Name: retrograde neuroanatomical tracing of phrenic motor neurons in mice
Uploaded: 2018-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
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Wir sind dankbar, Robert Graffin und Pauline Duhant für ihre technische Unterstützung.

Das experimentelle Protokoll wurde in Übereinstimmung mit den Europäischen Gemeinschaften Ratsrichtlinien für Tier-Experiment (2010/63/EU, 86/609/EWG und 87-848/EWG) durchgeführt und wurde genehmigt durch das Tier Ethik Ausschuss der Universität Namur (Ethik Projekt n ° 17-284 ). Abbildung 1 zeigt die beiden jeweiligen Ansätze: Transdiaphragmatic oder transthorakalen Injektionen. Verwenden Sie männliche Mäuse C57bl/6J (n = 18), im Alter von 3 bis 4 Monate in der Studie.
1. Vorbereitung der CTB-Lösung
<ol><li>Für Transdiaphragmatic-Injektionen:<ol>
<li>Lösen Sie die CTB macht in sterilem Wasser auf die Konzentration von 0,2 % (w/V).</li>
		<li>Laden Sie 7,5 µL CTB-Lösung (0,2 % w/V) in eine sterile 10-µL-Microsyringe mit einer angehängten 33-Gauge-Nadel (stumpf oder kurze Fase) für jede Maus.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transthorakalen Injektionslösung:<ol>
<li>Lösen Sie die CTB macht in sterilem Wasser auf die Konzentration von 0,1 % (w/V).</li>
		<li>Laden Sie 20 µL CTB-Lösung (0,1 % w/V) in eine sterile 500 µl Insulin-Spritze mit einer abgeschrägten 27-Gauge-Nadel für jede Maus. Hinweis: Achten Sie darauf, destilliert und steriles Wasser verwenden und ordnungsgemäß auflösen der CTB-Pulver. Die Lösung kann bei 4 ° C aufbewahrt werden, für einen Monat (nicht einfrieren). Nach paar Tagen könnte einen Niederschlag bilden. Bringen Sie die Lösung auf Raumtemperatur und mischen Sie gut mit einer Pipette vor Gebrauch.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vorbereitung vor intrapleurale Injektionen
<ol><li>Chirurgische Instrumente vor der Operation, mit Autoklav oder Glasperlen Sterilisator zu sterilisieren. Bereiten Sie einen sauberen Werkbank Mantel Chirurgie und chirurgische Instrumente zu entsorgen. Hinweis: Jedes Material verwendet während des chirurgischen Eingriffs sollte steril sein. Instrumente, die sterilisiert werden können nicht, wie die Microsyringe mit einem Desinfektionsmittel (Chlorhexidin) abgewischt werden sollten oder sollte Einmalgebrauch. Der Chirurg sollte seine/ihre Hände mit einem Desinfektionsmittel (Chlorhexidin Peeling) vor dem Beginn der Operation waschen. Der Chirurg sollte sterile Handschuhe, eine Gesichtsmaske und ein sauberes Kleid tragen.</li>
	<li>Tier wiegen und verwalten eine angemessene Dosis der Anästhesie: intraperitoneale Injektion von Betäubungsmittel cocktail (z.B. Ketamin 100 mg/kg und Xylazin 5 mg/kg).</li>
	<li>Zeh kneifen und/oder für den Verlust von palpebrale Reflex um festzustellen, ob die Maus richtig betäubt ist zu überprüfen. Wenden Sie eine Tierarzt Salbe zum Schutz der Hornhaut an.</li>
	<li>Rasieren Sie sorgfältig die ventralen (für Transdiaphragmatic-Verfahren) oder die rechtsseitige thorakalen Haut (für transthorakalen Verfahren), mit elektrischen Haarschneidemaschinen. Rasieren Sie gut und breit genug, um zu verhindern, dass die Haare immer in das OP-Feld.</li>
	<li>Sicherstellen Sie aseptische Bedingungen durch topische Anwendung von 10 %-Jod-Lösung auf den rasierten Bereich. Scheuern der Operationsstelle mit Jod-Lösung, dabei darauf achten, aus der Mitte des Grundstücks in Richtung der Peripherie zu schrubben.</li>
	<li>Verwenden Sie homöotherm Pad während der Operation, um das Tier Körpertemperatur aufrechtzuerhalten.</li>
</ol>3. intrapleurale Injektionen mit Transdiaphragmatic Ansatz
<ol><li>Legen Sie den narkotisierten Maus in Rückenlage auf ein Heizkissen. Legen Sie einem gerollten Tupfer unter dem Hals des Tieres. Verwenden Sie bei einer erwachsenen Maus einem gerollten Tupfer von 0,5 Zoll dicke. Kleben Sie das Pad in den Vorstand der Operation, wenn jede Bewegung zu vermeiden.</li>
