We would like to thank NIH, LACaTS and Ochsner clinic foundation for the financial support.

すべてのマウスの実験は医学のLSU学校の制度的動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されたプロトコルに従って行われました。すべての機器は、切開の前にオートクレーブ処理されなければなりません。 マウス乳腫瘍からの一次細胞の作製<ol><li>遺伝的に、以前に6に記載されているように自然に腫瘍を発症マウス乳癌ウイルスポリオーマミドルT抗原（MMTV-PyMTトランスジェニックマウス）を用いて操作したマウスモデルを使用してください。 </li><li>イソフルラン（99.9％）でマウスを屠殺し、無菌環境（ 図1A）を確保するために75％エタノールをスプレー。 </li><li>はさみで首に尿道口の領域から肌を開きます。臓器（ 図1B）への容易なアクセスを可能にするために、皮膚を突き止めます。 </li><li>乳腺乳房腫瘍を分離し、冷滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）（pH7.4）で（ 図1C）で洗浄しました。 </li><li>に腫瘍を転送滅菌10センチメートル組織培養プレートと約1mm 3個に滅菌カミソリの刃やはさみでそれを切ります。その後の工程は、無菌層流フード内で行われるべきです。 </li><li> 37℃で2時間、ロッカー上に1mg / mlの最終濃度で、無血清DMEM培地に溶解したコラゲナーゼで細断腫瘍組織をインキュベートします。遠心200×gで3分間、腫瘍組織懸濁液。 注：コラゲナーゼインキュベーションは、組織の酵素的解離のために必須です。 </li><li>上清を捨て、200×gで3分間遠心分離することによってPBS（pH7.4）で沈殿物を3回洗浄します。最終洗浄後、上清をデカント。 </li><li>章動しながら37℃で5分間トリプシンEDTA 2mlで組織を再懸濁します。 200×gで3分間、懸濁液を遠心および洗浄を繰り返します。 </li><li> 10センチメートルプレート上に通常の増殖培地（DMEM、10％FBS、2Xペニシリン/ストレプトマイシン）中で組織ペレットを再懸濁します。変更メディア次の3日間毎日。所望の細胞数になるまで培養細胞が得られます。 注：約1×10 7個の細胞は、この手順から単離されます。 MMTV-PyMTと比較した場合、このようなMMTV-ノイのような他のマウス乳腺腫瘍形成モデルは、細胞のより低い収率を与えます。低い収量を生成モデルを使用する場合には、より長く、より大きな腫瘍および培養細胞で始めることが有益です。 </li></ol> 2.マウスの肺抽出は肺転移を可視化します<ol><li>肺抽出の前に、肝臓とダイヤフラムを取り外します。肺に影響を与えずにリブを取り除きます。 </li><li>はさみの罰金ペアで、頸静脈に近い気管の上部を開きます。 </li><li>カテーテルを用いて、肺（ 図2A）を満たすために、気管を介して、このようなZ-修正や墨汁の1ミリリットルのような薬剤を注入します。パラフィンにZ-修正肺を埋め込みます。 </li><li> Feketeの溶液に墨汁を注入した肺を脱染色（100ミリリットルの70％アルコールを10％緩衝ホルマリン10mlを、氷酢酸5ml）で5分間。直径≥0.5ミリメートルとセカンダリサイトで腫瘍結節を定義し、転移として結節を決定します。 注：これにより腫瘍による気管支および細気管支閉塞に、腫瘍結節は15％、インドのインクを吸収できず、正常な肺組織は黒になり、腫瘍結節を白色7になります。これは、個々の腫瘍結節（ 図2B）の可視化を可能にします。 </li></ol>マウス胚からマウス胚線維芽細胞（MEFのを）準備3。 <ol><li>イソフルラン（99.9％）で妊娠マウスを犠牲にし、無菌環境を確保するために75％エタノールを噴霧。 </li><li>はさみで首に尿道口の領域から皮膚を開き、子宮から胚を単離します。 </li><li>肌を開くときに、胚を乱さないように注意してください。 </li><li>子宮角を除去し、冷STEでそれらをすすぎますPBS（pH7.4）で波立たせます。 </li><li>非常に慎重にその胎盤から胚を分離し、氷冷PBS（pHは7.4）を含む10センチメートルプレート内の場所の胚。 </li><li>胚から頭部、肝臓や腸を削除し、PBS（pHは7.4）を含む12ウェル組織培養プレートに残りの部分を配置します。 </li><li>トリプシンEDTAを含む別の12ウェルプレートに胚体を移し、滅菌カミソリの刃やはさみを使用して小片（〜1ミリメートル3）にカット。 37℃で5分間トリプシンEDTA 5mLで細断物質をインキュベートします。 </li><li>チョップ胚に1ミリリットルウシ胎児血清（FBS）を添加することによってトリプシンを不活性化します。遠心分離機10分間200×gでの速度で懸濁液、慎重に、上清を除去し、暖かいDMEM培地1mlでペレットを再懸濁し、20％FBSおよび2Xペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEMの10ミリリットルを（含む10 cmディッシュにすべての内容を転送）。 </li><li>二日間、毎日培地を変更します。文化所望の細胞までの細胞数が達成されます。 </li></ol>

