In diesem Video zeigen wir die Kultivierung der überlegenen Zervixganglien embryonaler Ratten für die morphologische und proteomische Analyse. Bevor Sie mit der Sezierung beginnen, bereiten Sie die Kontroll- und Seziermedien vor. Kontrollmedium enthält F-12 und glukosearmes DMEM, ergänzt durch eine Insulin-Selen-Transferrin-Mischung, Glutamin, Nervenwachstumsfaktor und BSA.
Dissektionsmedium enthält L-15 ergänzt mit Pen-Strep und BSA. Ausführliche Protokolle zur Medienaufbereitung finden Sie im Manuskript. Vorbereitung von Platten zur Kultivierung von Neuronen.
Verdünnen Sie einen Ein-Milligramm-Pro-Milliliter-Bestand an Poly-D-Lysin auf 100 Mikrogramm pro Milliliter mit sterilem destilliertem Wasser. Für die proteomische oder genomische Analyse, ein bis zwei Tage vor der Zerlegung, beschichten Sechs-Well-Platten mit etwa zwei Milliliter steril100 Gramm pro Milliliter Poly-D-Lysin. Dies ist notwendig, um die Zellhaftung am Brunnen zu gewährleisten.
Die Teller mit Klebefolie umwickeln und die Platten über Nacht bei vier Grad Celsius lagern. Am Tag der Zerlegung, vor Beginn der Zerlegung, die Poly-D-Lysin-Lösung aus den Brunnen entfernen und die Brunnen fünfmal mit sterilem destilliertem Wasser abspülen, gefolgt von einmal mit glukosearmem DMEM. Während der enzymatischen Verdauung der Ganglien, etwa eine Stunde vor dem Plattieren der Zellen, saugen Sie das DMEM von den Platten und ersetzen Es durch 0,3 Milliliter Steuermedium.
Lagern Sie die Platten bei 35 Grad Celsius unter 5% CO2 in einer befeuchteten Kammer. Richten Sie in der Haube die folgenden Elemente für die Zerlegung ein. Vier 50 Milliliter sterile konische Röhren mit ca. 20 Milliliter Nziermedien in jedem Rohr.
Vier sterile 35-Millimeter-Gerichte mit 1,5 Milliliter Nziermedien. Ein steriles 50 Milliliter konisches Rohr mit 20 Milliliter Nziermedien für die Zentrifugation. Ein 15 Milliliter steriles konisches Rohr zum Zentrieren der Ganglien, ein steriles 10-Milliliter-Rohr zum Sammeln der dissoziierten Zellen.
Verwenden Sie einen Trockenperlensterilisator, um ein Paar feine Zangen für mindestens eine Minute zu sterilisieren. Alle Verfahren, die in Studien mit Tieren durchgeführt wurden, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee am Saint Mary es College of California genehmigt. Die Richtlinien für die Tierpflege und -nutzung am Saint Mary es College of California wurden auf der Grundlage von Richtlinien des Office of Laboratory Animal Welfare an den National Institutes for Health entwickelt.
Entfernung von E21-Embryonen von der trächtigen Ratte. Beachten Sie, dass die Entfernung des Gebärmutterhorns außerhalb der Haube durchgeführt werden kann, wenn die Umgebung gründlich sterilisiert ist. Euthanisieren Sie eine schwangere Ratte mit CO2-Inhalation.
Das Fell aus dem Bauchbereich scheren und die Haut in der Gegend mit 70% Alkohol abwischen, um es zu sterilisieren. Mit einem frischen Satz von sterilen Scheren und Zangen, durch die Haut und dann den Muskel schneiden, um die Gebärmutterhörner mit den Embryonen zu belichten. Entfernen Sie das Gebärmutterhorn mit den Embryonen, mit einem neuen Satz von Schere und Zange, wobei darauf geachtet wird, den Darm dabei nicht zu beschädigen.