	<li>Mit einem Skalpellklinge, die ventrale Haut entlang der Mittellinie einschneiden: einen Einschnitt von Xiphoid Prozeß der Nabelschnur Region während der Dehnung der Haut seitlich mit der anderen Hand die Haut straff zu machen. Nicht zu viel Druck auf die Klinge zur Vermeidung von Schäden zugrunde liegenden Organe.</li>
	<li>Nehmen Sie mit einer kleinen Schere ab, sorgfältig die Haut von den Abdominal-Muskeln rund um den Schnitt. Dieses Verfahren hilft beim Nähen der Muskeln und der Haut, die am Ende der Operation auseinander.</li>
	<li>Führen Sie mit einer kleinen Schere Laparotomie. Öffnen Sie die Bauchhöhle durch ein Knopfloch Einschnitt auf der Ebene des Nabels durchführen. Die Abdominal-Muskeln entlang der weißen Linie einschneiden ("Linea Alba") bis zum Xiphoid Prozeß.</li>
	<li>Zurückziehen Sie, um den Bauch das Zwerchfell sichtbar gemacht, Bauchmuskeln mit kommerziellen oder hausgemachte Retraktoren. Hinweis: Diese Retraktoren können von der Midi-Größe Büroklammer geformt L-Haken19erfolgen.</li>
	<li>Strecken Sie beide Seiten der Laparotomie und Klebeband unten der Retraktoren Bench Mantel. Optimieren Sie die Ausleuchtung des Sichtfeldes, so dass die Bauch Oberfläche der Membran nicht mehr in den Halbschatten ist. Die mächtigste Beleuchtungseinrichtung für diesen Zweck ist eine LED-Lampe mit einem orientierbar Lichtstrahl.</li>
	<li>Weiche Pinzette in der Hand, heben Sie Xyphoid Anhang und ziehen Sie die seitlichen Lappen der Leber (Abbildung 2A). Mit einer kleinen Schere in der anderen Hand vorsichtig abgeschnitten Hodenbeutel Ligament, ohne Beschädigung der Gallenblase oder der Membran (Abbildung 2 b).</li>
	<li>Heben Sie weiche Pinzette in der Hand, die Xyphoid Anhang. Die Hamilton-Spritze in der anderen Hand zu erfassen. Ziel der drei Standorte der Injektion in die richtigen Hemidiaphragm bzw. der sternalen, decken die Medial und musculorum Regionen (Abb. 3A, Einfügung in Abb. 3 b).</li>
	<li>Da die Dicke der Membran rund 0,37 mm in Mäusen7ist, legen Sie die Nadel nicht mehr als 1 oder 2 mm über der Membran-Blatt zur Verhinderung der Lunge beim Atmen. 2.5 µL CTB-Lösung (0,2 % w/V) durch die richtige Membrane an jedem Standort (Abbildung 4 b) zu liefern. Stabilisierung der Membran ist nicht erforderlich.</li>
	<li>Wiederholen Sie diesen Vorgang für die drei ipsilateral Standorte der Einspritzung (Abbildung 1A) und contralaterally für eine bilaterale Kennzeichnung des PhMN Pools.</li>
	<li>Bauchmuskeln mit resorbierbaren Naht um die Laparotomie-Standort in der Nähe, 4-0 Naht. Mit 9,0 mm Wunde Clips geschlossenes verwenden unterbrochene Stiche von 3 mm. Grundnahrungsmittel Haut verteilt. Ziehen Sie die Klammern verhindern, dass Tier abziehen Heftklammern. Platz heftet ca. 5 mm auseinander. Nicht überdrehen der Wunde Clips, da dies zur Beeinträchtigung Heilung führen kann.</li>
	<li>Saubere Mikro Spritze mit destilliertem Wasser, Verstopfung zu verhindern. Langsam erarbeiten und vertreiben 2-3 Mal. Ziehen Sie keine Luft in die Spritze.</li>
</ol>4. intrapleurale Injektion mittels transthorakalen Ansatz
Hinweis: Diese Methode ist inspiriert von dem in Ratten4 beschriebenen Verfahren und wurde an die Maus.
<ol><li>Legen Sie den narkotisierten Maus im linken seitlichen Dekubitus auf ein Heizkissen (Abb. 4A) positionieren.</li>
	<li>Identifizieren Sie die sechsten und siebten Rippen unter der Ellenbogen-Region durch manuelle Abtasten (Abbildung 4 b).</li>
	<li>Während ein Assistent rechten Vordergrund - und -Hinterbeine (Abb. 5A) erstreckt, legen Sie die Spritze cranially orientiert und tangential unter dem sechsten oder siebten Rippe, 3 mm tief aus der Haut, mit der Fase nach unten (Abbildung 1 b und Abbildung 5 b).</li>
	<li>Heben Sie die Nadel vorsichtig zur Bestätigung durch Anheben der Rippen, dass es gut, in der Brusthöhle (Abbildung 5, Einsätze in Abbildung 1 b positioniert ist).</li>
