Wir danken Herrn Roger Ackroyd, Herr Andrew Wyman und Herrn Chris Stoddard, Berater Chirurgen bei Sheffield Teaching Hospitals NHS Foundation Trust, für ihre Hilfe beim Erwerb der Speiseröhre Gewebeproben und ihre Unterstützung unserer Arbeit. Wir danken Ashraful Haque für seine Hilfe Einbeziehung Tumorzelllinien in das Modell. Wir bedanken uns für die finanzielle Unterstützung für diese Studie durch Zuschüsse aus dem Bardhan Research and Education Trust (BRET) und Yorkshire Cancer Research (YCR).

Menschlichen Ösophagus-Zellen von Patienten, die eine Magen-oder Speiseröhrenkrebs Chirurgie erhalten. Informierte Zustimmung erhalten wird für das Gewebe für Forschungszwecke verwendet werden, und das Gewebe anonym unter den entsprechenden ethischen Genehmigungen (SSREC 165/03, Human Research Tissue Bank Licence 12179) verwendet. 1. Isolierung von menschlichen Ösophagus-Epithelzellen <ol><li> Arbeiten in einer laminaren Strömung Gewebekulturhaube und mit einer sterilen Technik bereiten die epithelialen Kulturmedium durch Mischen von Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) und Ham-F12 in einem Verhältnis 3: 1 (v: v). Zugabe von 10% (v / v) FCS, 10 ng / ml epidermaler Wachstumsfaktor, 0,4 &amp; mgr; g / ml Hydrocortison, 1,8 x 10 -4 M Adenin, 5 ug / ml Insulin, 5 ug / ml Transferrin, 2 x 10 -7 M Triiodthyronin, 1 x 10 -10 M Choleratoxin, 2 x 10 -3 M Glutamin, 100 IU / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 0,625 &amp; mgr; g / ml Amphotericin B. </li><li> Verwendung von Standard-sterile Techniken setzen 11 ml DMEM, 10% FCS, 2 x 10 -3 M L-Glutamin, 100 IU / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 0,625 &amp; mgr; g / ml Amphotericin B in einen T75-Gewebekulturkolben. 1 x 10 6 letal bestrahlte Mäuse-3T3-Fibroblasten 12 in 1 ml des gleichen Mediums beimpft und über Nacht bei 37 ° C in einem 5% CO 2 befeuchteten Atmosphäre. Dies wird eine Feeder-Schicht für die nachfolgende Kultur von Epithelzellen zu produzieren. </li><li> Mit einem Skalpell und die Empfehlungen eines histopathologist, sezieren einen etwa 2 cm 2 Gewebeprobe aus dem krankheitsfreien Hintergrundbereich des Ösophagus-Plattenepithel-Schleimhaut von Patienten, die eine Magen-oder Speiseröhrenkrebs Chirurgie erhalten. Transport zum Labor in einem 50 ml-Behälter mit sterilem Transportmedium (PBS 100 IU / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 0,625 ug / ml Amphotericin B) bei Raumtemperatur. </li><li> Zu diesem Zeitpunkt speichert die Gewebe in der TransportMedium für bis zu 12 h (über Nacht) bei 4 ° C, für die Bequemlichkeit; aber verwenden Sie keine längere Lagerung, wie sie in reduzierter Zelllebensfähigkeit führen. </li><li> Arbeiten in einer laminaren Strömung Gewebekulturhaube und mit einer sterilen Technik sterilisieren einer Skalpellklinge durch Einweichen in 70% Ethanol für 5 min. Spülen in sterilem PBS. </li><li> Legen Sie das Gewebe in eine sterile Petrischale und verwenden Sie das Skalpell, um sie in 0,5 cm Streifen geschnitten. 5 ml von 0,1% (w / v) Trypsin in PBS zu der Petrischale, den Deckel auf der Schüssel und Inkubation für 1 h bei 37 ° C. </li><li> 5 ml FCS auf das Gewebe in der Petrischale, um das Trypsin zu hemmen. Halten des Streifens von Gewebe mit einer sterilen Pinzette vorsichtig abkratzen die Epitheloberfläche der Skalpellklinge für 1-2 min pro Streifen an den Epithelzellen in das umgebende Medium zu entfernen. Entfernen Sie das Gewebe abgeschabt und beiseite stellen. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Gewebestreifen. </li><li> Sammeln Sie das Medium der abgelösten Epithelzellen enthält, in ein 15 ml Zentrifugenröhrchenund zentrifugieren (5 min, 200 xg). Abgießen des Überstandes und Resuspendieren des Pellets in 12 ml epithelialen Medium (in Schritt 1.1 beschrieben). </li><li> Abgießen und verwerfen Sie das Medium aus dem Feeder-Zellschicht in der T75-Kolben in Schritt 1.2 vorbereitet. Eine sterile Pipette, um die Zellsuspension frisch isolierten Epithelzellen enthält, um den Kolben bei 37 ° C in einem 5% CO 2 befeuchteten Atmosphäre hinzu und inkubiert. </li><li> Nach 24 Stunden abgießen und verwerfen Sie das Kulturmedium, das auch Zelltrümmer enthalten wird, und ersetzen Sie sie durch 12 ml frisches Epithel-Medium. Weiter Inkubieren bei 37 ° C in einem 5% CO 2 befeuchteten Atmosphäre. Kolonien werden beginnen, in den nächsten 24 bis 48 Stunden angezeigt und können, indem die Kulturflasche unter einem Standardlichtmikroskop betrachtet werden. Gießen Sie das verbrauchte Kulturmedium und ersetzen mit dem gleichen Volumen an frischem Medium alle 2 bis 3 Tage. </li><li> Sobald der Kolben 80% Konfluenz, Durchgang die Zellen 13 erreicht hat. Teilen Sie die cells in einem Verhältnis von 1: 5 bis Zellzahlen zur Verwendung in dem Modell zu erhöhen. Folgen Sie Schritt 1,2 bis Feeder-Schichten von bestrahlten 3T3-Zellen in jedem Kolben werden die Epithelzellen 24 Stunden vor der Passage der Zellen empfangen werden zu etablieren. Hinweis: Verwenden Sie die Epithelzellen in der unten zwischen den Kanälen 1 und nur 4 beschrieben Ösophagus-Modell. </li></ol> 2. Isolierung von menschlichen Ösophagus-Fibroblasten <ol><li> Die Arbeit in einer Sterilbank und mit steriler Technik, nehmen Sie die Seite in Schritt 1.7 festgelegt Gewebe. Zeigen in eine sterile Petrischale und fein zu zerkleinern durch Zerhacken mit einem sterilen Skalpell. 10 ml von 0,5% (w / v) Kollagenase Eine Lösung und setzen Sie den Deckel auf die Petrischale und bei 37 ° C über Nacht in einem 5% CO 2, feuchten Atmosphäre. </li><li> Übertragen Sie die Digest in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge (10 min, 200 xg), sorgfältig abgießen und den Überstand verwerfen und das Pellet in 10 ml Fibroblastenkulturmedium (DMEM 10% FCS, 2 x 10 -3 M L-Glutamin, 100 IU / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 0,625 &amp; mgr; g / ml Amphotericin B). </li><li> Legen Sie die Suspension in eine T75-Flasche und bei 37 ° C in einem 5% CO 2, feuchten Atmosphäre. Nach 24 Stunden abgießen das Medium, die Trümmer enthalten wird, und ersetzen mit 12 ml frischem Fibroblasten-Medium. Ersetzen Sie das Kulturmedium alle 2 bis 3 Tage und Passage-Zellen, sobald sie 80% Konfluenz 13 erreicht haben, die Aufteilung der Zellen in einem 1: 5-Verhältnis zu Zellzahlen zu erhöhen. Hinweis: Verwenden Sie die Fibroblasten in der folgenden Durchgänge zwischen 4 und 10 beschriebenen Modells. </li></ol> 3. Herstellung der De-cellularized Esophageal Scaffold <ol><li> Erhalten intakte Schweine esophagi im Schlachthof von frisch geschlachteten Landrasse, die für die Nahrungsmittelproduktion verwendet werden. Eine einzige Speiseröhre ausreichend Gerüste für etwa 30 separaten Konstrukte bereitzustellen. Hinweis: Aufgrund der umfangreichen und zeit Consuming Sterilisationsprotokoll erforderlich ist, ist es in der Regel lohnt Beschaffung und Verarbeitung von mindestens 10 esophagi auf einmal. </li><li> Sofort platzieren Sie den frisch ausgeschnittenen Speiseröhre in einem 180 ml sterilen Topf mit etwa 150 ml 10% Povidon-Iod-Lösung für 5 Minuten, um jede verunreinigende mikrobielle Belastung zu reduzieren. Übertragen die Speiseröhre zu einem zweiten Topf mit etwa 100 ml sterilem PBS, das 200 IU / ml Penicillin, 200 ug / ml Streptomycin und 1,25 ug / ml Amphotericin B. <ol><li> Setzen Sie den Deckel auf den Behälter und den Transport der esophagi zurück an das Labor bei Raumtemperatur. Zwei oder drei esophagi kann in jedem Behälter transportiert werden, abhängig von ihrer Größe. </li></ol></li><li> Einmal im Labor, behandeln Sie das Gewebe in einer Sterilbank unter aseptischen Bedingungen, um eine mikrobielle Kontamination zu minimieren. Sterilisieren Pinzette, Schere und Skalpellklingen durch Einweichen für 5 Minuten in 70% Ethanol, und Spülen in sterilem PBS. </li><li> Behandeln Sie die esophagus mit sterilen Pinzette. Mit der Schere, aufgeschnitten die Speiseröhre in Längsrichtung. Spülen Sie das Gewebe, indem der Speiseröhre in einem 180 ml sterilen Topf mit ca. 100 ml sterilem PBS und leichtes