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Alle Maus-Experimente wurden in Übereinstimmung mit Protokollen von der Institutional Animal Care und Verwenden Committees (IACUC) von LSU School of Medicine genehmigt wurde. Alle Instrumente müssen vor der Dissektion autoklaviert werden. 1. Herstellung von primären Zellen aus Mausbrusttumoren <ol><li> Eine Maus-Modell, das genetisch mit dem Maus-Brusttumorvirus Polyoma Middle-T-Antigen (MMTV-PyMT transgenen Maus), das spontan entwickeln Tumore wie zuvor beschrieben 6 konstruiert wurde. </li><li> Opfern Mäuse mit Isofluran (99,9%) und 75% Ethanol zu sprühen, um eine sterile Umgebung (1A) zu gewährleisten. </li><li> Öffnen die Haut vor dem Bereich der Harnröhrenöffnung, um den Hals mit einer Schere. Pin der Haut nach unten, um einfachen Zugang zu Organen (1B) zu ermöglichen. </li><li> Isolieren Sie die Brustbrusttumor und mit kaltem sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (pH 7,4) (Abbildung 1c). </li><li> Übertragen Sie den Tumoreine sterile 10 cm Gewebekulturplatte und hacken sie mit einer sterilen Rasierklinge und Schere auf ca. 1 mm 3 Stück. Die nachfolgenden Schritte sollten in einer sterilen Sterilbank durchgeführt werden. </li><li> Inkubiere die gehackte Tumorgewebe mit Collagenase in serumfreiem DMEM-Medium mit einer Endkonzentration von 1 mg / ml gelöst auf einer Wippe für 2 h bei 37 ° C. Zentrifugieren Sie das Tumorgewebe Suspension 3 min bei 200 x g. HINWEIS: Die Collagenase-Inkubation ist für enzymatische Dissoziation des Gewebes. </li><li> Überstand verwerfen und wäscht den Niederschlag 3-mal mit PBS (pH 7,4) durch Zentrifugation für 3 min bei 200 x g. Nach dem letzten Waschen, Dekantieren des Überstandes. </li><li> Resuspendieren des Gewebes mit 2 ml Trypsin-EDTA für 5 min bei 37 ° C, während Taumel. Zentrifugieren Sie die Suspension 3 min bei 200 xg und wiederholen Sie die Wäschen. </li><li> Resuspendieren Gewebepellet in normalem Wachstumsmedium (DMEM, 10% FBS, 2X Pen / Strep) auf eine 10 cm Platte. Veränderungdie Medien jeden Tag für die nächsten 3 Tage. Kulturzellen, bis die gewünschte Anzahl von Zellen erhalten wird. HINWEIS: Etwa 1x10 7 Zellen werden aus diesem Verfahren isoliert werden. Andere Maus-Mammatumorgenese Modellen wie MMTV-Neu ergeben niedrigere Ausbeute an Zellen im Vergleich mit MMTV-PyMT. Bei der Verwendung von Modellen, die einen niedrigeren Ertrag erzeugen, ist es vorteilhaft, mit einem größeren Tumor und Kulturzellen länger zu beginnen. </li></ol> 2. Maus Lung Extraction auf Lungenmetastasen visualisieren <ol><li> Vor der Lunge Extraktion, entfernen Sie die Leber und die Membran. Verdrängen die Rippen ohne die Lungen zu stören. </li><li> Mit einer feinen Schere, öffnen Sie den oberen Teil der Luftröhre, die näher an der Halsschlagader ist. </li><li> Verwendung eines Katheters, injiziert ein Mittel wie beispielsweise 1 ml Z-fix oder Tusche durch die Luftröhre in die Lunge (2A) zu füllen. Betten Sie die Z-fix Lungs in Paraffin. </li><li> De-Fleck die Lungen mit Tusche in Fekete-Lösung eingespritzt(100 ml 70% -igem Alkohol, 10 ml 10% igem gepuffertem Formalin und 5 ml Eisessig) für 5 min. Definieren Tumorknoten an sekundären Standorten mit ≥ 0,5 mm im Durchmesser, bestimmen die Knötchen als Metastasierung. HINWEIS: Aufgrund der Bronchien und Bronchiolen Blockade durch den Tumor, können Tumorknoten nicht absorbieren 15% Tusche und damit normalem Lungengewebe wird in schwarz, und die Tumorknoten wird in weißer Farbe 7 sein. Dies wird die Visualisierung individueller Tumorknoten (2B) zu ermöglichen. </li></ol> 3. Vorbereitung embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) aus Maus Embryonen <ol><li> Opfern trächtige Mäuse mit Isofluran (99,9%) und 75% Ethanol zu sprühen, um eine sterile Umgebung sichergestellt. </li><li> Öffnen die Haut vor dem Bereich der Harnröhrenöffnung, um den Hals mit einer Schere und Isolierung der Embryonen aus dem Uterus. </li><li> Achten Sie darauf, um die Embryonen stören beim Öffnen der Haut. </li><li> Entfernen Sie die Gebärmutterhörner und spülen Sie sie in kaltem sterile PBS (pH 7,4). </li><li> Trennen Sie den Embryo von seiner Plazenta sehr sorgfältig und Ort Embryonen in einer 10 cm Platte mit eiskaltem PBS (pH 7,4). </li><li> Entfernen Sie den Kopf, Leber und Darm aus dem Embryo und legen Sie den restlichen Teil in einer 12-Well-Gewebekulturplatte enthält PBS (pH 7,4). </li><li> Übertragen Sie die Embryo Körper in einen anderen 12 Well-Platte mit Trypsin EDTA und in kleine Stücke (ca. 1 mm 3) mit einer sterilen Rasierklinge und Schere. Inkubieren Häckselgut mit 5 ml Trypsin-EDTA für 5 min bei 37 ° C. </li><li> Inaktivierung von Trypsin durch Zugabe von 1 ml fötales Rinderserum (FBS), um die geschnittenen Embryonen. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 200 xg Geschwindigkeit für 10 Minuten, entfernen Sie vorsichtig den Überstand, das Pellet mit 1 ml warmem DMEM-Medium, und all der Inhalt in einer 10 cm Schale mit 10 ml DMEM (mit 20% FBS und 2X Penicillin / Streptomycin ). </li><li> Ändern Sie das Medium jeden Tag für zwei Tage. Kultur die Zellen, bis die gewünschte ZelleZahl erreicht ist. </li></ol>

