This work was supported by the NINDS (grant #1R01NS079702 to A.C.L.) and the SURP Program at Thomas Jefferson University (M.M.).

Experimentellen Verfahren wurden von der Thomas Jefferson University Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt und in Übereinstimmung mit der Europäischen Gemeinschaften Richtlinie des Rates (2010/63 / EU, 86/609 / EWG und 87 bis 848 / EWG), der NIH Leitfaden für die durchgeführt Pflege und Verwendung von Labortieren und der Society for Neuroscience der Richtlinien über die Verwendung von Tieren in der neurowissenschaftlichen Forschung. 1. Verbindung Muskelaktionspotentiale (CMAPs) <ol><li> Vorbereiten des Tieres: <ol><li> Betäuben die Ratte mit einem Inhalations (Isofluran) bei 1-2% auf Wirkung oder durch Injektion (Ketamin, Xylazin, Acepromazin) geliefert. Dosierung von injizierbaren Anästhesie ist wie folgt: 95,0 mg / kg Ketamin, 10,0 mg / kg Xylazin, 0,075 mg / kg Acepromazin. HINWEIS: Wir verwenden sowohl erfolgreich Inhalations und Injektionsanästhesie nähert sich bei der Durchführung dieses CMAP Aufzeichnungsprotokoll, ohne Präferenz. </li><li> Das Tier muss bei der entsprechenden a beibehalten werdennesthetic Tiefe vor der Operation begonnen wird, durch den Abschluss der Operation und bis zum postoperativen Buprenorphin wirksam geworden. Überprüfen Sie die ordnungsgemäße Betäubung durch kurze toe Prise, um festzustellen, dass ein Rückzug Reaktion nicht ausgelöst. Darüber hinaus prüfen die Kornealreflex mit einem Wattestäbchen. Der gesamten chirurgischen Prozedur zu bestimmen, dass die Herzfrequenz und Atemfrequenz nicht erhöht, was darauf hindeutet, daß die Narkosetiefe hat sich zu leicht. </li><li> Tragen Sie einen Tierarzt Salbe auf die Augen des Tieres bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern. </li><li> Der Operateur sollte sie mit einem Desinfektionsmittel (Chlorhexidin-Peeling) vor Beginn der Operation waschen / Händen. Der Operateur sollte sterile Handschuhe, Gesichtsmaske, und kleid oder reinigen Laborkittel tragen. Alle Instrumente sollten gewaschen und vor der Operation autoklaviert werden. Fügen Sie einen Sterilisationsindikatorstreifen im Inneren des Instruments Kit vor dem Autoklavieren auf der Ebene der Instrumente zu überprüfen, dass die Sterilisation abgeschlossen ist. Der Operateur sollteüberprüfen, ob die gesamte Zeile auf dem Streifen ist schwarz vor Beginn der Operation. Kleben Sie die Außenseite der Box mit Angabe Autoklaven Band auch. Wenn der Operation ist es, auf mehrere Tiere am selben Tag durchgeführt werden, reinigen Sie die Geräte zwischen Operationen und Sterilisieren in einer Glasperle Sterilisator. Falls erforderlich, sterilisiert beide Enden des Instruments in der Glasperle Sterilisator indem das Handstück des Instruments im Sterilisator für die entsprechende Zeit, das Entfernen des Instrumentes mit einer sterilen Hämostatikum, Abkühlen in einem sterilen Bereich und dann Platzieren des funktionalen Ende das Instrument in die Glasperle-Sterilisator für die entsprechende Zeit. </li><li> Sobald Tier betäubt, kann am OP-Board mit Rückenfläche nach unten und Bauch nach oben, so dass die Band verwendet werden, um Tiervorderbeine, um chirurgische Platine befestigt werden. </li><li> Rasur Ventralfläche kaudal beginnend an der Basis des Schädels und sicherzustellen, dass der Bereich um den Bauch zu beiden Seiten der Mittellinie ist shaved je nachdem, welche Hemidiaphragma aufgezeichnet wird. Gelten Povidonjod auf die rasierte Hautoberfläche. </li></ol></li><li> Vorbereitung für CMAP Aufnahmen: <ol><li> Nach Tier Vorbereitung, Ort Masseelektrode subkutan in Schwanz (Abbildung 1). </li><li> Legen Sie die Referenzelektrode subkutan in die kontralaterale untere Bauchregion. </li><li> Zeigen leitendes Gel auf selbstklebende Oberfläche Band oder Plattenaufzeichnungselektrode (Dimensionen der Oberfläche Streifenelektrode: 0,5 x 3 cm), und legen Sie dann Oberflächenelektrode quer entlang der einseitigen Rippenbogen. </li><li> Zeigen Stimulationselektroden transkutan 0,5 cm Abstand seitlich zur Luftröhre und über dem Schlüsselbein. Legen Sie die