	<li>Atembewegungen des Brustkorbs durch leichten Druck mit zwei Fingern auf die Brustwand zu stabilisieren.</li>
	<li>Halten Sie die Spritze in der anderen Hand, liefern Sie 20 µL der CTB-Lösung (0,1 % w/V) in einer einzigen Injektion.</li>
</ol>5. postoperative Pflege
<ol><li>Unmittelbar nach dem Eingriff lag der Maus im rechten seitlichen Dekubitus Position auf einem homöotherm Pad für Erholung. Dies sorgt für die Tracer auf der rechten Seite den pleural Raum zu verbreiten und für die Überwachung des Tieres Atmung ermöglicht.</li>
	<li>Verabreichen Sie 1 mL steriler Kochsalzlösung i.p subkutan. Geben Sie Follow-up-Injektionen, wenn das Tier dehydriert und/oder lustlos erscheint.</li>
	<li>Verwalten von Buprenorphin 0,1 mg/kg subkutan zweimal täglich während der ersten zwei Tage nach der Operation, um mögliche Schmerzen zu minimieren. Hinweis: Viele Institutionen empfehlen multimodalen Analgesie für invasive Verfahren, wie die hier abgebildete Laparotomie. Dazu zählen die Verwendung von einer nicht-steroidale Entzündungshemmer (NSAR) und/oder ein Lokalanästhetikum Agent bei der Schnitt-Website. Diese Medikamente sind in der Regel vor dem ersten Schnitt Aufzieh Schmerzen zu minimieren geliefert.</li>
	<li>Beobachten Sie Tiere täglich bis zur Sterbehilfe.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Webber, C. L., Wurster, R. D., Chung, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cat+phrenic+nucleus+architecture+as+revealed+by+horseradish+peroxidase+mapping.">Cat phrenic nucleus architecture as revealed by horseradish peroxidase mapping.</a> Exp Brain Res. 35 (3), 395-406 (1979).</li><li>Goshgarian, H. G., Rafols, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phrenic+nucleus+of+the+albino+rat:+a+correlative+HRP+and+Golgi+study.">The phrenic nucleus of the albino rat: a correlative HRP and Golgi study.</a> J Comp Neurol. 201 (3), 441-456 (1981).</li><li>Gordon, D. C., Richmond, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+in+the+phrenic+motoneuron+nucleus+demonstrated+by+retrograde+multiple-labelling+techniques.">Topography in the phrenic motoneuron nucleus demonstrated by retrograde multiple-labelling techniques.</a> J Comp Neurol. 292 (3), 424-434 (1990).</li><li>Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+transplantation-based+astrocyte+replacement+is+neuroprotective+in+a+model+of+motor+neuron+disease.">Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease.</a> Nat Neurosci. 11 (11), 1294-1301 (2008).</li><li>Sieck, G. C., Fournier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diaphragm+motor+unit+recruitment+during+ventilatory+and+nonventilatory+behaviors.">Diaphragm motor unit recruitment during ventilatory and nonventilatory behaviors.</a> J Appl Physiol. 66 (6), 2539-2545 (1989).</li><li>Janicot, M., Clot, J. P., Desbuquois, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+cholera+toxin+with+isolated+hepatocytes.+Effects+of+low+pH,+chloroquine+and+monensin+on+toxin+internalization,+processing+and+action.">Interactions of cholera toxin with isolated hepatocytes. Effects of low pH, chloroquine and monensin on toxin internalization, processing and action.</a> Biochem J. 253 (3), 735-743 (1988).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die hierin beschriebene Protokoll kann angewendet werden, um jede Belastung erwachsener Mäuse oder experimentellen Paradigma, in dem die Integrität der Membran-PhMN Schaltung ausgewertet werden soll. Zum Beispiel sind die Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und Verletzungen des zervikalen Rückenmarks (cSCI) Bedingungen im Zusammenhang mit PhMN Verlust, Anterograde Degeneration der Phrenicus Axone und anschließende Atemwege Kompromiss. Tiermodelle der ALS oder cSCI imitieren histopathologische und funktionelle Atemwege D...

