Wir sind dankbar, Robert Graffin und Pauline Duhant für ihre technische Unterstützung.

Das experimentelle Protokoll wurde in Übereinstimmung mit den Europäischen Gemeinschaften Ratsrichtlinien für Tier-Experiment (2010/63/EU, 86/609/EWG und 87-848/EWG) durchgeführt und wurde genehmigt durch das Tier Ethik Ausschuss der Universität Namur (Ethik Projekt n ° 17-284 ). Abbildung 1 zeigt die beiden jeweiligen Ansätze: Transdiaphragmatic oder transthorakalen Injektionen. Verwenden Sie männliche Mäuse C57bl/6J (n = 18), im Alter von 3 bis 4 Monate in der Studie.
1. Vorbereitung der CTB-Lösung
<ol><li>Für Transdiaphragmatic-Injektionen:<ol>
<li>Lösen Sie die CTB macht in sterilem Wasser auf die Konzentration von 0,2 % (w/V).</li>
		<li>Laden Sie 7,5 µL CTB-Lösung (0,2 % w/V) in eine sterile 10-µL-Microsyringe mit einer angehängten 33-Gauge-Nadel (stumpf oder kurze Fase) für jede Maus.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transthorakalen Injektionslösung:<ol>
<li>Lösen Sie die CTB macht in sterilem Wasser auf die Konzentration von 0,1 % (w/V).</li>
		<li>Laden Sie 20 µL CTB-Lösung (0,1 % w/V) in eine sterile 500 µl Insulin-Spritze mit einer abgeschrägten 27-Gauge-Nadel für jede Maus. Hinweis: Achten Sie darauf, destilliert und steriles Wasser verwenden und ordnungsgemäß auflösen der CTB-Pulver. Die Lösung kann bei 4 ° C aufbewahrt werden, für einen Monat (nicht einfrieren). Nach paar Tagen könnte einen Niederschlag bilden. Bringen Sie die Lösung auf Raumtemperatur und mischen Sie gut mit einer Pipette vor Gebrauch.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vorbereitung vor intrapleurale Injektionen
<ol><li>Chirurgische Instrumente vor der Operation, mit Autoklav oder Glasperlen Sterilisator zu sterilisieren. Bereiten Sie einen sauberen Werkbank Mantel Chirurgie und chirurgische Instrumente zu entsorgen. Hinweis: Jedes Material verwendet während des chirurgischen Eingriffs sollte steril sein. Instrumente, die sterilisiert werden können nicht, wie die Microsyringe mit einem Desinfektionsmittel (Chlorhexidin) abgewischt werden sollten oder sollte Einmalgebrauch. Der Chirurg sollte seine/ihre Hände mit einem Desinfektionsmittel (Chlorhexidin Peeling) vor dem Beginn der Operation waschen. Der Chirurg sollte sterile Handschuhe, eine Gesichtsmaske und ein sauberes Kleid tragen.</li>
	<li>Tier wiegen und verwalten eine angemessene Dosis der Anästhesie: intraperitoneale Injektion von Betäubungsmittel cocktail (z.B. Ketamin 100 mg/kg und Xylazin 5 mg/kg).</li>
	<li>Zeh kneifen und/oder für den Verlust von palpebrale Reflex um festzustellen, ob die Maus richtig betäubt ist zu überprüfen. Wenden Sie eine Tierarzt Salbe zum Schutz der Hornhaut an.</li>
	<li>Rasieren Sie sorgfältig die ventralen (für Transdiaphragmatic-Verfahren) oder die rechtsseitige thorakalen Haut (für transthorakalen Verfahren), mit elektrischen Haarschneidemaschinen. Rasieren Sie gut und breit genug, um zu verhindern, dass die Haare immer in das OP-Feld.</li>
	<li>Sicherstellen Sie aseptische Bedingungen durch topische Anwendung von 10 %-Jod-Lösung auf den rasierten Bereich. Scheuern der Operationsstelle mit Jod-Lösung, dabei darauf achten, aus der Mitte des Grundstücks in Richtung der Peripherie zu schrubben.</li>
	<li>Verwenden Sie homöotherm Pad während der Operation, um das Tier Körpertemperatur aufrechtzuerhalten.</li>
</ol>3. intrapleurale Injektionen mit Transdiaphragmatic Ansatz
<ol><li>Legen Sie den narkotisierten Maus in Rückenlage auf ein Heizkissen. Legen Sie einem gerollten Tupfer unter dem Hals des Tieres. Verwenden Sie bei einer erwachsenen Maus einem gerollten Tupfer von 0,5 Zoll dicke. Kleben Sie das Pad in den Vorstand der Operation, wenn jede Bewegung zu vermeiden.</li>
	<li>Mit einem Skalpellklinge, die ventrale Haut entlang der Mittellinie einschneiden: einen Einschnitt von Xiphoid Prozeß der Nabelschnur Region während der Dehnung der Haut seitlich mit der anderen Hand die Haut straff zu machen. Nicht zu viel Druck auf die Klinge zur Vermeidung von Schäden zugrunde liegenden Organe.</li>
	<li>Nehmen Sie mit einer kleinen Schere ab, sorgfältig die Haut von den Abdominal-Muskeln rund um den Schnitt. Dieses Verfahren hilft beim Nähen der Muskeln und der Haut, die am Ende der Operation auseinander.</li>
	<li>Führen Sie mit einer kleinen Schere Laparotomie. Öffnen Sie die Bauchhöhle durch ein Knopfloch Einschnitt auf der Ebene des Nabels durchführen. Die Abdominal-Muskeln entlang der weißen Linie einschneiden ("Linea Alba") bis zum Xiphoid Prozeß.</li>