Das Gebärmutterhorn mit den Embryonen in 150 Millimeter sterile Petrischale übertragen und in die Kapuze geben. Mit einem neuen Satz von Zangen und Scheren, entfernen Sie die Embryonen aus dem Gebärmutterhorn und trennen Sie die Embryonen von den Fruchtwassermembranen und der Plazenta. Um die Embryonen einzuschläfern, schneiden Sie das Rückenmark der Embryonen entlang der Mittellinie unter dem rechten Arm.
Dadurch wird die Blutung aus der Halsschlagader während der Entfernung des SCG reduziert. Übertragen Sie diese Embryonen in die vorbereiteten 50 Milliliter konischen Röhren, die Dissektionsmedien enthalten. Stellen Sie sicher, dass die Embryonen in den Medien untergetaucht sind.
Jede Röhre kann bis zu drei Embryonen aufnehmen. Isolierung des überlegenen Halsbandlions vom Embryo. Übertragen Sie einen Welpen aus dem Seziermedium auf eine sterile 150-Millimeter-Petrischale, halb gefüllt mit festem Substrat mit seiner dorsalen Oberfläche auf dem Substrat.
Mit drei sterilen 23-Meter-Nadeln, pin die Kneipe auf die Schale mit einer Nadel unter jedem Arm und eine dritte Nadel durch den Mund, um vorsichtig hyperextend den Hals. Schneiden Sie die Haut im Nackenbereich mit sterilen feinen Zangen durch, um die Speicheldrüsen darunter freizulegen. Entfernen Sie diese Drüsen mit feinen Zangen.
Suchen Sie die Sternocleidomastoid und omohyoid Muskeln in der Nähe des Schlüsselbeins und Der Luftröhre. Schneiden Sie zunächst die transversalen sternocleidomastoiden Muskeln. Und dann vorsichtig schneiden Sie den dünnen omohyoiden Muskel mit feinen Zangen.
Sobald diese Muskeln entfernt sind, wird die Bifurkation in der Halsschlagader am vorderen Ende auf beiden Seiten der Luftröhre sichtbar sein, wobei sich das SCG unter dieser Gabel in der Halsschlagader befindet. Heben Sie die Halsschlagader mit geschlossenen Zangen vorsichtig an, um das SCG zu visualisieren. Mit einer Zange auf beiden Seiten des SCG, ziehen Sie das Carotis heraus und übertragen Sie es auf die vorbereiteten sterilen 35-Millimeter-Gerichte.
Dieses Gewebe wird höchstwahrscheinlich das SCG mit der Halsschlagader, den Vagusnerv mit den Nodose-Ganglien sowie andere Segmente von Muskel oder Fett in der Gegend enthalten. Wiederholen Sie den Seziervorgang auf der anderen Seite. Entfernen Sie SCGs von allen Embryonen, bevor Sie mit den verbleibenden Sezierschritten fortfahren.
Verteilen Sie die isolierten Gewebe zwischen zwei der 35-Millimeter-Schalen, um die Verarbeitung der Gewebeproben zu erleichtern. Nachbearbeitung des SCG. Um das SCG vom sezierten Gewebe zu trennen, verwenden Sie zuerst feine Zangen, um fremdartiges Gewebe, wie Muskel oder Fett, zu entfernen, wobei darauf zu achten ist, dass der Bereich in der Nähe der Karotisbifurkation vermieden wird.
Sobald diese Gewebe entfernt wurden, sind zwei Ganglien sichtbar. Das Nodose Ganglion ist kleiner und kreisförmiger, während das SCG mandelförmig ist. Ziehen Sie vorsichtig auf den Vagusnerv, um den Vagusnerv und die Nodose Ganglien vom Karotis zu trennen und trennen Sie dann das SCG von der Halsschlagader.
Verwenden Sie feine Zangen, um die Kapsel zu entfernen, die SCG umgibt. Übertragen Sie den SCG auf ein neues 35-Millimeter-Kulturgericht. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit allen sezierten Gewebeproben.