Elektroden etwa 1,0 cm tief durch die Haut. Sichern Sie sich die Elektroden mit der Hand, so dass ihre Lage nicht mit anschließenden Stimulationen zu bewegen. HINWEIS: Winkel stimulierenden Elektroden 90 ° relativ zu der Haut an der Stelle der insertion. </li></ol></li><li> Verbindung Muskelaktionspotenzial (CMAP) Aufnahmen: <ol><li> Erhalten Sie elektrophysiologischen Ableitungen mit einem Stimulator / Verstärker gefolgt von computergestützten Datenanalyse. </li><li> Die Stimulationsparameter der einzelnen Pull-Stimulation sollte 0,5 ms, 1,0 Hz supra Impulse sein. Die Amplitude der Anregung sollte zwischen 6,0 und 8,0 V (2A) ist. HINWEIS: In einem Experiment mit einem Stimulusintensität mit der gleichen Amplitude für Tiere. Das Ziel besteht darin, die Antwortamplitude unter Verwendung des minimalen Amplitude der Stimulation zu maximieren. Es ist wichtig zu beachten, dass die erste Reaktion, die zum Zeitpunkt der Stimulation auftritt, ist ein Stimulationsartefakt. Außerdem sollte darauf geachtet werden, eine CMAP Reaktion, die von einem stabilen / Flachbasislinie nach der Stimulation Artefakt, das dann durch die schnelle Reaktion CMAP gefolgt vorausgeht erhalten. Um eine solche Reaktion zu erreichen, kann es notwendig sein, um die Stimulation zu positionieren und / oderAufzeichnungselektroden. </li><li> Warten Sie 30 s zwischen Stimulationen, und wiederholen Sie 10 Stimulationen in einer Reihe, um die durchschnittliche Antwort (2B - C) zu erhalten. Messung der Amplitude von der Grundlinie zur Spitze (2A). Führen Phrenicus Stimulation während der Phase des Atemzyklus des Tieres, wenn die Zwerchfellnerv / Membran ist nicht aktiviert. Das Verfahren kann auf dem gleichen Tier für die kontralaterale Hemidiaphragma wiederholt werden. </li><li> Nach dem letzten CMAP Aufnahme-Session, durchströmen das Tier, wenn NMJ Färbung wird durchgeführt werden. Führen CMAP Aufnahmen immer wieder auf dem gleichen Tier etwa einmal pro Woche (oder Intervall der Wahl). </li><li> Im Anschluss an das Überleben CMAP Aufnahmen ermöglichen Tier auf einem umlaufenden Warmwasserheizung Pad während der Wiederherstellung, bis wach und sternally Liegerad erholen, und kontinuierlich zu überwachen. Sie ein Tier, das der Operation an die Firma von anderen Tieren unterzogen wurde, bis vollständig erholt nicht zurück. &lt;/ Li&gt; <li> Sobald sternally Liegerad, überwachen die Tier jede 12 Stunden für die ersten 48 Stunden (einmal täglich danach). Wenn das Tier scheint dehydriert (schlaffe Haut, Lustlosigkeit) sein, zu verwalten Flüssigkeiten (Ringer-Laktat-Lösung; subkutan; 1-2 ml pro Injektion, mit den Standorten gedreht; 2 mal pro Tag) bis zum postoperativen Gewicht und Flüssigkeitsverlust stabilisiert. Bieten Tieren mit enthärtetem Essen in kleine Gerichte während der akuten postoperativen Phase bei Bedarf zu fördern essen, wenn sie den Draht bar Deckel Einzug nicht erreichen kann. </li><li> Verabreichen Buprenorphin in einer Dosis von 0,05 mg / kg bis zum Ende der Operation und dann bei 12 Stunden Intervallen für die ersten 24 Stunden (und abhängig von Anzeichen von Schmerz / Belastung danach) subkutan injiziert (site gedreht). Wenn Anzeichen von Schmerzen oder Leiden werden danach aufgefallen, behandeln Tiere mit Buprenorphin. Zeichen, die von Schmerz / Not gehören der Mangel an Aktivität, Lautäußerungen, mangelnder Essen oder Trinken (Dehydratation), übermäßiger Gewichtsverlust, Bewachung, excEssiv nagt oder Kratzen an der Stelle der Inzision. Bei der Bestimmung, Schmerzen und Leiden verwendet zusätzliche Kriterien umfassen Teilnahmslosigkeit auf äußere Reize, vorübergehende oder unprovozierten Stimmgebung, erschwerte oder abnormale Atmung, persistent rotbraune Nasen occular Entladung, markiert Piloerektion. Außerdem überwachen Beweis mangelnder Hygiene, die kranke Tiere vorschlagen würde. Wenn Tier noch beobachtet, um in Not nach 72 h der Behandlung (nach den Schmerz / Stresskriterien skizzieren oben und nach Erhalt der oben beschriebene Analgetikum-Protokoll) das Tier einschläfern. </li></ol></li></ol> 2. Membranneuromuskuläre Junction (NMJ) Analyse <ol><li> Tier