	<li>Zurückziehen Sie, um den Bauch das Zwerchfell sichtbar gemacht, Bauchmuskeln mit kommerziellen oder hausgemachte Retraktoren. Hinweis: Diese Retraktoren können von der Midi-Größe Büroklammer geformt L-Haken19erfolgen.</li>
	<li>Strecken Sie beide Seiten der Laparotomie und Klebeband unten der Retraktoren Bench Mantel. Optimieren Sie die Ausleuchtung des Sichtfeldes, so dass die Bauch Oberfläche der Membran nicht mehr in den Halbschatten ist. Die mächtigste Beleuchtungseinrichtung für diesen Zweck ist eine LED-Lampe mit einem orientierbar Lichtstrahl.</li>
	<li>Weiche Pinzette in der Hand, heben Sie Xyphoid Anhang und ziehen Sie die seitlichen Lappen der Leber (Abbildung 2A). Mit einer kleinen Schere in der anderen Hand vorsichtig abgeschnitten Hodenbeutel Ligament, ohne Beschädigung der Gallenblase oder der Membran (Abbildung 2 b).</li>
	<li>Heben Sie weiche Pinzette in der Hand, die Xyphoid Anhang. Die Hamilton-Spritze in der anderen Hand zu erfassen. Ziel der drei Standorte der Injektion in die richtigen Hemidiaphragm bzw. der sternalen, decken die Medial und musculorum Regionen (Abb. 3A, Einfügung in Abb. 3 b).</li>
	<li>Da die Dicke der Membran rund 0,37 mm in Mäusen7ist, legen Sie die Nadel nicht mehr als 1 oder 2 mm über der Membran-Blatt zur Verhinderung der Lunge beim Atmen. 2.5 µL CTB-Lösung (0,2 % w/V) durch die richtige Membrane an jedem Standort (Abbildung 4 b) zu liefern. Stabilisierung der Membran ist nicht erforderlich.</li>
	<li>Wiederholen Sie diesen Vorgang für die drei ipsilateral Standorte der Einspritzung (Abbildung 1A) und contralaterally für eine bilaterale Kennzeichnung des PhMN Pools.</li>
	<li>Bauchmuskeln mit resorbierbaren Naht um die Laparotomie-Standort in der Nähe, 4-0 Naht. Mit 9,0 mm Wunde Clips geschlossenes verwenden unterbrochene Stiche von 3 mm. Grundnahrungsmittel Haut verteilt. Ziehen Sie die Klammern verhindern, dass Tier abziehen Heftklammern. Platz heftet ca. 5 mm auseinander. Nicht überdrehen der Wunde Clips, da dies zur Beeinträchtigung Heilung führen kann.</li>
	<li>Saubere Mikro Spritze mit destilliertem Wasser, Verstopfung zu verhindern. Langsam erarbeiten und vertreiben 2-3 Mal. Ziehen Sie keine Luft in die Spritze.</li>
</ol>4. intrapleurale Injektion mittels transthorakalen Ansatz
Hinweis: Diese Methode ist inspiriert von dem in Ratten4 beschriebenen Verfahren und wurde an die Maus.
<ol><li>Legen Sie den narkotisierten Maus im linken seitlichen Dekubitus auf ein Heizkissen (Abb. 4A) positionieren.</li>
	<li>Identifizieren Sie die sechsten und siebten Rippen unter der Ellenbogen-Region durch manuelle Abtasten (Abbildung 4 b).</li>
	<li>Während ein Assistent rechten Vordergrund - und -Hinterbeine (Abb. 5A) erstreckt, legen Sie die Spritze cranially orientiert und tangential unter dem sechsten oder siebten Rippe, 3 mm tief aus der Haut, mit der Fase nach unten (Abbildung 1 b und Abbildung 5 b).</li>
	<li>Heben Sie die Nadel vorsichtig zur Bestätigung durch Anheben der Rippen, dass es gut, in der Brusthöhle (Abbildung 5, Einsätze in Abbildung 1 b positioniert ist).</li>
	<li>Atembewegungen des Brustkorbs durch leichten Druck mit zwei Fingern auf die Brustwand zu stabilisieren.</li>
	<li>Halten Sie die Spritze in der anderen Hand, liefern Sie 20 µL der CTB-Lösung (0,1 % w/V) in einer einzigen Injektion.</li>
</ol>5. postoperative Pflege
<ol><li>Unmittelbar nach dem Eingriff lag der Maus im rechten seitlichen Dekubitus Position auf einem homöotherm Pad für Erholung. Dies sorgt für die Tracer auf der rechten Seite den pleural Raum zu verbreiten und für die Überwachung des Tieres Atmung ermöglicht.</li>
	<li>Verabreichen Sie 1 mL steriler Kochsalzlösung i.p subkutan. Geben Sie Follow-up-Injektionen, wenn das Tier dehydriert und/oder lustlos erscheint.</li>
	<li>Verwalten von Buprenorphin 0,1 mg/kg subkutan zweimal täglich während der ersten zwei Tage nach der Operation, um mögliche Schmerzen zu minimieren. Hinweis: Viele Institutionen empfehlen multimodalen Analgesie für invasive Verfahren, wie die hier abgebildete Laparotomie. Dazu zählen die Verwendung von einer nicht-steroidale Entzündungshemmer (NSAR) und/oder ein Lokalanästhetikum Agent bei der Schnitt-Website. Diese Medikamente sind in der Regel vor dem ersten Schnitt Aufzieh Schmerzen zu minimieren geliefert.</li>