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	<li>Minn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+lung.">Genes that mediate breast cancer metastasis to lung.</a> Natur. 436 (7050), 518-524 (2005).</li><li>Poste, G., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+cancer+metastasis.">The pathogenesis of cancer metastasis.</a> Natur. 283 (5743), 139-146 (1980).</li><li>Wan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Metastasis+Moving+New+Biological+Insights+into+the+Clinic.">Tumor Metastasis Moving New Biological Insights into the Clinic.</a> Nat Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).</li><li>Bergers, G., Benjamin, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumorigenesis+and+the+angiogenic+switch.">Tumorigenesis and the angiogenic switch.</a> Nat Rev Cancer. 3 (6), 401-410 (2003).</li><li>Frese, K. K., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+mouse+cancer+models.">Maximizing mouse cancer models.</a> Nat Rev Cancer. 7 (9), 654-658 (2007).</li><li>Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+mammary+tumors+by+expression+of+polyomavirus+middle+T+oncogene:+a+transgenic+mouse+model+for+metastatic+disease.">Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease.</a> Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).</li><li>Wexler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+Identification+of+Experimental+Pulmonary+Metastases.">Accurate Identification of Experimental Pulmonary Metastases.</a> J Natl Cancer Inst. 36 (4), 641-645 (1966).</li><li>Boczkowski, D., Nair, S. K., Nam, J. H., Lyerly, H. K., Gilboa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+tumor+immunity+and+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+using+dendritic+cells+transfected+with+messenger+RNA+amplified+from+tumor+cells.">Induction of tumor immunity and cytotoxic T lymphocyte responses using dendritic cells transfected with messenger RNA amplified from tumor cells.</a> Cancer Res. 60 (4), 1028-1034 (2000).</li><li>Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+breast+cancer:+one+size+does+not+fit+all.">Modelling breast cancer: one size does not fit all.</a> Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).</li><li>Watts, A. M., Kennedy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+Tumor+Foci+in+an+Experimental+Murine+Tumor+Model+Using+Computer-Assisted+Video+Imaging.">Quantitation of Tumor Foci in an Experimental Murine Tumor Model Using Computer-Assisted Video Imaging.</a> Anal Bioche. 256 (2), 217-219 (1998).</li><li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regression+of+Established+Pulmonary+Metastases+and+Subcutaneous+Tumor+Mediated+by+the+Systemic+Administration+of+High-Dose+Recombinant+Interleukin+2.">Regression of Established Pulmonary Metastases and Subcutaneous Tumor Mediated by the Systemic Administration of High-Dose Recombinant Interleukin 2.</a> J Exp Me. 161 (5), 1169-1188 (1985).</li><li>Fantozzi, A., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+breast+cancer+metastasis.">Mouse models of breast cancer metastasis.</a> Breast Cancer Re. 8 (4), 212 (2006).</li><li>Veer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+predicts+clinical+outcome+of+breast+cancer.">Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer.</a> Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).</li></ol>

著者は全く開示がありません。

このプロトコルは、新鮮なマウス腫瘍からの一次細胞を単離するためのものです。この方法から調製された溶解物は、タンパク質、DNA及びRNA分析のために有用です。原発性乳房腫瘍由来の癌細胞は、多くの場合、脳、肺および骨1に転移します。転移の検出のために肺を抽出する技術が含まれます。 図2Bに見られるようにインクの染みと肺を染色は腫瘍結節の可視化を可?...

Metastasis is the final step in the progression of breast cancer 1. It involves a series of steps in which malignant cells are released from the primary tumor and disseminated to other organs 2. The cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system 3. Each step in tumorigenesis is tightly controlled by cells through various genetic and epigenetic changes 4. To study the mechanisms of breast cancer tumorigenesis, mouse model systems have been utilized due to their short lifespan, small size and fast breeding time. Some major advantages of using mouse models in cancer research are the molecular and physiological similarities they share with humans 5. 
Established mouse and human cell lines have been used extensively in breast cancer research. Although we can obtain some information about the steps in metastasis using these cells, genetically manipulated animal models with tumor suppressors/oncogenes will give far more information about tumor development and metastasis starting from the embryonic stage. Thus, with these mouse models, we can obtain genetic and developmental regulation of tumor growth. Furthermore, the tumor microenvironment also plays an important role in tumor cell gene expression and it can be difficult to mimic the same scenario with studies using established cell lines. Primary human mammary tumors can also be used to study mouse mammary tumorigenesis. The main disadvantage of using isolated breast tumors is that this newly implanted tumor does not have the mouse&#8217;s vasculature and lymphatic tissue. Whereas the genetic mouse model systems for studying mammary tumorigenesis will allow us to monitor the steps of metastasis, analyze the tumor microenvironment, and access to the entire body 5.
The overall goal of this protocol is to study breast tumorigenesis in mice. It is known that breast cancers typically metastasize to the brain, lung and bone. This protocol allows for the isolation of primary mammary tumor cells, as well as, studying breast cancer metastasis to the lung. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life&#160; technologies</td>
			<td>25300-062</td>
			<td>Store at &#8211; 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td>Store at &#8211; 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3506</td>
			<td>Store at &#8211; 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Life&#160; technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Store at &#8211; 80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-fix</td>
			<td>ANATECH</td>
			<td>#174</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>India Ink</td>
			<td>Yasutomo</td>
			<td></td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AERRANE (Isoflurane)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>NDC 10019-773-60</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX0441-3</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary tumor and mef cell isolation to study lung metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

動物を犠牲にするで腫瘍の進行段階は、特定の研究とIACUCガイドラインに依存します。 図1（a）、マウス乳癌ウイルスポリオーマミドルT抗原（MMTV-PyMT）と100日齢のC57BL / 6マウスでは3ヶ月で屠殺しました。皮膚ははさみで首に尿道口の領域から開放し、皮膚は、図1（b）に示すような器官への容易なアクセスを可能にするために釘付けにしました。これは、 図1?...

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Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

原発腫瘍と肺転移を研究するためのMEF細胞の単離

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

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Medicine

15.7K ビュー.  Louisiana State University Health Sciences Center. The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.