Beschichten Sie eine sterilisierte, mit Baumwolle gesteckte Glaspipette mit Seziermedien, um zu verhindern, dass das Gewebe an den Pipettenwänden haften bleibt. Verwenden Sie die Pipette, um die Dissektionsmedien durch sterile zwei Milliliter Kollagenase Typ II zu ersetzen, Dispase Typ II in Kalzium und Magnesium-freien HBSS und inkubieren für 50 Minuten bei 37 Grad Celsius, um das Gewebe zu brechen. Beachten Sie, dass die Inkubationszeiten möglicherweise mit verschiedenen Chargen von Kollagennase/Dispase optimiert werden müssen und in der Regel zwischen 40 Minuten und einer Stunde liegen.
Nach der Inkubation die SCGs und Kollagennase/Dispase in ein steriles 15 Milliliter konisches Rohr übertragen. Verwenden Sie das Seziermedium, um die Platten zu spülen und die Lösung auf das Rohr zu übertragen. Fügen Sie genügend Seziermedien hinzu, um die Lautstärke auf ca. 10 Milliliter zu erhöhen.
Zentrifuge bei 200 x g, 1 000 bis 1, 200 U/min für fünf Minuten bei Raumtemperatur, um die Probe zu pellet. Aspirieren Sie den Überstand, achten Sie darauf, das Pellet nicht zu vertreiben. Das Pellet mit 10 Millilitern Seziermedien aussetzen, die Zentrifugation wiederholen und den Überstand entsorgen.
Ersetzen Sie dies durch ein bis zwei Milliliter Kulturmedium. Mit einer schmalbohrungen, gebogenen, sterilen Pasteurpipette, vorbeschichten mit Kulturmedium, die Klumpen mechanisch dissoziieren, indem sie fünf- bis sechsmal sanft trituieren. Lassen Sie die größeren Klumpen für etwa eine Minute absetzen und übertragen Sie die überstande Zellsuspension in ein neues 10-Milliliter-Rohr.
Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal mit zunehmender Triturationskraft jedes Mal, um eine nahezu vollständige Dissoziation der SCGs zu gewährleisten. Übertragen Sie den Überstand nach jeder Trituration auf das 10 Milliliter Rohr mit dem Überstand aus der ersten Trituration. Fügen Sie genügend Kulturmedien hinzu, um die Lautstärke auf acht bis zehn Milliliter zu erhöhen.
Mischen Sie vorsichtig eine Zellsuspension und quantifizieren Sie die Zelldichte mit einem Hämozytometer. Verteilen Sie die Zellsuspension in die Brunnen mit der entsprechenden Zelldichte für die Experimente. Mischen Sie die Zellsuspension während des Beschichtungsprozesses kontinuierlich, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen in die Brunnen zu gewährleisten.
Für die morphologische Analyse, Platte die Zellen um 8.000 Zellen pro Brunnen in einer 24-Well-Platte. Und für genomische und proteomische Protokolle, Platte die Zellen so hoch wie 30. 000 Zellen pro Brunnen. Übertragen Sie die Platten auf einen Glasaustrocknungsor mit sterilem Wasser am Boden, um eine befeuchtete Kammer zu schaffen.
Injizieren Sie genügend CO2, etwa 120 Milliliter, um vor der Versiegelung eine 5%CO2-Umgebung im Trockenator zu erhalten. Halten Sie die Platten bei 35,5 Grad Celsius. Dies wird im Protokoll als Tag Null bezeichnet.
Diese Platten können auch in einem regelmäßigen 5%CO2-Inkubator aufbewahrt werden. Das oben beschriebene Verfahren minimiert Temperatur- und pH-Änderungen und hilft auch, Kreuzkontaminationen zu verhindern. Pflege der kultivierten SCG-Neuronen und -Behandlungen.
Diese Bilder zeigen die dissoziierten überlegenen halsbandlosen Ganglienzellen am Tag null, Tag eins und Tag fünf. Das Tag-Null-Bild zeigt die Zellen beim Beschichten. Die am Tag Null plattierten Zellen enthalten eine Mischung aus neuronalen und nicht-neuronalen Zellen.