	<li>Beobachten Sie Tiere täglich bis zur Sterbehilfe.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Webber, C. L., Wurster, R. D., Chung, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cat+phrenic+nucleus+architecture+as+revealed+by+horseradish+peroxidase+mapping.">Cat phrenic nucleus architecture as revealed by horseradish peroxidase mapping.</a> Exp Brain Res. 35 (3), 395-406 (1979).</li><li>Goshgarian, H. G., Rafols, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phrenic+nucleus+of+the+albino+rat:+a+correlative+HRP+and+Golgi+study.">The phrenic nucleus of the albino rat: a correlative HRP and Golgi study.</a> J Comp Neurol. 201 (3), 441-456 (1981).</li><li>Gordon, D. C., Richmond, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+in+the+phrenic+motoneuron+nucleus+demonstrated+by+retrograde+multiple-labelling+techniques.">Topography in the phrenic motoneuron nucleus demonstrated by retrograde multiple-labelling techniques.</a> J Comp Neurol. 292 (3), 424-434 (1990).</li><li>Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. 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A., Lee, K. Z., Reier, P. J., Fuller, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phrenic+motor+nucleus+in+the+adult+mouse.">The phrenic motor nucleus in the adult mouse.</a> Exp Neurol. 226 (1), 254-258 (2010).</li><li>Laskowski, M. B., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+mapping+of+motor+pools+onto+skeletal+muscles.">Topographic mapping of motor pools onto skeletal muscles.</a> J Neurosci. 7 (1), 252-260 (1987).</li><li>Feldman, J. L., Loewy, A. D., Speck, D. 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Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera+Toxin+B+Subunit+Shows+Transneuronal+Tracing+after+Injection+in+an+Injured+Sciatic+Nerve.">Cholera Toxin B Subunit Shows Transneuronal Tracing after Injection in an Injured Sciatic Nerve.</a> PLoS One. 10 (12), e0144030 (2015).</li><li>Torgersen, M. L., Skretting, G., van Deurs, B., Sandvig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+cholera+toxin+by+different+endocytic+mechanisms.">Internalization of cholera toxin by different endocytic mechanisms.</a> J Cell Sci. 114 (Pt 20), 3737-3747 (2001).</li><li>Chinnapen, D. J., Chinnapen, H., Saslowsky, D., Lencer, W. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraspinal+cell+transplantation+for+targeting+cervical+ventral+horn+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+traumatic+spinal+cord+injury.">Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury.</a> J Vis Exp. (55), (2011).</li><li>Llado, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+respiratory+motor+neurons+in+the+SOD1+G93A+transgenic+rat+model+of+ALS.">Degeneration of respiratory motor neurons in the SOD1 G93A transgenic rat model of ALS.</a> Neurobiol Dis. 21 (1), 110-118 (2006).</li><li>Lepore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+transplantation-based+astrocyte+replacement+is+neuroprotective+in+a+model+of+motor+neuron+disease.">Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease.</a> Nat Neurosci. 11 (11), 1294-1301 (2008).</li><li>Sieck, G. C., Fournier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diaphragm+motor+unit+recruitment+during+ventilatory+and+nonventilatory+behaviors.">Diaphragm motor unit recruitment during ventilatory and nonventilatory behaviors.</a> J Appl Physiol. 66 (6), 2539-2545 (1989).</li><li>Janicot, M., Clot, J. P., Desbuquois, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+cholera+toxin+with+isolated+hepatocytes.+Effects+of+low+pH,+chloroquine+and+monensin+on+toxin+internalization,+processing+and+action.">Interactions of cholera toxin with isolated hepatocytes. Effects of low pH, chloroquine and monensin on toxin internalization, processing and action.</a> Biochem J. 253 (3), 735-743 (1988).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die hierin beschriebene Protokoll kann angewendet werden, um jede Belastung erwachsener Mäuse oder experimentellen Paradigma, in dem die Integrität der Membran-PhMN Schaltung ausgewertet werden soll. Zum Beispiel sind die Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und Verletzungen des zervikalen Rückenmarks (cSCI) Bedingungen im Zusammenhang mit PhMN Verlust, Anterograde Degeneration der Phrenicus Axone und anschließende Atemwege Kompromiss. Tiermodelle der ALS oder cSCI imitieren histopathologische und funktionelle Atemwege D...