Dissektion: <ol><li> Verwaltung der Tier eine Überdosis injizierbaren Narkose (: Ketamin auf 285,0 mg / kg, Xylazin bei 30,0 mg / kg, Acepromazin bei 0,225 mg / kg; intraperitoneal 3 mal Dosis oben verwendet). Nach Überdosierung sollten alle Tiere eine zweite Methode der Euthanasie (Thorakotomie) haben to sicherzustellen Tod. Der Tod sollte durch Beobachtung der Herz- und Atemstillstand und mit der Feststellung festgelegt und erweiterte Pupillen des Tieres bestätigt werden. </li><li> Führen Sie eine Laparotomie mit Skalpell oder Dissektion Schere Verlängerung der Exzision von der zyphoid Prozess kaudal entlang der Mittellinie. Sorgfältig trennen Haut und Bindegewebe von darunter liegende Muskulatur mit Skalpell und Pinzette. </li><li> , Und ziehen Sie die zyphoid Prozess verwenden Dissektion Schere gesamte Membran zu entfernen, so dass die Membran bleibt umgebenden Knochen befestigt. Dies ist wichtig, da sie eine Beschädigung der Membrane Muskels zu vermeiden, wird für die erfolgreiche Präparation der gesamten Membran zu ermöglichen und beim Reinigen Muskels zur anschließenden Färbung unterstützen. HINWEIS: An diesem Punkt kann ggf. Tier perfundiert werden. </li></ol></li><li> Reinigung und Färbung der Membran: <ol><li> Festzunageln die gesamte Membran präpariert, überlegene Seite nach oben, um Silikonkautschuk in einem Glas 100 mm Petrischale in4% Paraformaldehyd (in 1% Phosphat gepufferter Kochsalzlösung - PBS) für 20 min unter Verwendung eines Stereomikroskops. Dehnen Sie den Membran es straff zu machen, und unter Verwendung von Insekten Stifte, festzunageln das umliegende Gewebe, dass Blockieren verhindert die Membran Muskel selbst (Abbildung 3). </li><li> Sorgfältig reinigen Bindegewebe nur von der oberen Fläche Muskel mit # 5 Zangen und kleine Schere. HINWEIS: Führen Sie alle nachfolgenden Schritte dieses Färbeprotokoll langsam Schütteln bei Raumtemperatur vor Licht abgedeckt sofern nicht anders angegeben. Stellen Sie sicher, dass die Membran Muskel immer vollständig in Flüssigkeit eingetaucht, um ein Austrocknen zu verhindern out. </li><li> Vor dem Färben, bereiten alle notwendigen Reagenzien: 1x PBS, 2% Rinderserumalbumin (BSA) / PBS, 0,1 M Glycin in 2% BSA / PBS, 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1x PBS und 0,2% TBP hergestellt (0,2 % Triton X100 in 2% BSA / PBS). Achten Sie darauf, bei -20 vorzukühlen Methanol ° C. </li><li> Wash 3x für 10 min in 1x PBS. </li><li> Inkubieren in 0,1 M Glycin (in 2 gemacht% BSA / PBS) für 30 min. </li><li> Inkubieren RBTX (Rhodamin-konjugiertem α-Bungarotoxin) -Lösung für 15 min. Lösung für RBTX ist wie folgt: Rhodamin-konjugiertem alpha Bungarotoxin 1: 400-Verdünnung in 1 × PBS. HINWEIS: In diesem Protokoll Rhodamin verwendet wird, aber jede Fluorophor der Wahl kann für die Färbung eingesetzt werden. </li><li> Wash 3x für 10 min in 1x PBS. </li><li> In -20 ° C Gefrierschrank, Inkubation mit MeOH 5 min. HINWEIS: MeOH bevor Muskel in der Tiefkühltruhe nicht hinzuzufügen, und umgehend entfernen Lösung nach der Inkubationszeit. </li><li> Wash 3x für 10 min in 1x PBS. </li><li> Block in 0,2% TBP 1 Stunde (0,2% Triton gemacht in 2% BSA / PBS). </li><li> Inkubieren mit primärer Antikörperlösung (bei 0,2% TBP) bei 4 ° C über Nacht unter Schütteln. Verdünnungen von Antikörpern wie folgt: SV2 (1:10) und SMI-312 (1: 1000). </li><li> Für 10 min mit 0,2% TBP waschen 3x. </li><li> Inkubieren mit sekundärem Antikörper unter Verwendung von 1: 100 Verdünnung FGM1 (FITC-konjugiertem Ziege-anti-Maus-IgG1; in 0,2% TBP) machte beim Schaukeln für 1 Stunde. HINWEIS: Vor Licht für den Rest des Protokolls für die Färbung. </li><li> Wash 3x für 10 min mit 1x PBS. </li><li> Re-clean umgebende Bindegewebe am überlegen (siehe oben) Oberfläche der Muskeln vor der Montage und Eindecken. HINWEIS: Es wird empfohlen, zu reinigen und dann montieren Probe unmittelbar nach der Färbung. Wenn es jedoch notwendig, Probe kann in 1x PBS bedeckt werden, in Parafilm eingewickelt, um eine Verdunstung zu verhindern und bei 4 ° C für bis zu 1 Woche gelagert, mit wechselnden PBS täglich. </li><li> Bei Montage