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Tutti gli esperimenti di topo sono stati fatti secondo protocolli approvati dalla cura degli animali e Istituzionale Usa Comitati (IACUC) di LSU School of Medicine. Tutti gli strumenti devono essere sterilizzati in autoclave prima della dissezione. 1. Preparazione di cellule primarie di tumore al seno del mouse <ol><li> Utilizzare un modello di topo che è stato geneticamente con il Tumor Virus mouse mammaria Polyoma Medio T-Antigen (topo MMTV-PyMT transgenico), che si sviluppano spontaneamente tumori come descritto in precedenza 6. </li><li> Sacrificare topi con isoflurano (99,9%) e spruzzare il 75% di etanolo per assicurare un ambiente sterile (Figura 1A). </li><li> Aprire la pelle dalla superficie dell&#39;orifizio uretrale al collo con le forbici. Pin la pelle verso il basso per consentire un facile accesso agli organi (Figura 1B). </li><li> Isolare il tumore al seno mammaria e lavare con freddo fosfato sterile salina tamponata (PBS) (pH 7,4) (Figura 1C). </li><li> Trasferire il tumoreuna piastra di coltura tissutale sterili 10 centimetri e tritare con una lama di rasoio sterile e forbici a circa 1 mm 3 pezzi. Fasi successive devono essere eseguite in una cappa a flusso laminare sterile. </li><li> Incubare il tessuto tumorale tritato con collagenasi disciolto nel siero mezzi DMEM ad una concentrazione finale di 1 mg / ml su un bilanciere per 2 ore a 37 ° C. Centrifugare la sospensione tessuto tumorale per 3 min a 200 x g. NOTA: L&#39;incubazione Collagenase è essenziale per la dissociazione enzimatica del tessuto. </li><li> Eliminare il supernatante e lavare il precipitato 3 volte con PBS (pH 7,4) per centrifugazione per 3 min a 200 x g. Dopo l&#39;ultimo lavaggio, decantare il surnatante. </li><li> Risospendere il tessuto con 2 ml di tripsina EDTA per 5 min a 37 ° C mentre oscillante. Centrifugare la sospensione per 3 min a 200 xg e ripetere i lavaggi. </li><li> Risospendere il pellet in tessuto normale terreno di coltura (DMEM, 10% FBS, penna 2X / strep) su un piatto 10 cm. Cambiamentoi media ogni giorno per i prossimi 3 giorni. Cellule coltura fino numero di cellulare desiderato si ottiene. NOTA: circa 1x10 7 cellule saranno isolati da questa procedura. Altri modelli tumorigenesi del mouse mammari, come MMTV-Neu, danno minore resa delle celle rispetto a MMTV-PyMT. Quando si utilizzano i modelli che producono un rendimento inferiore, è utile cominciare con una più grande cellule tumorali e cultura più lunghi. </li></ol> 2. polmone mouse estrazione di visualizzare Lung Metastasi <ol><li> Prima di procedere all&#39;estrazione del polmone, rimuovere il fegato e il diaframma. Rimuovere le costole senza disturbare i polmoni. </li><li> Con un bel paio di forbici, aprire la parte superiore della trachea che è più vicino alla vena giugulare. </li><li> Utilizzando un catetere, iniettare un agente chimico come 1 ml di Z-fix o inchiostro India attraverso la trachea per riempire i polmoni (Figura 2A). Incorpora la Z-fix Polmoni in paraffina. </li><li> De-macchia polmoni iniettati con inchiostro di china in soluzione di Fekete(100 ml 70% alcool, 10 ml di 10% formalina tamponata, e 5 ml di acido acetico glaciale) per 5 min. Definire noduli tumorali nei siti secondari con un ≥ 0,5 mm di diametro, determinare i noduli come metastasi. NOTA: a causa di un blocco bronchi e bronchioli dal tumore, noduli tumorali non possono assorbire il 15% inchiostro di china, e quindi normale tessuto polmonare sarà in nero, e noduli tumorali saranno di colore bianco 7. Questo permetterà la visualizzazione dei noduli tumorali individuali (Figura 2B). </li></ol> 3. Preparazione embrionali fibroblasti di topo (MEF) da embrioni di topo <ol><li> Sacrificio topi in gravidanza con isoflurano (99,9%) e spruzzare il 75% di etanolo per garantire un ambiente sterile. </li><li> Aprire la pelle dalla superficie dell&#39;orifizio uretrale al collo con le forbici e isolare gli embrioni dall&#39;utero. </li><li> Fare attenzione a non disturbare gli embrioni quando si apre la pelle. </li><li> Rimuovere le corna uterine e sciacquarli sotto ste freddorile PBS (pH 7,4). </li><li> Separare l&#39;embrione dalla sua placenta con molta attenzione e mettere gli embrioni in un piatto 10 centimetri contenente ghiaccio freddo PBS (pH 7,4). </li><li> Togliere la testa, fegato e intestino dall&#39;embrione e posizionare la parte restante in una piastra di coltura tissutale 12 pozzetto contenente PBS (pH 7,4). </li><li> Trasferire il corpo dell&#39;embrione ad un altro 12 pozzetti contenente tripsina EDTA e tagliato in piccoli pezzi (~ 1 mm 3) con una lama di rasoio sterile e forbici. Incubare il materiale tagliato con 5 ml di tripsina EDTA per 5 min a 37 ° C. </li><li> Inattivare tripsina aggiungendo 1 ml di siero fetale bovino (FBS) per gli embrioni tritate. Centrifugare la sospensione a 200 velocità xg per 10 minuti, rimuovere con attenzione il surnatante, risospendere il pellet con 1 ml di terreno DMEM caldo e trasferire tutti i contenuti per un piatto di 10 centimetri contenente 10 ml di DMEM (con il 20% FBS e 2X penicillina / streptomicina ). </li><li> Cambia il mezzo ogni giorno per due giorni. Coltivare le cellule fino cella desideratail numero è raggiunto. </li></ol>