Das Ziel der Studie ist es, eine zuverlässige Methode um Phrenicus Motoneuronen (PhMN) auf Maus Rückenmark Abschnitte identifizieren zu präsentieren. Injektion eines fluoreszierenden neuroanatomischen Tracers in den pleural Raum wurde gewählt, als die Versandart der Phrenicus neuromuskulären Projektionen auf der Membran zu erreichen und mit retrograder Transport entlang der Phrenicus Axone Phrenicus Zellkörpern beschriften. Zwei Techniken der intrapleurale Lieferung werden beschrieben: Transdiaphragmatic versus transthorakalen.
Phrenicus Motoneuronen sind spinale Relais Zellen, deren Axone in Phrenicus Nerven zusammenlaufen, die letztlich das Zwerchfell innervieren. Dies sind die unteren Motoneuronen bulbärer respiratorischen Zentren den inspiratorischen Antrieb erhalten und auf die Membran Neuro-muskuläre Kreuzungen (NMJ) Weiterleitung. PhMN gliedert sich in zwei motor Spalten, eine für jede Hemicord, die entlang der Mitte der Halswirbelsäule. In den meisten Säugetierarten einschließlich des Menschen breitete sich die Phrenicus motor Spalten von Ebenen C3 bis C61,2,3. Wir und andere haben bestätigt, dass PhMN in C3-C5-Ebenen im Ratte und Maus Rückenmark4,5,6,7,8konzentriert. Die topographische Verteilung der Phrenicus Zellen ist nicht nach dem Zufallsprinzip; motorischen Neuronen innervieren die sternalen Teil der Membran sind Dichter im kranialen Teil der Phrenicus Fuhrpark (C3), verteilt, während motorischen Neuronen innervieren den musculorum Teil mehr kaudalen (C5)9sind. Darüber hinaus PhMN sind verschiedentlich in der ventralen Horn grauen Substanz gruppiert. Ebene C3 die Cluster der Phrenicus Zellen liegen seitlich, dann im ventrolateralen Richtung verschieben und ventromedially finden sich in den meisten caudale Ebenen10,11.
Ihre wichtige Rolle während der Inspiration gegeben, ist es von größter Wichtigkeit zu PhMN genau zu identifizieren, im gesunden Rückenmark sondern auch ihr Schicksal während der pathologischen Zuständen, z. B. degenerativen Erkrankungen oder traumatische Verletzungen des Rückenmarks. Da PhMN nicht unterscheiden sich morphologisch von anderen zervikalen Motoneuronen, hängt Identifizierung von PhMN die gezielte Bereitstellung von neuroanatomischen Tracern entweder auf der Ebene des primären respiratorischen Zentren8, oder an der Membran NMJ7 oder in der Phrenicus Nerv4. Die Tracer ist von Nervenfasern aufgegriffen und bis zu den Phrenicus Zellkörper an der Halswirbelsäule, wo es mit direkter oder indirekter Detection Systeme visualisiert werden kann. Retrograde und Anterograde Tracer sind im Handel erhältlich, mit einer breiten Palette von Konjugate. Bemerkenswert, jeder Tracer ist dotiert mit Nein, niedrigen oder hohen Fähigkeiten für die synaptische Trans-Ablaufverfolgung.
In der aktuellen Studie wählten wir die Beta-Untereinheit das Cholera-Toxin (CTB) funktionalisiert mit Alexa Fluor 555 (im folgenden als CTB-Fluorophor bezeichnet) als fluoreszierende Label ermöglicht eine direkte Visualisierung der PhMN auf gefrorenen Rückenmark Abschnitte. CTB ist in der Regel als monosynaptische Tracer beschrieben, obwohl experimentelle Daten weisen darauf hin eine Transneuronal Durchgang12zeigen. CTB hat die Fähigkeit, das Gangliosid GM1 in der Plasmamembran von der Nervenendigung binden. CTB ist über Clathrin-abhängige oder -unabhängige Mechanismen und Verkehre über das Trans-Golgi-Netzwerk in dem endoplasmatischen Retikulum in eine retrograde Mode13,14verinnerlicht. Die Internalisierung und retrograder Transport scheinen abhängig von der Aktin-Zytoskelett15,16 sowie auf die Mikrotubuli Netzwerk17sein.
Um die Nützlichkeit von CTB als retrograde neuroanatomischen Tracer Kennzeichnung Membran-PhMN Schaltung zu demonstrieren, wurde die CTB-Fluorophor Intrapleurally geliefert. CTB verabreicht wurde, mit zwei Techniken: Erstens enthalten eine Laparotomie und mehrere Transdiaphragmatic Injektionen; die zweite, weniger invasiv und verwendet einer einzigartige transthorakalen Injektion. Vier Tage wurden später, Eindringmittel beschriftet PhMNs im zervikalen Rückenmark aus gesunden und spinally verletzt (C4) Tiere quantifiziert.