auf Glasobjektträger, Deckglas mit nicht hardset Vectashield. Siegel Kanten der Deckglas mit klarem Nagellack, um ein Austrocknen zu verhindern out. Shop Folien flach in Karton Dia Ordner liegen in -20 ° C für die langfristige. </li></ol></li><li> Analyse und konfokale Abbildung: <ol><li> Quantitativen Analyse der Morphologie des gefärbten und montiert Hemi-Membran unter 20X und 40-facher Vergrößerung unter Verwendung eines aufrechten EpifluoreszenzMikroskop. Hinweis: Da die Membran angefärbt und in einer ganzen-mount Weise analysiert, ist ziemlich dick der Muskel. Folglich ist der größte Teil der Fluoreszenzfärbung völlig unscharf, wenn ein statisches Bild mit nicht-konfokalen Fluoreszenzmikroskopie. Aus diesem Grund ist es am besten, um die NMJ Analyse in Echtzeit auf dem Mikroskop durchzuführen, da dies ermöglicht es Ihnen, sich ständig konzentrieren &quot;up&quot; und &quot;down&quot; durch den Muskel, um die Morphologie von jedem der einzelnen NMJs richtig zu identifizieren. Mit diesem Ansatz kann man leicht folgen die Flugbahn der einzelnen Motor Axone, wie sie durch das Gewebe in räumlicher Beziehung zu den postsynaptischen Rezeptor-Cluster zu verschieben. </li><li> Durch Messung der ventral-zu-Rücken-Länge des Muskels, teilen den Muskel in 3 separate Abschnitte für die Analyse basierend auf topographische Innervationsmuster von bestimmten Rückenmarks Ebenen (Figur 4H). </li><li> Beginnend an der Bauchseite des Muskels und moving dorsal, analysieren alle en face NMJs auf Oberfläche Muskelfasern entfernt. Nicht analysieren Muskelfasern tiefer als die ersten 3-4 Fasern von der Oberfläche als Interpretation schwierig sein kann, an der schlechteren Antikörper Penetration (RBTX dringt viel tiefer in den Muskel durch die geringe Größe des Toxins im Vergleich zu den größeren Antikörper zur Markierung Neuronen). </li><li> Kennzeichnen Sie jeden NMJ als intakt, wenn die Pre-terminalen Axon des Neurons ist dick im Durchmesser und alle Regionen des Nervenende überlappen vollständig mit der zugrundeliegenden Muskelacetylcholinrezeptoren (AChRs). </li><li> Kennzeichnen Sie jeden NMJ als teilweise denervierten falls Bereich der darunter liegende Muskulatur AChRs unbesetzt ist mit entsprechenden Nervenende. </li><li> Kennzeichnen Sie jeden NMJ so vollständig denervierten, wenn die Muskel AChRs haben keine entsprechende Nervenende (es ist auch wichtig, um andere NMJs mit markierten Neuronen in dem selben Gebiet des Fokus zu haben, so dass man sicher, dass der Mangel an Nervenende ist nicht nur darauf zurückzuführen sein poor Antikörper Penetration in dem Bereich des Muskel). </li><li> Identifizierung jedes NMJ wie mehrfachinnerviert, wenn es mehr als eine präterminale Axon innervating eine individuelle NMJ (dies zeigt, dass es an dieser Verbindung war ein gewisses Maß an Denervierung und wahrscheinlich Versuche reinnervation). </li><li> Kennzeichnen Sie jeden NMJ so dünn innerviert, wenn die NMJ hat die komplette Überdeckung zwischen Nervenendigung und die zugrunde liegenden AChRs aber hat eine dünne präterminale Axon (auch dies ist ein Hinweis auf ein gewisses Maß an Denervierung und Reinnervation Versuche). </li><li> Analyse durchzuführen für jede der identifizierten Regionen 3 für alle der oben genannten Kategorien NMJ für jedes Tier. Der Mittelwert der Daten von jedem Tier mit den Ergebnissen aus anderen Tieren aus demselben Versuchsgruppe. Etwa 200-300 Gänge in Ratten Hemidiaphragma Muskel und 150-200 in Maus Hemidiaphragma sollte mindestens 3 (vorzugsweise 5-6 oder mehr) Tiere pro Versuchsgruppe quantifiziert werden. </li><li> Erhalten Sie hochauflösende konfokale Bilder, Verwendungd für die Veröffentlichung, mit einem konfokalen Mikroskop. </li><li> Erhalten Sie Z-Stapel bei 0,3 &amp; mgr; m Schrittweite für 20-40 &amp; mgr; m Tiefe, und sammeln Sie zusätzliche optische Abschnitte oberhalb und unterhalb jeder Verbindung, um sicherzustellen, dass die gesamte synaptischen Profil ist inbegriffen. </li><li> Verwenden Erfassungssoftware zur z-Serie Bilder in maximaler Intensität Projektionen zu rekonstruieren. </li></ol></li></ol>