<ol>
	<li>Minn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+lung.">Genes that mediate breast cancer metastasis to lung.</a> Natur. 436 (7050), 518-524 (2005).</li><li>Poste, G., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+cancer+metastasis.">The pathogenesis of cancer metastasis.</a> Natur. 283 (5743), 139-146 (1980).</li><li>Wan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Metastasis+Moving+New+Biological+Insights+into+the+Clinic.">Tumor Metastasis Moving New Biological Insights into the Clinic.</a> Nat Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).</li><li>Bergers, G., Benjamin, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumorigenesis+and+the+angiogenic+switch.">Tumorigenesis and the angiogenic switch.</a> Nat Rev Cancer. 3 (6), 401-410 (2003).</li><li>Frese, K. K., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+mouse+cancer+models.">Maximizing mouse cancer models.</a> Nat Rev Cancer. 7 (9), 654-658 (2007).</li><li>Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+mammary+tumors+by+expression+of+polyomavirus+middle+T+oncogene:+a+transgenic+mouse+model+for+metastatic+disease.">Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease.</a> Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).</li><li>Wexler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+Identification+of+Experimental+Pulmonary+Metastases.">Accurate Identification of Experimental Pulmonary Metastases.</a> J Natl Cancer Inst. 36 (4), 641-645 (1966).</li><li>Boczkowski, D., Nair, S. K., Nam, J. H., Lyerly, H. K., Gilboa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+tumor+immunity+and+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+using+dendritic+cells+transfected+with+messenger+RNA+amplified+from+tumor+cells.">Induction of tumor immunity and cytotoxic T lymphocyte responses using dendritic cells transfected with messenger RNA amplified from tumor cells.</a> Cancer Res. 60 (4), 1028-1034 (2000).</li><li>Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+breast+cancer:+one+size+does+not+fit+all.">Modelling breast cancer: one size does not fit all.</a> Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).</li><li>Watts, A. M., Kennedy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+Tumor+Foci+in+an+Experimental+Murine+Tumor+Model+Using+Computer-Assisted+Video+Imaging.">Quantitation of Tumor Foci in an Experimental Murine Tumor Model Using Computer-Assisted Video Imaging.</a> Anal Bioche. 256 (2), 217-219 (1998).</li><li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regression+of+Established+Pulmonary+Metastases+and+Subcutaneous+Tumor+Mediated+by+the+Systemic+Administration+of+High-Dose+Recombinant+Interleukin+2.">Regression of Established Pulmonary Metastases and Subcutaneous Tumor Mediated by the Systemic Administration of High-Dose Recombinant Interleukin 2.</a> J Exp Me. 161 (5), 1169-1188 (1985).</li><li>Fantozzi, A., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+breast+cancer+metastasis.">Mouse models of breast cancer metastasis.</a> Breast Cancer Re. 8 (4), 212 (2006).</li><li>Veer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+predicts+clinical+outcome+of+breast+cancer.">Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer.</a> Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).</li></ol>