<table><tbody><tr><td>Glass-bead sterilizer Steri 250</td><td>Keller</td><td>31-101</td><td></td></tr><tr><td>Small scissors</td><td>F.S.T.</td><td>14058-00</td><td></td></tr><tr><td>Soft tweezers</td><td>F.S.T.</td><td>11042-08</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blades</td><td>Swann Morton</td><td>No.11 or 15</td><td></td></tr><tr><td>Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555</td><td>Life Technologies</td><td>C22843</td><td>Bring at room temperature before use&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>10ul Hamilton syringue, removable needle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>701RN</td><td></td></tr><tr><td>33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4</td><td>Filter Service</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge</td><td>Terumo</td><td>BS05M2713</td><td></td></tr><tr><td>Orientable LED lamp</td><td>V.W.R.</td><td>631-0995</td><td></td></tr><tr><td>Resorbable 4/0 sutures</td><td>S.M.I. AG</td><td>15151519</td><td></td></tr><tr><td>Needle holder</td><td>F.S.T.</td><td>12002-14</td><td></td></tr><tr><td>9mm autoclips</td><td>Bioseb</td><td>205016</td><td></td></tr><tr><td>Autoclip 9mm applier</td><td>Bioseb</td><td>MikRon 9mm</td><td></td></tr></tbody></table>