<ol>
	<li>Minn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+lung.">Genes that mediate breast cancer metastasis to lung.</a> Natur. 436 (7050), 518-524 (2005).</li><li>Poste, G., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+cancer+metastasis.">The pathogenesis of cancer metastasis.</a> Natur. 283 (5743), 139-146 (1980).</li><li>Wan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Metastasis+Moving+New+Biological+Insights+into+the+Clinic.">Tumor Metastasis Moving New Biological Insights into the Clinic.</a> Nat Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).</li><li>Bergers, G., Benjamin, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumorigenesis+and+the+angiogenic+switch.">Tumorigenesis and the angiogenic switch.</a> Nat Rev Cancer. 3 (6), 401-410 (2003).</li><li>Frese, K. K., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+mouse+cancer+models.">Maximizing mouse cancer models.</a> Nat Rev Cancer. 7 (9), 654-658 (2007).</li><li>Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+mammary+tumors+by+expression+of+polyomavirus+middle+T+oncogene:+a+transgenic+mouse+model+for+metastatic+disease.">Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease.</a> Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).</li><li>Wexler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+Identification+of+Experimental+Pulmonary+Metastases.">Accurate Identification of Experimental Pulmonary Metastases.</a> J Natl Cancer Inst. 36 (4), 641-645 (1966).</li><li>Boczkowski, D., Nair, S. K., Nam, J. H., Lyerly, H. K., Gilboa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+tumor+immunity+and+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+using+dendritic+cells+transfected+with+messenger+RNA+amplified+from+tumor+cells.">Induction of tumor immunity and cytotoxic T lymphocyte responses using dendritic cells transfected with messenger RNA amplified from tumor cells.</a> Cancer Res. 60 (4), 1028-1034 (2000).</li><li>Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+breast+cancer:+one+size+does+not+fit+all.">Modelling breast cancer: one size does not fit all.</a> Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).</li><li>Watts, A. M., Kennedy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+Tumor+Foci+in+an+Experimental+Murine+Tumor+Model+Using+Computer-Assisted+Video+Imaging.">Quantitation of Tumor Foci in an Experimental Murine Tumor Model Using Computer-Assisted Video Imaging.</a> Anal Bioche. 256 (2), 217-219 (1998).</li><li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regression+of+Established+Pulmonary+Metastases+and+Subcutaneous+Tumor+Mediated+by+the+Systemic+Administration+of+High-Dose+Recombinant+Interleukin+2.">Regression of Established Pulmonary Metastases and Subcutaneous Tumor Mediated by the Systemic Administration of High-Dose Recombinant Interleukin 2.</a> J Exp Me. 161 (5), 1169-1188 (1985).</li><li>Fantozzi, A., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+breast+cancer+metastasis.">Mouse models of breast cancer metastasis.</a> Breast Cancer Re. 8 (4), 212 (2006).</li><li>Veer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+predicts+clinical+outcome+of+breast+cancer.">Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer.</a> Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).</li></ol>