Am ersten Tag, 24 Stunden nach der Beschichtung, entfernen Sie sorgfältig die Hälfte der Kulturmedien und ersetzen Sie durch zwei Mikromolar Ara-C, Cytosin D-Arabinofuranosid, ein Anti-Mitotik-Mittel. Lassen Sie die Behandlung auf den Zellen für 48 Stunden. Normalerweise ist diese Behandlungsdauer ausreichend, um nicht-neuronale Zellen in der Kultur zu beseitigen.
Am dritten Tag die Hälfte des Mediums vorsichtig ansaugen und durch ein Steuermedium ersetzen. Am vierten Tag sind die Zellen bereit für experimentelle Behandlungen. Füttern Sie Kulturen jeden zweiten Tag mit dem entsprechenden Medium.
Sanft die Hälfte des Mediums im Brunnen durch frisches Medium ersetzen. Das Bild am fünften Tag zeigt ein ausgedehntes axonales Wachstum ohne dendritisches Wachstum. Um das dendritische Wachstum zu induzieren, können Neuronen auf Matrigel angebaut oder mit 10% Serum oder 50 Nanogramm pro Milliliter Knochenmorphogenetisches Protein-7 behandelt werden.
Abbildung 2 zeigt Veränderungen in der neuronalen Morphologie von E21-Ratten-SCG-Neuronen nach der Behandlung mit BMP-7. Repräsentative Phasenkontrast-Mikrographen bei 10 X Vergrößerung zeigen den kreisförmigen neuronalen Zellkörper mit Axonen in Kontrollneuronen in Panel A und Neuronen mit mehreren kurzen Dendrit-ähnlichen Prozessen, wenn sie mit BMP-7 behandelt werden, die von den Pfeilen in Panel B.Cultured SCG Neuronen nach geeigneten Behandlungen gezeigt werden, können für die morphologische Analyse mit immunozytochemischen Färbungen für die Genomanalyse und für biochemische Studien verwendet werden , z. B. für proteomische Analysen. Detaillierte Protokolle zur Immunfärbung und Probenvorbereitung für die proteomische Analyse finden Sie im Manuskript.
Abbildung 3 zeigt die Immunfärbung von MAP-2-Proteinen in kultivierten embryonalen Ratten sympathischen Neuronen. Panels A bis D zeigen kultivierte SCG-Neuronen, die mit Kontrollmedien und Panels E bis H behandelt werden, zeigen Neuronen, die fünf Tage lang mit BMP-7 mit 50 Nanogramm pro Milliliter behandelt wurden. Repräsentative Mikrographien, die eine immunzytochemische Färbung der Neuronen mit Mikrotubuli-assoziiertem Protein-2 in C und G, einem Kernfleck in D und H mit Phasenkontrast-Mikrographen in B und F zeigen, und die drei Kanäle in A und D.Immunocytochemical Färbung aus Mikrotubule-assoziiertem Protein-2 sind im Zellkörper und proximale Axone von Kontrollneuronen in Panel C.Und Färbung von MAP-Protein-2-Protein in der Zelle , und Dendriten in BMP-7 behandelten Neuronen ist in Panel G.Here ist eine Probe lauf von überlegenen zervikalen Ganglien mit Kontrollmedien behandelt, die 1, 100 Proteine erkannt.
Die Genontologie mithilfe der Panther-Datenbank ergab, dass die meisten Proteine zytoplasmatisch waren. Es gab jedoch membrangebundene Proteine und Proteine an zellulären Knoten in der Probe. Diese Analyse ergab auch, dass Proteine, die an einer Vielzahl neuronaler Signalwege beteiligt sind, in der Probe nachgewiesen wurden.
Zusammenfassend, nach dem Anschauen dieses Videos, sollten Sie in der Lage sein, zu isolieren und Kultur Ratte embryonale überlegene Halsband Neuronen für morphologische und proteomische Analyse. Diese Arbeit wurde durch den Fakultätsentwicklungsfonds und das Sommerforschungsprogramm am Saint Mary es College of California finanziert.