retrograde neuroanatomical tracing of phrenic motor neurons in mice

Phrenicus Motoneuronen sind zervikale Motoneuronen aus C3 bis C6 Ebenen in die meisten Säugetierarten. Axonale Projektionen konvergieren in Phrenicus Nerven innervieren die Atemwege Membran. Im Rückenmark Scheiben werden nicht Phrenicus Motoneuronen aus anderen motorischen Neuronen auf morphologische und biochemische Kriterien identifiziert. Wir bieten die Beschreibung der Verfahren zur Visualisierung von Phrenicus Motoneuron Zellkörper in den Mäusen, folgende intrapleurale Injektionen von Cholera Toxin Untereinheit Beta (CTB) zu einem Fluorophor konjugiert. Diese fluoreszierenden neuroanatomischen Tracer hat die Fähigkeit, bei der neuromuskulären Membran aufgeholt werden, Phrenicus Axone Doppelthebel mitgenommen werden und erreichen den Phrenicus Zellkörper. Zwei methodische Ansätze der intrapleurale CTB Lieferung werden verglichen: Transdiaphragmatic versus transthorakalen Injektionen. Beide Ansätze sind erfolgreich und führen zu ähnlichen Anzahl von CTB-Label Phrenicus Motoneuronen. Zusammenfassend können diese Techniken angewendet werden, um sichtbar zu machen oder den Phrenicus motorischen Neuronen in verschiedenen experimentellen Studien wie die konzentrierte sich auf die Membran-Phrenicus Schaltung zu quantifizieren.

Männliche Mäuse C57bl/6J (n = 18), im Alter von 3 bis 4 Monate wurden in die Studie eingeschlossen. Am Tag 0 des Experiments unterzog 8 Mäuse eine einseitige C4-Prellung, rechtsseitige, nach veröffentlichten Protokoll7,18. Als Farce Verfahren unterzog 10 Mäuse eine Laminektomie auf C4 ohne Prellung. Am 3. Tag waren die intrapleurale Injektionen von CTB-Fluorophor nach zwei verschiedenen Verfahren, die oben beschriebenen Mäus...

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Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Identifizierung Phrenicus Motoneuronen bei Mäusen nach intrapleurale Lieferung der Fluorophor Cholera Toxin Untereinheit Beta konjugiert. Zwei Techniken werden verglichen, um den pleural Raum zu injizieren: Transdiaphragmatic versus transthorakalen Ansätze.

Retrograde neuroanatomischen Tracing der Phrenicus Motoneuronen bei Mäusen

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.6K Aufrufe.  Université de Namur. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Identifizierung Phrenicus Motoneuronen bei Mäusen nach intrapleurale Lieferung der Fluorophor Cholera Toxin Untereinheit Beta konjugiert. Zwei Techniken werden verglichen, um den pleural Raum zu injizieren: Transdiaphragmatic versus transthorakalen Ansätze.

Serie: Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Reproduzierbare Maus Ischiasnerv Crush und anschließende Bewertung der Regeneration von Whole mount Muskelanalyse

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Forschung

Neurowissenschaften

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an embryonic fillet preparation by a microinjector. Each motor neuron whose membrane is contacted by the droplet can then be rapidly labeled. Individual motor neurons are continuously labeled, enabling fine structural details to be clearly visualized. Given that lipophilic dyes come in various colors, the technique also provides a means to get adjacent neurons labeled in multicolor. This tracing technique is therefore useful for studying neuronal morphogenesis and synaptic connectivity in the motor neuron system of Drosophila.

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a method for retrograde tracing of the Drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes.

Retrograde Tracing von Drosophila Embryonal Motor Neuronen mit lipophilen fluoreszierenden Farbstoffen

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

Entwicklungsbiologie

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.

Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.

Funktionellen und morphologischen Bewertung der Membran Innervation durch phrenicus Motoneuronen

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the development of several animal models of these neuromuscular disorders has provided the scientific community with different therapeutic scenarios aimed at delaying or reversing the progression of these conditions. By taking advantage of the retrograde machinery of neurons, one of these approaches has been to target skeletal muscles in order to shuttle therapeutic genes into corresponding spinal cord motor neurons. Although once promising, the success of such gene delivery approach has been hampered by the sub-optimal number of transduced motor neurons it has so far shown to yield. Motor end plates (MEPs) are highly specialized regions on the skeletal musculature that are in direct synaptic contact to the spinal cord &#945; motor neurons. In this regard, it is important to note that, so far, the efforts to retrogradely transfer genes into motor neurons were made without reference to the location of the MEP region in the targeted muscles. Here, we describe a simple protocol 1) to reveal the exact location of the MEPs on the surface of skeletal muscles and 2) to use this information to guide the intramuscular delivery and subsequent optimal retrograde transport of retrograde tracers into motor neurons. We hope to utilize the results from these tracing experiments in further studies into investigating retrograde transport of therapeutic genes to spinal cord motor neurons through the targeting of MEPs.