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	<li>Miller, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practice+parameter:+the+care+of+the+patient+with+amyotrophic+lateral+sclerosis+(an+evidence-based+review):+report+of+the+Quality+Standards+Subcommittee+of+the+American+Academy+of+Neurology:+ALS+Practice+Parameters+Task+Force.">Practice parameter: the care of the patient with amyotrophic lateral sclerosis (an evidence-based review): report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology: ALS Practice Parameters Task Force.</a> Neurology. 52, 1311-1323 (1999).</li><li>Sandhu, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+recovery+following+high+cervical+hemisection.">Respiratory recovery following high cervical hemisection.</a> Respir Physiol Neurobiol. 169, 94-101 (2009).</li><li>Kaplan, L. M., Hollander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+dysfunction+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Respiratory dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Clin Chest Med. 15, 675-681 (1994).</li><li>Holtz, A., Levi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Spinal Cord Injury. , (2010).</li><li>Bruijn, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS-linked+SOD1+mutant+G85R+mediates+damage+to+astrocytes+and+promotes+rapidly+progressive+disease+with+SOD1-containing+inclusions.">ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions.</a> Neuron. 18, 327-338 (1997).</li><li>Sharma, H., Alilain, W. J., Sahdu, A., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatments+to+restore+respiratory+function+after+spinal+cord+injury+and+their+implications+for+regeneration,+plasticity+and+adaptation.">Treatments to restore respiratory function after spinal cord injury and their implications for regeneration, plasticity and adaptation.</a> Experimental Neurology. 235, 18-25 (2012).</li><li>Gour&#233;vitch, B., Mellen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+preB&#246;tzinger+complex+as+a+hub+for+network+activity+along+the+ventral+respiratory+column+in+the+neonate+rat.">The preB&#246;tzinger complex as a hub for network activity along the ventral respiratory column in the neonate rat.</a> Neuroimage. 98, 460-474 (2014).</li><li>Strakowski, J. A., Pease, W. S., Johnson, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phrenic+nerve+stimulation+in+the+evaluation+of+ventilator-dependent+individuals+with+C4-+and+C5-level+spinal+cord+injury.">Phrenic nerve stimulation in the evaluation of ventilator-dependent individuals with C4- and C5-level spinal cord injury.</a> Am J Phys Med Rehabil. 86, 153-157 (2007).</li><li>Wright, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+muscarinic+acetylcholine+receptor+subtypes+contribute+to+stability+and+growth,+but+not+compensatory+plasticity,+of+neuromuscular+synapses.">Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses.</a> J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).</li><li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+astrocyte+glutamate+transporter+GLT1+exacerbates+phrenic+motor+neuron+degeneration,+diaphragm+compromise,+and+forelimb+motor+dysfunction+following+cervical+contusion+spinal+cord+injury.">Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury.</a> J Neurosci. 34, 7622-7638 (2014).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+phrenic+motor+neuron+loss+and+transient+respiratory+abnormalities+after+unilateral+cervical+spinal+cord+contusion.">Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion.</a> Journal of neurotrauma. 30, 1092-1099 (2013).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phrenic+motor+neuron+degeneration+compromises+phrenic+axonal+circuitry+and+diaphragm+activity+in+a+unilateral+cervical+contusion+model+of+spinal+cord+injury.">Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 235, 539-552 (2012).</li><li>Lepore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+hyperstimulation+alters+site+of+disease+onset+and+course+in+SOD1+rats.">Peripheral hyperstimulation alters site of disease onset and course in SOD1 rats.</a> Neurobiol Dis. 39, 252-264 (2010).</li><li>Alilain, W. J., Horn, K. P., Hu, H., Dick, T. E., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+of+respiratory+pathways+after+spinal+cord+injury.">Functional regeneration of respiratory pathways after spinal cord injury.</a> Nature. 475, 196-200 (2011).</li><li>Zhang, B. M. F., Cummings, K. J., Frappell, P. B., Wilson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+for+conscious+airway+resistance+and+ventilation+estimation+in+neonatal+rodents+using+plethysmography+and+a+mechanical+lung.">Novel method for conscious airway resistance and ventilation estimation in neonatal rodents using plethysmography and a mechanical lung.</a> Respir Physiol Neurobiol. 201, 75-83 (2014).</li><li>Ngo, S. T., Bellingham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurophysiological+recording+of+the+compound+muscle+action+potential+for+motor+unit+number+estimation+in+mice.">Neurophysiological recording of the compound muscle action potential for motor unit number estimation in mice.</a> Neuromethods. 78, 225-235 (2013).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+phrenic+motor+neurons+induces+long-term+diaphragm+deficits+following+mid-cervical+spinal+contusion+in+mice.">Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice.</a> Journal of neurotrauma. 29, 2748-2760 (2012).</li><li>Lepore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+glial-restricted+progenitor+transplantation+into+cervical+spinal+cord+of+the+SOD1G93A+mouse+model+of+ALS.">Human glial-restricted progenitor transplantation into cervical spinal cord of the SOD1G93A mouse model of ALS.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Lepore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+transplantation-based+astrocyte+replacement+is+neuroprotective+in+a+model+of+motor+neuron+disease.">Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease.</a> Nature neuroscience. 11, 1294-1301 (2008).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Als Atemfunktion wird sowohl traumatischen SCI und ALS beeinträchtigt, die Entwicklung von Therapien, die Atmung und speziell Membran Innervation Ziel sind klinisch relevante 5,6. Um die Atemfunktion umfassend zu studieren, sollte ein kombinierter Ansatz Methode verwendet werden. CMAPs messen den Grad der funktionellen Innervation des Zwerchfells durch externe Zwerchfellnervenstimulation, aber nicht endogenen bulbospinal Atemantrieb 8. Hinzu kommt, dass diese Aufnahmen nicht zur Untersuchung von m...

Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine schwächende Erkrankung der Motoneuronen mit dem Verlust der beiden oberen und unteren motorischen Neuronen und damit Muskellähmung. Nach der Diagnose, ist das Überleben des Patienten auf nur 2-5 Jahren durchschnittlich 1. Zwerchfell Motor Neuron (PhMN) Verlust ist ein wichtiger Bestandteil der Pathogenese der ALS. Patienten sterben schließlich durch den Verlust von PhMN Innervation der Membran, dem primären Muskelinspirations 2,3. Traumatische Rückenmarksverletzungen (SCI) ist auch ein ernstes Problem im Zusammenhang mit Atembeschwerden. Etwa 12.000 neue Fälle von SCI treten jedes Jahr 4 aufgrund traumatischer Schädigung des Rückenmarks. Trotz Krankheit Heterogenität in Bezug auf Standort, Art und Schwere, die Mehrheit der SCI Fälle betreffen Trauma des zervikalen Rückenmarks, die oft zu einer schwächenden und anhaltenden Atem Kompromiss. Neben der ALS und SCI, anderen zentralen Nervensystems (ZNS) Erkrankungen können w zugeordnet werdenith Zwerchfellatemstörungen 5,6. Die Zwerchfellnerv ist ein efferenten motorischen Nerven, die die ipsilateral Hemi-Diaphragma innerviert und stammt aus PhMN Zellkörper in den C3-C5 Ebenen des ipsilateralen Halsmark entfernt. PhMN Ausgang durch absteigend bulbospinal Eingang aus dem Hirnstamm in einem Gebiet wie dem rostralen ventralen respiratorischen Gruppe (rVRG) 7 bekannt gesteuert. Die rVRG-PhMN Membran Schaltung ist zentral für die Steuerung der inspiratorischen Atmung, sowie andere nicht-Ventilationsmembran Verhaltensweisen. Verschiedene traumatischen Verletzungen und neurodegenerativen Erkrankungen, die diese Schaltungen beeinflussen können, um eine tiefgreifende Rückgang der Lungenfunktion und Lebensqualität der Patienten führen. Nder Eingabe in PhMNs vom rVRG, PhMN Überleben, Phrenicus Integrität und korrekte Innervation am Diaphragma neuromuskulären Synapse (NMJ) sind alle für den normalen Membran-Funktion notwendig. Es ist daher wichtig, Techniken zu verwenden, dassquantitativ zu bewerten diese Schaltung in vivo in Tiermodellen von ALS, SCI und anderen ZNS-Erkrankungen. Mit diesem Protokoll ist das Ziel, experimentelle Instrumente zur Bewertung PhMN Innervation des Zwerchfells sowohl auf der elektrophysiologischen und morphologischen Ebenen zu beschreiben. Verbindung Muskelaktionspotentiale (CMAPs) werden durch die Stimulierung alle efferenten motorischen Neurons Axone eines bestimmten motorischen Nerven und dann die Analyse der hervorgerufenen Depolarisation Reaktion der Ziel Muskelfasern aufgezeichnet. Dieses Verfahren kann in vivo bei anästhesierten Ratten und Mäuse verwendet werden, um funktionelle Innervation des Hemidiaphragma durch PhMNs 8 quantifizieren. Aufgrund der Tatsache, dass CMAPs repräsentieren gleichzeitige Aufnahme aller (oder zumindest viele / die meisten) der Muskelfasern der gesamte Hemi-Membran ist es sinnvoll, auch die Phänotypen der einzelnen Motor Axonen und Muskelfasern an der Membran NMJ untersuchen, um Krankheit zu verfolgen - und therapierelevanten morphologischen Veränderungen, wie beispielsweise Teil und complete Denervierung, regenerative Sprießen und Reinnervation. Dies kann über ganze-mount Immunhistochemie (IHC) der Membran erreicht werden, gefolgt von detaillierten morphologischen Bewertung der einzelnen NMJs ganzen Muskel 9. Die Kombination CMAPs und NMJ Analyse bietet eine leistungsstarke Ansatz zur quantitativen Studium Zwerchfell Innervation in Nagetiermodellen von ZNS und PNS Krankheit.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="902">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:273px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">T353-500</td>
			<td style="width:167px;">Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4</td>
			<td style="width:273px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">2% Bovine serum albumin (2% BSA)</td>
			<td style="width:273px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A3059-100g</td>
			<td>Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer)</td>
			<td style="width:273px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">T9284-100mL</td>
			<td>Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">0.1M Glycine</td>
			<td style="width:273px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">G-7126</td>
			<td>Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">&#945;-bungarotoxin</td>
			<td style="width:273px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">T1175</td>
			<td>Concentration 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">SMI-312&#160;</td>
			<td style="width:273px;">Sternberger Monoclonals</td>
			<td style="width:131px;">SMI312</td>
			<td>Concentration 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">SV2</td>
			<td style="width:273px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:131px;">SV2-Supernatant</td>
			<td>Concentration 1:10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">FITC goat anti-mouse IgG1</td>
			<td style="width:273px;">Roche</td>
			<td style="width:131px;">3117731001</td>
			<td>Concentration 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Silicone rubber</td>
			<td style="width:273px;">Sylgard, Dow Corning</td>
			<td style="width:131px;">Part # 184</td>
			<td>Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Vectashield fluorescent mounting medium</td>
			<td style="width:273px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:131px;">H-1000</td>
			<td>This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Small Spring Scissors</td>
			<td style="width:273px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:131px;">15002-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Dissection forceps</td>
			<td style="width:273px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:131px;">11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Software for CMAP recordings</td>
			<td style="width:273px;">Scope 3.5.6; ADI</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Disk surface electrodes</td>
			<td style="width:273px;">Natus neurology</td>
			<td style="width:131px;">019-409000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Subdermal needle electrodes</td>
			<td style="width:273px;">Natus neurology</td>
			<td style="width:131px;">019-453100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Conductive gel</td>
			<td style="width:273px;">Aquasonic&#160;</td>
			<td style="width:131px;">122-73720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:332px;">Stimulator/recording system for CMAP recordings</td>
			<td style="width:273px;">ADI Powerlab 8SP stimulator&#160;</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Amplifier for CMAP recordings</td>
			<td style="width:273px;">BioAMP</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional and morphological assessment of diaphragm innervation by phrenic motor neurons