Die Autoren haben keine Angaben.

Dieses Protokoll ist zur Isolierung von primären Zellen aus einer neuen Maus-Tumor. Lysate aus diesen Verfahren hergestellt werden, sind nützlich für die Protein-, DNA- und RNA-Analyse. Krebszellen aus dem primären Brusttumor metastasieren häufig zum Gehirn, Lunge und Knochen 1. Eingeschlossen ist eine Technik, die zur Detektion von Lungenmetastasen zu extrahieren. Anfärben der Lunge mit einem Tintenfleck wird zur Visualisierung von Tumorknoten zu ermöglichen, wie in 2B zu sehen. Zur F...

Metastasis is the final step in the progression of breast cancer 1. It involves a series of steps in which malignant cells are released from the primary tumor and disseminated to other organs 2. The cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system 3. Each step in tumorigenesis is tightly controlled by cells through various genetic and epigenetic changes 4. To study the mechanisms of breast cancer tumorigenesis, mouse model systems have been utilized due to their short lifespan, small size and fast breeding time. Some major advantages of using mouse models in cancer research are the molecular and physiological similarities they share with humans 5. 
Established mouse and human cell lines have been used extensively in breast cancer research. Although we can obtain some information about the steps in metastasis using these cells, genetically manipulated animal models with tumor suppressors/oncogenes will give far more information about tumor development and metastasis starting from the embryonic stage. Thus, with these mouse models, we can obtain genetic and developmental regulation of tumor growth. Furthermore, the tumor microenvironment also plays an important role in tumor cell gene expression and it can be difficult to mimic the same scenario with studies using established cell lines. Primary human mammary tumors can also be used to study mouse mammary tumorigenesis. The main disadvantage of using isolated breast tumors is that this newly implanted tumor does not have the mouse&#8217;s vasculature and lymphatic tissue. Whereas the genetic mouse model systems for studying mammary tumorigenesis will allow us to monitor the steps of metastasis, analyze the tumor microenvironment, and access to the entire body 5.
The overall goal of this protocol is to study breast tumorigenesis in mice. It is known that breast cancers typically metastasize to the brain, lung and bone. This protocol allows for the isolation of primary mammary tumor cells, as well as, studying breast cancer metastasis to the lung. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life&#160; technologies</td>
			<td>25300-062</td>
			<td>Store at &#8211; 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td>Store at &#8211; 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3506</td>
			<td>Store at &#8211; 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Life&#160; technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Store at &#8211; 80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-fix</td>
			<td>ANATECH</td>
			<td>#174</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>India Ink</td>
			<td>Yasutomo</td>
			<td></td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AERRANE (Isoflurane)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>NDC 10019-773-60</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX0441-3</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary tumor and mef cell isolation to study lung metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

Die Tumorprogression Stadium, in dem das Tier zu opfern, hängt von der jeweiligen Studie und IACUC Richtlinien. In 1A einer 100 Tage alte C57BL / 6-Maus mit der Maus-Mammatumorvirus Polyoma Middle-T-Antigen (MMTV-PyMT) wurde nach drei Monaten geopfert. Die Haut wurde von dem Bereich der Harnröhrenöffnung, um den Hals mit einer Schere geöffnet und die Haut wurde festgenagelt, um einfachen Zugang zu Organen, wie in 1B gezeigt, zu ermöglichen. Dies erlaubt einen einfachen Zugang zum T...

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Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

Primärtumor und MEF Zellisolation zu Lungenmetastasen Studieren

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

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