The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

Intramuskuläre Injektionen Entlang der motorischen Endplatten: eine minimal-invasive Ansatz zur Shuttle Tracers Direkt in Motoneuronen

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake through electroporation in brain explants with targeted laser illumination and matching filter goggles during the procedure. The described technique of in vitro electroporation by itself yields relatively good visual control for targetting certain areas of the brain. By combining it with laser excitation of fluorescent genetic markers and their read-out through band-passing filter goggles, which can pick up the emissions of the genetically labeled cells/nuclei and the fluorescent tracing dye, a researcher can substantially increase the accuracy of injections by finding the area of interest and controlling for the dye-spread/uptake in the injection area much more efficiently. In addition, the laser illumination technique allows to study the functionality of a given neurocircuit by providing information about the type of neurons projecting to a certain area in cases where the GFP expression is linked to the type of transmitter expressed by a subpopulation of neurons.

We describe a technique to label neurons and their processes via anterograde or retrograde tracer injections into brain nuclei using an in vitro preparation. We modified an existing method of in vitro tracer electroporation by taking advantage of fluorescently labeled mouse mutants and basic optical equipment in order to increase labeling accuracy.

Lasergelenkte neuronale Tracing in Brain Explantate

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

Ex-Vivo Bildgebung von zellspezifische Kalzium Signalisierung an den dreigliedrigen Synapse der Maus Membran

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

A Mouse Model of Direct Anastomosis via the Prespinal Route for Crossing Nerve Transfer Surgery

Crossing nerve transfer surgery has been a powerful approach for repairing injured upper extremities in patients with brachial plexus avulsion injuries. Recently, this surgery was creatively applied in the clinical treatment of brain injury and achieved substantial rehabilitation of the paralyzed arm. This functional recovery after the surgery suggests that peripheral sensorimotor intervention induces profound neuroplasticity to compensate for the loss of function after brain damage; however, the underlying neural mechanism is poorly understood. Therefore, an emergent clinical animal model is required. Here, we simulated clinical surgery to establish a protocol of direct anastomosis of bilateral brachial plexus nerves via the prespinal route in mice. Neuroanatomical, electrophysiological, and behavioral experiments helped identify that the transferred nerves of these mice successfully reinnervated the impaired forelimb and contributed to accelerating motor recovery after brain injury. Therefore, the mouse model revealed the neural mechanisms underlying rehabilitation upon crossing nerve transfer after central and peripheral nervous system injuries.

We simulated clinical surgery to establish a protocol of direct anastomosis of bilateral brachial plexus nerves via the prespinal route in mice, contributing to the study of the neural mechanisms underlying rehabilitation upon crossing nerve transfer after central and peripheral nervous system injuries.

Ein Mausmodell der direkten Anastomose über den präspinalen Weg für die kreuzende Nerventransferchirurgie

Crossing nerve transfer surgery has been a powerful approach for repairing injured upper extremities in patients with brachial plexus avulsion injuries. ...

Stereotaxic Surgical Approach to Microinject the Caudal Brainstem and Upper Cervical Spinal Cord via the Cisterna Magna in Mice

Stereotaxic surgery to target brain sites in mice is commonly guided by skull landmarks. Access is then obtained via burr holes drilled through the skull. This standard approach can be challenging for targets in the caudal brainstem and upper cervical cord due to specific anatomical challenges as these sites are remote from skull landmarks, leading to imprecision. Here we outline an alternative stereotaxic approach via the cisterna magna that has been used to target discrete regions of interest in the caudal brainstem and upper cervical cord. The cisterna magna extends from the occipital bone to the atlas (i.e., the second vertebral bone), is filled with cerebrospinal fluid, and is covered by dura mater. This approach provides a reproducible route of access to select central nervous system (CNS) structures that are otherwise hard to reach due to anatomical barriers. Furthermore, it allows for direct visualization of brainstem landmarks in close proximity to the target sites, increasing accuracy when delivering small injection volumes to restricted regions of interest in the caudal brainstem and upper cervical cord. Finally, this approach provides an opportunity to avoid the cerebellum, which can be important for motor and sensorimotor studies.

