fields, including pregnancy research. Here we describe the usage of the system for in vivo analysis of fetuses from natural killer (NK) cell/mast cell (MC)-deficient mothers that give birth to growth-restricted pups. The protocol includes preparation of the system, handling of the mice before and during measurements, and the usage of the B-mode, color doppler mode, and pulse-wave doppler mode. Fetal size, placental size, and blood supply to the fetus were analyzed. We found reduced implantation sizes and smaller placentas in NK/MC-deficient mice from mid-gestation onwards. In addition, MC/NK-deficiency was associated with absent and reversed end diastolic flow in the fetal Arteria umbilicalis(UmA) and an elevated resistance index. The methods described in the protocol can easily be used for related and non-related research topics.

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

Here we describe the technique of high frequency ultrasound for in vivo analysis of fetuses in mice. This method allows the follow-up of fetuses and the analysis of placental parameters as well as maternal and fetal blood flow throughout pregnancy.

Hochfrequenz-Ultraschall für die Analyse der fetalen und plazentaren Entwicklung In Vivo

Ultrasound imaging is a widespread method used to detect organ anomalies and tumors in human and animal tissues. The method is non-invasive, harmless, and ...

Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy human bones makes particularly valuable the use of mammalian models, such as mouse and rat, to look into different aspects of bone growth and homeostasis. Additionally, the development of sophisticated genetic tools in mice allows more complex studies of long bone growth and asks for an expansion of techniques used to study bone growth. Here, we present a detailed protocol for ex vivo murine bone culture, which allows the study of bone and cartilage in a tightly controlled manner while recapitulating most of the in vivo process. The method described allows the culture of a range of bones, including tibia, femur, and metatarsal bones, but we have focused mainly on tibial culture here. Moreover, it can be used in combination with other techniques, such as time-lapse live imaging or drug treatment.

Here, we present a method for ex vivo culture of long murine bones at both fetal and newborn stages, suitable for analyzing bone and cartilage development and homeostasis in controlled conditions while recapitulating the in vivo process.

Die Kultivierung und Messung von Fetalen und Neugeborenen Murine Long Bones

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy ...

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to digest solid food. This process is termed suckling-to-weaning transition and results in the replacement of neonatal epithelium with adult epithelium which goes hand in hand with metabolic and morphological adjustments. These complex developmental changes are the result of a genetic program that is intrinsic to the intestinal epithelial cells but can, to some extent, be modulated by extrinsic factors. Prolonged culture of mouse primary intestinal epithelial cells from late fetal period, recapitulates suckling-to-weaning transition in vitro. Here, we describe a detailed protocol for mouse fetal intestinal organoid culture best suited to model this process in vitro. We describe several useful assays designed to monitor the change of intestinal functions associated with suckling-to-weaning transition over time. Additionally, we include an example of an extrinsic factor that is capable to affect suckling-to-weaning transition in vivo, as a representation of modulating the timing of suckling-to-weaning transition in vitro. This in vitro approach can be used to study molecular mechanisms of the suckling-to-weaning transition as well as modulators of this process. Importantly, with respect to animal ethics in research, replacing in vivo models by this in vitro model contributes to refinement of animal experiments and possibly to a reduction in the use of animals to study gut maturation processes.

This protocol describes how to mimic suckling-to-weaning transition in vitro using mouse late fetal intestinal organoids cultured for 30 days.

Rekapitulation saugen-zu-Weaning Transition In Vitro mit fetalen Intestinal Organoiden

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...

Transuterine Fetal Tracheal Occlusion Model in Mice

Fetal tracheal occlusion (TO), an established treatment modality, promotes fetal lung growth and survival in severe congenital diaphragmatic hernia (CDH). Following TO, retention of the secreted epithelial fluid increases luminal pressure and induces lung growth. Various animal models have been defined to understand the pathophysiology of CDH and TO. All have their own advantages and disadvantages such as the difficulty of the technique, the size of the animal, cost, high mortality rates, and the availability of genetic tools. Herein, a novel transuterine model of murine fetal TO is described. Pregnant mice were anesthetized, and the uterus exposed via a midline laparotomy. The trachea of selected fetuses were ligated with a single transuterine suture placed behind the trachea, one carotid artery, and one jugular vein. The dam was closed and allowed to recover. Fetuses were collected just before parturition. Lung to body weight ratio in TO fetuses was higher than that in control fetuses. This model provides researchers with a new tool to study the impact of both TO and increased luminal pressure on lung development.

Various animal models of congenital diaphragmatic hernia and fetal tracheal occlusion present advantages and disadvantages regarding ethical issues, cost, surgical difficulty, size, survival rates, and availability of genetic tools. This model provides a new tool to study the impact of both tracheal occlusion and increased luminal pressure on lung development.

Transuterine Fetal Tracheal Okklusion Modell bei Mäusen

Fetal tracheal occlusion (TO), an established treatment modality, promotes fetal lung growth and survival in severe congenital diaphragmatic hernia (CDH). ...