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.

Erwachsene Sprague-Dawley Ratten erhielten entweder nur Laminektomie (unverletzt Kontrolle) oder einseitige Hemi-Prellung SCI an der C4 Rückenmarksebene 10-12. 5 Wochen nach der Operation, Spitzen CMAP Amplitude von aufgezeichneten die Hemi-Membran ipsilateral zur Laminektomie / Verletzungsstelle war maßgeblich an SCI-Ratten (2C) reduziert im Vergleich zu nur Laminektomie-Kontrolle (2B). Alle NMJs in der Hemi-Membran waren in Kontrolle nicht erkrankten Wildtyp-Ratten <stron...

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Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.

Funktionellen und morphologischen Bewertung der Membran Innervation durch phrenicus Motoneuronen

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

functional-morphological-assessment-diaphragm-innervation-phrenic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.4K Aufrufe.  Sidney Kimmel Medical College at Thomas Jefferson University. Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease. 

Serie: Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor functions. Most investigations of sensorimotor mechanisms rely on either examination of neurons while an animal is static1,2 or record extracellular neuronal activity during a movement.3,4 While these studies have provided the fundamental background for sensorimotor function, they either do not evaluate functional information which occurs during a movement or are limited in their ability to fully characterize the anatomy, physiology and neurochemical phenotype of the neuron. A technique is shown here which allows extensive characterization of individual neurons during an in vivo movement. This technique can be used not only to study primary afferent neurons but also to characterize motoneurons and sensorimotor interneurons. Initially the response of a single neuron is recorded using electrophysiological methods during various movements of the mandible followed by determination of the receptive field for the neuron. A neuronal tracer is then intracellularly injected into the neuron and the brain is processed so that the neuron can be visualized with light, electron or confocal microscopy (Fig. 1). The detailed morphology of the characterized neuron is then reconstructed so that neuronal morphology can be correlated with the physiological response of the neuron (Figs. 2,3). In this communication important key details and tips for successful implementation of this technique are provided. Valuable additional information can be determined for the neuron under study by combining this method with other techniques. Retrograde neuronal labeling can be used to determine neurons with which the labeled neuron synapses; thus allowing detailed determination of neuronal circuitry. Immunocytochemistry can be combined with this method to examine neurotransmitters within the labeled neuron and to determine the chemical phenotypes of neurons with which the labeled neuron synapses. The labeled neuron can also be processed for electron microscopy to determine the ultrastructural features and microcircuitry of the labeled neuron. Overall this technique is a powerful method to thoroughly characterize neurons during in vivo movement thus allowing substantial insight into the role of the neuron in sensorimotor function.

A technique is described to quantify the in vivo physiological response of mammalian neurons during movement and correlate the physiology of the neuron with neuronal morphology, neurochemical phenotype and synaptic microcircuitry.

Physiologische, morphologische und neurochemische Charakterisierung von Neuronen Modulated durch Bewegung

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Forschung

Neurowissenschaften

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, direction5-7, ocular dominance8,9 and binocular disparity9. Orientation selectivity is the most widely studied feature and a continuous map with a quasi-periodic layout for preferred orientation is present across the entire primary visual cortex10,11. Integrating the synaptic, cellular and network contributions that lead to stimulus selective responses in these functional maps requires the hybridization of imaging techniques that span sub-micron to millimeter spatial scales. With conventional intrinsic signal optical imaging, the overall layout of functional maps across the entire surface of the visual cortex can be determined12. The development of in vivo two-photon microscopy using calcium sensitive dyes enables one to determine the synaptic input arriving at individual dendritic spines13 or record activity simultaneously from hundreds of individual neuronal cell bodies6,14. Consequently, combining intrinsic signal imaging with the sub-micron spatial resolution of two-photon microscopy offers the possibility of determining exactly which dendritic segments and cells contribute to the micro-domain of any functional map in the neocortex. Here we demonstrate a high-yield method for rapidly obtaining a cortical orientation map and targeting a specific micro-domain in this functional map for labeling neurons with fluorescent dyes in a non-rodent mammal. With the same microscope used for two-photon imaging, we first generate an orientation map using intrinsic signal optical imaging. Then we show how to target a micro-domain of interest using a micropipette loaded with dye to either label a population of neuronal cell bodies or label a single neuron such that dendrites, spines and axons are visible in vivo. Our refinements over previous methods facilitate an examination of neuronal structure-function relationships with sub-cellular resolution in the framework of neocortical functional architectures.

A method is described for labeling neurons with fluorescent dyes in predetermined functional micro-domains of the neocortex. First, intrinsic signal optical imaging is used to obtain a functional map. Then two-photon microscopy is used to label and image neurons within a micro-domain of the map.

Gezielte Labeling von Neuronen in einem bestimmten Functional Micro-Domäne des Neocortex durch Kombination Intrinsic Signal-und Zwei-Photonen-Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Extrazellulär identifizieren Motor Neurons für einen Muscle Motor Pool in<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic nerves innervating the respiratory diaphragm. In spinal cord slices, phrenic motor neurons cannot be identified from other motor neurons on morphological or biochemical criteria. We provide the description of procedures for visualizing phrenic motor neuron cell bodies in mice, following intrapleural injections of cholera toxin subunit beta (CTB) conjugated to a fluorophore. This fluorescent neuroanatomical tracer has the ability to be caught up at the diaphragm neuromuscular junction, be carried retrogradely along the phrenic axons and reach the phrenic cell bodies. Two methodological approaches of intrapleural CTB delivery are compared: transdiaphragmatic versus transthoracic injections. Both approaches are successful and result in similar number of CTB-labeled phrenic motor neurons. In conclusion, these techniques can be applied to visualize or quantify the phrenic motor neurons in various experimental studies such as those focused on the diaphragm-phrenic circuitry.

Here, we describe a protocol for identifying phrenic motor neurons in mice after intrapleural delivery of fluorophore conjugated cholera toxin subunit beta. Two techniques are compared to inject the pleural cavity: transdiaphragmatic versus transthoracic approaches.

Retrograde neuroanatomischen Tracing der Phrenicus Motoneuronen bei Mäusen

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have indicated that hair cell synapses may be the initial targets in sensorineural hearing loss (SNHL). Such studies have proposed the concept of cochlear &#34;synaptopathy&#34;, which refers to alterations in ribbon synapse number, structure, or function that result in abnormal synaptic transmission between IHCs and SGNs. While cochlear synaptopathy is irreversible, it does not affect the hearing threshold. In noise-induced experimental models, restricted damage to IHC synapses in select frequency regions is employed to identify the environmental factors that specifically cause synaptopathy, as well as the physiological consequences of disturbing this inner ear circuit. Here, we present a protocol for analyzing cochlear synaptic morphology and function at a specific frequency region in adult mice. In this protocol, cochlear localization of specific frequency regions is performed using place-frequency maps in conjunction with cochleogram data, following which the morphological characteristics of ribbon synapses are evaluated via synaptic immunostaining. The functional status of ribbon synapses is then determined based on the amplitudes of auditory brainstem response (ABR) wave I. The present report demonstrates that this approach can be used to deepen our understanding of the pathogenesis and mechanisms of synaptic dysfunction in the cochlea, which may aid in the development of novel therapeutic interventions.