Stereotaxic Surgical Approach to Microinject the Caudal Brainstem and Upper Cervical Spinal Cord via the Cisterna Magna in Mice

Stereotaxic surgery to target brain sites in mice commonly involves access through the skull bones and is guided by skull landmarks. Here we outline an alternative stereotaxic approach to target the caudal brainstem and upper cervical spinal cord via the cisterna magna that relies on direct visualization of brainstem landmarks.

Stereotaktischer chirurgischer Ansatz zur Mikroinjektion des kaudalen Hirnstamms und des oberen zervikalen Rückenmarks über die Cisterna magna bei Mäusen

Stereotaxic surgery to target brain sites in mice is commonly guided by skull landmarks. Access is then obtained via burr holes drilled through the skull. ...

Targeting von sympathischen Neuronen der Maus: Ein Ansatz zur lumbalen Sympathektomie

Surgical Lumbar Sympathectomy in Mice

Peripheral nerve injuries are common, and full functional recovery after injury is achieved in only 10% of patients. The sympathetic nervous system plays many critical roles in maintaining bodily homeostasis, but it has rarely been studied in the context of peripheral nerve injury. The extent of postganglionic sympathetic neuronal functions in distal targets in the periphery is currently unclear. To better explore the role of sympathetic innervation of peripheral targets, a surgical &#34;knock-out&#34; model provides an alternative approach. Although this can be achieved chemically, chemical destruction of postganglionic sympathetic neurons can be nonspecific and dose-dependent. The use of a surgical lumbar sympathectomy in mice, once thought to be &#34;virtually not practicable&#34; in small animals, allows for specific targeting of postganglionic sympathetic neurons that innervate the hind limbs. This manuscript describes how to surgically remove the L2-L5 lumbar sympathetic ganglia from a mouse as a survival surgery, which reliably decreases the hind paw sweat response and the number of sympathetic axons in the sciatic nerve.

Autor im Rampenlicht: Erforschung der Plastizität sympathischer Neuronen

This manuscript presents a protocol for surgically removing the postganglionic lumbar sympathetic neurons from a mouse. This procedure will facilitate a multitude of studies aimed at investigating the role of sympathetic innervation in distal tissue targets.

Chirurgische lumbale Sympathektomie bei Mäusen

Peripheral nerve injuries are common, and full functional recovery after injury is achieved in only 10% of patients. The sympathetic nervous system plays ...

Retrograde neuroanatomischen Tracing der Phrenicus Motoneuronen bei Mäusen

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Reproduzierbare Maus Ischiasnerv Crush und anschließende Bewertung der Regeneration von Whole mount Muskelanalyse

Retrograde Tracing von Drosophila Embryonal Motor Neuronen mit lipophilen fluoreszierenden Farbstoffen

Funktionellen und morphologischen Bewertung der Membran Innervation durch phrenicus Motoneuronen

Intramuskuläre Injektionen Entlang der motorischen Endplatten: eine minimal-invasive Ansatz zur Shuttle Tracers Direkt in Motoneuronen

Lasergelenkte neuronale Tracing in Brain Explantate

Ex-Vivo Bildgebung von zellspezifische Kalzium Signalisierung an den dreigliedrigen Synapse der Maus Membran

Ein Mausmodell der direkten Anastomose über den präspinalen Weg für die kreuzende Nerventransferchirurgie

Stereotaktischer chirurgischer Ansatz zur Mikroinjektion des kaudalen Hirnstamms und des oberen zervikalen Rückenmarks über die Cisterna magna bei Mäusen

Chirurgische lumbale Sympathektomie bei Mäusen

Chirurgische lumbale Sympathektomie bei Mäusen