Das Ziel der Studie ist es, eine zuverlässige Methode um Phrenicus Motoneuronen (PhMN) auf Maus Rückenmark Abschnitte identifizieren zu präsentieren. Injektion eines fluoreszierenden neuroanatomischen Tracers in den pleural Raum wurde gewählt, als die Versandart der Phrenicus neuromuskulären Projektionen auf der Membran zu erreichen und mit retrograder Transport entlang der Phrenicus Axone Phrenicus Zellkörpern beschriften. Zwei Techniken der intrapleurale Lieferung werden beschrieben: Transdiaphragmatic versus transthorakalen.
Phrenicus Motoneuronen sind spinale Relais Zellen, deren Axone in Phrenicus Nerven zusammenlaufen, die letztlich das Zwerchfell innervieren. Dies sind die unteren Motoneuronen bulbärer respiratorischen Zentren den inspiratorischen Antrieb erhalten und auf die Membran Neuro-muskuläre Kreuzungen (NMJ) Weiterleitung. PhMN gliedert sich in zwei motor Spalten, eine für jede Hemicord, die entlang der Mitte der Halswirbelsäule. In den meisten Säugetierarten einschließlich des Menschen breitete sich die Phrenicus motor Spalten von Ebenen C3 bis C61,2,3. Wir und andere haben bestätigt, dass PhMN in C3-C5-Ebenen im Ratte und Maus Rückenmark4,5,6,7,8konzentriert. Die topographische Verteilung der Phrenicus Zellen ist nicht nach dem Zufallsprinzip; motorischen Neuronen innervieren die sternalen Teil der Membran sind Dichter im kranialen Teil der Phrenicus Fuhrpark (C3), verteilt, während motorischen Neuronen innervieren den musculorum Teil mehr kaudalen (C5)9sind. Darüber hinaus PhMN sind verschiedentlich in der ventralen Horn grauen Substanz gruppiert. Ebene C3 die Cluster der Phrenicus Zellen liegen seitlich, dann im ventrolateralen Richtung verschieben und ventromedially finden sich in den meisten caudale Ebenen10,11.
Ihre wichtige Rolle während der Inspiration gegeben, ist es von größter Wichtigkeit zu PhMN genau zu identifizieren, im gesunden Rückenmark sondern auch ihr Schicksal während der pathologischen Zuständen, z. B. degenerativen Erkrankungen oder traumatische Verletzungen des Rückenmarks. Da PhMN nicht unterscheiden sich morphologisch von anderen zervikalen Motoneuronen, hängt Identifizierung von PhMN die gezielte Bereitstellung von neuroanatomischen Tracern entweder auf der Ebene des primären respiratorischen Zentren8, oder an der Membran NMJ7 oder in der Phrenicus Nerv4. Die Tracer ist von Nervenfasern aufgegriffen und bis zu den Phrenicus Zellkörper an der Halswirbelsäule, wo es mit direkter oder indirekter Detection Systeme visualisiert werden kann. Retrograde und Anterograde Tracer sind im Handel erhältlich, mit einer breiten Palette von Konjugate. Bemerkenswert, jeder Tracer ist dotiert mit Nein, niedrigen oder hohen Fähigkeiten für die synaptische Trans-Ablaufverfolgung.
In der aktuellen Studie wählten wir die Beta-Untereinheit das Cholera-Toxin (CTB) funktionalisiert mit Alexa Fluor 555 (im folgenden als CTB-Fluorophor bezeichnet) als fluoreszierende Label ermöglicht eine direkte Visualisierung der PhMN auf gefrorenen Rückenmark Abschnitte. CTB ist in der Regel als monosynaptische Tracer beschrieben, obwohl experimentelle Daten weisen darauf hin eine Transneuronal Durchgang12zeigen. CTB hat die Fähigkeit, das Gangliosid GM1 in der Plasmamembran von der Nervenendigung binden. CTB ist über Clathrin-abhängige oder -unabhängige Mechanismen und Verkehre über das Trans-Golgi-Netzwerk in dem endoplasmatischen Retikulum in eine retrograde Mode13,14verinnerlicht. Die Internalisierung und retrograder Transport scheinen abhängig von der Aktin-Zytoskelett15,16 sowie auf die Mikrotubuli Netzwerk17sein.
Um die Nützlichkeit von CTB als retrograde neuroanatomischen Tracer Kennzeichnung Membran-PhMN Schaltung zu demonstrieren, wurde die CTB-Fluorophor Intrapleurally geliefert. CTB verabreicht wurde, mit zwei Techniken: Erstens enthalten eine Laparotomie und mehrere Transdiaphragmatic Injektionen; die zweite, weniger invasiv und verwendet einer einzigartige transthorakalen Injektion. Vier Tage wurden später, Eindringmittel beschriftet PhMNs im zervikalen Rückenmark aus gesunden und spinally verletzt (C4) Tiere quantifiziert.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass-bead sterilizer Steri 250</td>
			<td>Keller</td>
			<td>31-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>14058-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft tweezers</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11042-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>No.11 or 15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C22843</td>
			<td>Bring at room temperature before use&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ul Hamilton syringue, removable needle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>701RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4</td>
			<td>Filter Service</td>
			<td>7803-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>BS05M2713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orientable LED lamp</td>
			<td>V.W.R.</td>
			<td>631-0995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorbable 4/0 sutures</td>
			<td>S.M.I. AG</td>
			<td>15151519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>12002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9mm autoclips</td>
			<td>Bioseb</td>
			<td>205016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclip 9mm applier</td>
			<td>Bioseb</td>
			<td>MikRon 9mm</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrograde neuroanatomical tracing of phrenic motor neurons in mice