This manuscript describes an experimental protocol for evaluating the morphological characteristics and functional status of ribbon synapses in normal mice. The present model is also suitable for noise-induced and age-related cochlear synaptopathy-restricted models. The correlative results of previous mouse studies are also discussed.

Morphologische und funktionelle Bewertung von Bandsynapsen an bestimmten Frequenzregionen der Maus cochlea

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

Umwandlung von vom Menschen induktiven Pluripotent-Stammzellen (iPSCs) in funktionale Wirbelsäulen-und Krankheitsanleitungsneuronen mit PiggyBac-Vektoren

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

3D Kinematische Analyse zur funktionellen Bewertung im Rattenmodell von Ischias-Nerven-Crush-Verletzungen

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our understanding of the molecular mechanisms underlying axon degeneration remains limited. Injury-induced axon degeneration serves as a simple model to study how severed axons execute their own disassembly (axon death). Over recent years, an evolutionarily conserved axon death signaling cascade has been identified from flies to mammals, which is required for the separated axon to degenerate after injury. Conversely, attenuated axon death signaling results in morphological and functional preservation of severed axons and their synapses. Here, we present three simple and recently developed protocols that allow for the observation of axonal morphology, or axonal and synaptic function of severed axons that have been cut-off from the neuronal cell body, in the fruit fly Drosophila. Morphology can be observed in the wing, where a partial injury results in axon death side-by-side of uninjured control axons within the same nerve bundle. Alternatively, axonal morphology can also be observed in the brain, where the whole nerve bundle undergoes axon death triggered by antennal ablation. Functional preservation of severed axons and their synapses can be assessed by a simple optogenetic approach coupled with a post-synaptic grooming behavior. We present examples using a highwire loss-of-function mutation and by over-expressing dnmnat, both capable of delaying axon death for weeks to months. Importantly, these protocols can be used beyond injury; they facilitate the characterization of neuronal maintenance factors, axonal transport, and axonal mitochondria.

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Here, we provide protocols to perform three simple injury-induced axon degeneration (axon death) assays in Drosophila melanogaster to evaluate the morphological and functional preservation of severed axons and their synapses.

Morphologische und funktionelle Bewertung von Axonen und ihren Synapsen während des Axon-Todes bei Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our ...

Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis

Sympathetic neurons from the embryonic rat superior cervical ganglia (SCG) have been used as an in vitro model system for peripheral neurons to study axonal growth, axonal trafficking, synaptogenesis, dendritic growth, dendritic plasticity and nerve-target interactions in co-culture systems. This protocol describes the isolation and dissociation of neurons from the superior cervical ganglia of E21 rat embryos, followed by the preparation and maintenance of pure neuronal cultures in serum-free medium. Since neurons do not adhere to uncoated plastic, neurons will be cultured on either 12 mm glass coverslips or 6-well plates coated with poly-D-lysine. Following treatment with an antimitotic agent (Ara-C, cytosine &#946;-D-arabinofuranoside), this protocol generates healthy neuronal cultures with less than 5% non-neuronal cells, which can be maintained for over a month in vitro. Although embryonic rat SCG neurons are multipolar with 5-8 dendrites in vivo; under serum-free conditions, these neurons extend only a single axon in culture and continue to be unipolar for the duration of the culture. However, these neurons can be induced to extend dendrites in the presence of basement membrane extract, bone morphogenetic proteins (BMPs), or 10% fetal calf serum. These homogenous neuronal cultures can be used for immunocytochemical staining and for biochemical studies. This paper also describes optimized protocol for immunocytochemical staining for microtubule associated protein-2 (MAP-2) in these neurons and for the preparation of neuronal extracts for mass spectrometry.

This paper describes the isolation and culturing of embryonic rat sympathetic neurons from the superior cervical ganglia. It also provides detailed protocols for immunocytochemical staining and for preparing neuronal extracts for mass spectrometric analysis.

Culturing Rat Sympathische Neuronen aus embryonalen überlegenen Cervical Ganglia für morphologische und proteomische Analyse

Sympathetic neurons from the embryonic rat superior cervical ganglia (SCG) have been used as an in vitro model system for peripheral neurons to study ...

Functional Isolation of Single Motor Units of Rat Medial Gastrocnemius Muscle

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in hindlimb muscles (such as the medial gastrocnemius, soleus, or plantaris muscle) in experimental rats. A crucial element of the method is the application of electrical stimuli delivered to a motor axon isolated from the ventral root. The stimuli may be delivered at constant or variable inter-pulse intervals. This method is suitable for experiments on animals at varying stages of maturity (young, adult or old). Moreover, this protocol can be used in experiments studying variability and plasticity of motor units evoked by a large spectrum of interventions. The results of these experiments may both augment basic knowledge in muscle physiology and be translated into practical applications. This procedure focuses on the surgical preparation for the recording and stimulation of MUs, with an emphasis on the necessary steps to achieve preparation stability and reproducibility of results.

This method allows the recording of the force of twitch and tetanic contractions and action potentials in three types of motor units in the rat medial gastrocnemius muscle. The functional isolation of a single motor unit is induced by electrical stimulation of the axon.

Funktionelle Isolierung von einzelnen Motoreinheiten von Ratte Medial Gastrocnemius Muskel

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in ...