Gli autori non hanno informativa.

Questo protocollo è per isolare cellule primarie di un tumore del mouse fresca. I lisati preparati da questo metodo sono utili per le proteine, DNA e RNA analisi. Le cellule tumorali del tumore mammario primario spesso metastatizzano al cervello, polmoni e ossa 1. Incluso è una tecnica per estrarre il polmone per il rilevamento di metastasi. Colorazione polmone con una macchia di inchiostro permetterà la visualizzazione dei noduli tumorali, come mostrato nella Figura 2B. Fissaggio dei polm...

Metastasis is the final step in the progression of breast cancer 1. It involves a series of steps in which malignant cells are released from the primary tumor and disseminated to other organs 2. The cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system 3. Each step in tumorigenesis is tightly controlled by cells through various genetic and epigenetic changes 4. To study the mechanisms of breast cancer tumorigenesis, mouse model systems have been utilized due to their short lifespan, small size and fast breeding time. Some major advantages of using mouse models in cancer research are the molecular and physiological similarities they share with humans 5. 
Established mouse and human cell lines have been used extensively in breast cancer research. Although we can obtain some information about the steps in metastasis using these cells, genetically manipulated animal models with tumor suppressors/oncogenes will give far more information about tumor development and metastasis starting from the embryonic stage. Thus, with these mouse models, we can obtain genetic and developmental regulation of tumor growth. Furthermore, the tumor microenvironment also plays an important role in tumor cell gene expression and it can be difficult to mimic the same scenario with studies using established cell lines. Primary human mammary tumors can also be used to study mouse mammary tumorigenesis. The main disadvantage of using isolated breast tumors is that this newly implanted tumor does not have the mouse&#8217;s vasculature and lymphatic tissue. Whereas the genetic mouse model systems for studying mammary tumorigenesis will allow us to monitor the steps of metastasis, analyze the tumor microenvironment, and access to the entire body 5.
The overall goal of this protocol is to study breast tumorigenesis in mice. It is known that breast cancers typically metastasize to the brain, lung and bone. This protocol allows for the isolation of primary mammary tumor cells, as well as, studying breast cancer metastasis to the lung. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life&#160; technologies</td>
			<td>25300-062</td>
			<td>Store at &#8211; 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td>Store at &#8211; 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3506</td>
			<td>Store at &#8211; 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Life&#160; technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Store at &#8211; 80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-fix</td>
			<td>ANATECH</td>
			<td>#174</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>India Ink</td>
			<td>Yasutomo</td>
			<td></td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AERRANE (Isoflurane)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>NDC 10019-773-60</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX0441-3</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary tumor and mef cell isolation to study lung metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

Lo stadio progressione tumorale in cui sacrificare l&#39;animale dipende dalla particolare studio e orientamenti IACUC. Nella Figura 1A, un 100 giorni vecchio C57BL / 6 del mouse con il Tumor Virus mouse mammaria Polyoma Medio T-antigene (MMTV-PyMT) è stato sacrificato a tre mesi. La pelle è stata aperta dalla zona dell&#39;orifizio uretrale al collo con le forbici e la pelle era immobilizzato per consentire un facile accesso agli organi come mostrato nella Figura 1B. Questo ha permes...

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Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

Tumore primario e isolamento delle cellule MEF per studiare Lung Metastasi

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

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15.7K Views.  Louisiana State University Health Sciences Center. The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.