Phrenicus Motoneuronen sind zervikale Motoneuronen aus C3 bis C6 Ebenen in die meisten Säugetierarten. Axonale Projektionen konvergieren in Phrenicus Nerven innervieren die Atemwege Membran. Im Rückenmark Scheiben werden nicht Phrenicus Motoneuronen aus anderen motorischen Neuronen auf morphologische und biochemische Kriterien identifiziert. Wir bieten die Beschreibung der Verfahren zur Visualisierung von Phrenicus Motoneuron Zellkörper in den Mäusen, folgende intrapleurale Injektionen von Cholera Toxin Untereinheit Beta (CTB) zu einem Fluorophor konjugiert. Diese fluoreszierenden neuroanatomischen Tracer hat die Fähigkeit, bei der neuromuskulären Membran aufgeholt werden, Phrenicus Axone Doppelthebel mitgenommen werden und erreichen den Phrenicus Zellkörper. Zwei methodische Ansätze der intrapleurale CTB Lieferung werden verglichen: Transdiaphragmatic versus transthorakalen Injektionen. Beide Ansätze sind erfolgreich und führen zu ähnlichen Anzahl von CTB-Label Phrenicus Motoneuronen. Zusammenfassend können diese Techniken angewendet werden, um sichtbar zu machen oder den Phrenicus motorischen Neuronen in verschiedenen experimentellen Studien wie die konzentrierte sich auf die Membran-Phrenicus Schaltung zu quantifizieren.

Männliche Mäuse C57bl/6J (n = 18), im Alter von 3 bis 4 Monate wurden in die Studie eingeschlossen. Am Tag 0 des Experiments unterzog 8 Mäuse eine einseitige C4-Prellung, rechtsseitige, nach veröffentlichten Protokoll7,18. Als Farce Verfahren unterzog 10 Mäuse eine Laminektomie auf C4 ohne Prellung. Am 3. Tag waren die intrapleurale Injektionen von CTB-Fluorophor nach zwei verschiedenen Verfahren, die oben beschriebenen Mäus...

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Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Identifizierung Phrenicus Motoneuronen bei Mäusen nach intrapleurale Lieferung der Fluorophor Cholera Toxin Untereinheit Beta konjugiert. Zwei Techniken werden verglichen, um den pleural Raum zu injizieren: Transdiaphragmatic versus transthorakalen Ansätze.

Retrograde neuroanatomischen Tracing der Phrenicus Motoneuronen bei Mäusen

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.6K Aufrufe.  Université de Namur. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Identifizierung Phrenicus Motoneuronen bei Mäusen nach intrapleurale Lieferung der Fluorophor Cholera Toxin Untereinheit Beta konjugiert. Zwei Techniken werden verglichen, um den pleural Raum zu injizieren: Transdiaphragmatic versus transthorakalen Ansätze.

Serie: Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Assessment of Motor Balance and Coordination in Mice using the Balance Beam

Brain injury, genetic manipulations, and pharmacological treatments can result in alterations of motor skills in mice. Fine motor coordination and balance can be assessed by the beam walking assay. The goal of this test is for the mouse to stay upright and walk across an elevated narrow beam to a safe platform. This test takes place over 3 consecutive days: 2 days of training and 1 day of testing. Performance on the beam is quantified by measuring the time it takes for the mouse to traverse the beam and the number of paw slips that occur in the process. Here we report the protocol used in our laboratory, and representative results from a cohort of C57BL/6 mice. This task is particularly useful for detecting subtle deficits in motor skills and balance that may not be detected by other motor tests, such as the Rotarod.

Deficits in fine motor coordination can be assessed with the balance beam test. Performance on the beam is quantified by the speed at which the beam is traversed and the number of times the mouse slips on the beam.

Beurteilung der Motor Balance und Koordination in Mäuse mit dem Schwebebalken

Brain injury, genetic manipulations, and pharmacological treatments can result in alterations of motor skills in mice.  Fine motor coordination and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Multiple-Maus Neuroanatomische Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Measuring Motor Coordination in Mice

Mice are increasingly being used in behavioral neuroscience, largely replacing rats as the behaviorist's animal of choice. Before aspects of behavior such as emotionality or cognition can be assessed, however, it is vital to determine whether the motor capabilities of e.g. a mutant or lesioned mouse allow such an assessment. Performance on a maze task requiring strength and coordination, such as the Morris water maze, might well be impaired in a mouse by motor, rather than cognitive, impairments, so it is essential to selectively dissect the latter from the former. For example, sensorimotor impairments caused by NMDA antagonists have been shown to impair water maze performance2. 
Motor coordination has traditionally been assessed in mice and rats by the rotarod test, in which the animal is placed on a horizontal rod that rotates about its long axis; the animal must walk forwards to remain upright and not fall off. Both set speed and accelerating versions of the rotarod are available.
The other three tests described in this article (horizontal bar, static rods and parallel bars) all measure coordination on static apparatus. The horizontal bar also requires strength for adequate performance, particularly of the forelimbs as the mouse initially grips the bar just with the front paws. 
Adult rats do not perform well on tests such as the static rods and parallel bars (personal observations); they appear less well coordinated than mice. I have only tested male rats, however, and male mice seem generally less well coordinated than females. Mice appear to have a higher strength:weight ratio than rats; the Latin name, Mus musculus, seems entirely appropriate. The rotarod, the variations of the foot fault test12 or the Catwalk (Noldus)15 apparatus are generally used to assess motor coordination in rats.

Protocols are presented for two established motor coordination tasks, the accelerating rotarod and horizontal bar, also two tests developed in Oxford recently, the static rods and parallel bars. These tests can detect motor impairments potentially of interest in their own right, as well as being possible variables in tests of other areas of behavior.

Mess-motorische Koordination in Mäuse

Mice are increasingly being used in behavioral neuroscience, largely replacing rats as the behaviorist's animal of choice. Before aspects of behavior such ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Retrograde Fluoreszenzmarkierung Ermöglicht Gezielte Extracellular Einzel-Einheit Aufnahme von identifizierten Neuronen<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Extrazellulär identifizieren Motor Neurons für einen Muscle Motor Pool in<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

Bedingte Genetische transsynaptische Tracing in der embryonalen Maus-Gehirn

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.

Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.

Funktionellen und morphologischen Bewertung der Membran Innervation durch phrenicus Motoneuronen

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake through electroporation in brain explants with targeted laser illumination and matching filter goggles during the procedure. The described technique of in vitro electroporation by itself yields relatively good visual control for targetting certain areas of the brain. By combining it with laser excitation of fluorescent genetic markers and their read-out through band-passing filter goggles, which can pick up the emissions of the genetically labeled cells/nuclei and the fluorescent tracing dye, a researcher can substantially increase the accuracy of injections by finding the area of interest and controlling for the dye-spread/uptake in the injection area much more efficiently. In addition, the laser illumination technique allows to study the functionality of a given neurocircuit by providing information about the type of neurons projecting to a certain area in cases where the GFP expression is linked to the type of transmitter expressed by a subpopulation of neurons.

We describe a technique to label neurons and their processes via anterograde or retrograde tracer injections into brain nuclei using an in vitro preparation. We modified an existing method of in vitro tracer electroporation by taking advantage of fluorescently labeled mouse mutants and basic optical equipment in order to increase labeling accuracy.

Lasergelenkte neuronale Tracing in Brain Explantate

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

Visualisierung des axonalen Projektionsmusters der embryonalen motorischen Neuronen in<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Zwei-Photon Imaging der kortikalen Neuronen bei Neugeborenen Mäusen

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Retrograde neuroanatomischen Tracing der Phrenicus Motoneuronen bei Mäusen

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