Schütteln, um alle Fremdkörper zu entfernen. </li><li> Einen Korken Dissektion Bord Reinigen Sie durch Besprühen zügig mit 70% Ethanol und trocknen lassen. </li><li> Entfernen Sie die Speiseröhre aus dem PBS und mit sterilen Nadeln, Stift aus der Speiseröhre in den Vorstand, Schleimhautoberfläche nach oben. Fassen Sie die Schleimhautoberfläche an einem Ende der Speiseröhre mit einer sterilen Pinzette und ziehen weg vom Brett. Dadurch wird die von der darunterliegenden Schleimhaut Submukosa trennen. <ol><li> Verwenden Sie dann eine sterile Skalpellklinge, um die Speiseröhre in Längsrichtung entlang der Lamina propria sezieren, Entfernen Pins als die Dissektion fortschreitet, damit die Schleimhaut weg angehoben werden. </li></ol></li><li> Bewahren Sie die seziert Schleimhaut und entsorgen Sie die zugrunde liegenden Submukosa. </li><li> Abgeschnitten und entsorgen Sie die meisten proximalen und distalen 2 cm von ter Schleimhaut, da es eine größere Anzahl von submukösen Drüsen und eine dickere Lamina propria in jenen Bereichen, die jeweils 7. </li><li> Verwenden Sie ein Skalpell, um die verbleibende Gewebe in 5 cm 2 geschnitten. Zeigen alle geschnittenen Gewebes in einen 180 ml sterile Topf mit ca. 150 ml sterilem PBS und leicht bewegen, um das Gewebe zu spülen. Wenn die Verarbeitung mehr als fünf esophagi zu einem Zeitpunkt kann es notwendig sein, mehrere Töpfe zu diesem und den drei darauffolgenden Schritten verwendet werden. </li><li> Verwendung steriler Pinzetten, übertragen die geschnittenen Gewebes in eine 180 ml Dose, enthaltend 150 ml sterile 1 M NaCl, 200 IE / ml Penicillin, 200 ug / ml Streptomycin und 1,25 ug / ml Amphotericin B. Inkubieren für 72 Stunden bei 37 ° C. </li><li> Legen Sie das Gewebe in eine frische 180 ml Topf mit 150 ml sterilem PBS. Das Epithel wird damit begonnen, sichtbar von dem darunterliegenden Gewebe zu trennen. Ziehen Sie leicht das Ablösen Epithel vom Schwein Speiseröhre mit einer sterilen Pinzette und entsorgen. <ol><li> Legen Sie die verbleibenden tAusgabe in eine frische 180 ml Topf und fügen Sie 150 ml sterile PBS. Leicht bewegen 5 Minuten zu waschen. Gießen Sie das PBS und wiederholen Sie noch zweimal mit frischem PBS. </li></ol></li><li> Stelle die ganze Gewebe in einem 500 ml-Glasflasche mit 400 ml sterilem 80% (v / v) Glycerinlösung 24 Stunden bei Raumtemperatur. Übertragen, um 400 ml sterile 90% (v / v) Glycerinlösung für weitere 24 Stunden. </li><li> Speichern in 400 ml sterilem 100% Glycerinlösung bei Raumtemperatur für mindestens 4 Monate zu dehydratisieren und zu sterilisieren, das Gewebe, während die Integrität der Basalmembran. </li></ol> 4. Herstellung von Kulturmedien <ol><li> Vorbereitung chelatisierten Serum von neugeborenen Kälbern zur Verwendung in dem Kulturmedium. <ol><li> Gießen Sie 100 g Chelex 100 in ein Glas 1-l-Flasche und fügen entionisiertem Wasser. Das genaue Volumen ist nicht kritisch, aber ausreichend Wasser nachgefüllt, um das Chelex Pulver abzudecken. Hinzufügen eines Magnetrührer und Sterilisieren durch Autoklavieren (121 ° C,15 min). </li><li> Lassen Sie die Flasche zu kühlen und die Chelex zu begleichen. In einer Sterilbank Gießen Sie das überschüssige Wasser, fügen Sie 500 ml Serum von neugeborenen Kälbern (NCS) und lassen Sie es über Nacht bei 4 ° C zu rühren. </li><li> Stoppen Rühren und lassen Sie das Chelex zu regeln, dies kann bis zu 30 Minuten dauern. In einer Sterilbank dekantiert die Chelat-Serum mit einer sterilen Pipette, kümmert sich nicht um die Chelex, und speichern Sie in 10 ml Aliquots bei -20 ° C zu stören. </li></ol></li><li> Bereiten Sie drei verschiedenen Medien in einer Sterilbank, beginnend mit pro-proliferative und endend mit pro-differenzierenden Formulierungen. <ol><li> Vorbereitung Verbundmedium I besteht aus DMEM und Hams F12 in einem 3: 1-Verhältnis (V: V), 4 x 10 -3 M L-Glutamin, 0,5 ug / ml Hydrocortison, 1 x 10 -4 M O -phosphorylethanolamine, 2 x 10 -12 M Trijodthyronin, 1,8 x 10 -4 M Adenin, 1,88 x 10 -3 M CaCl 2, 4 x 10 -12 M Progesteron, 10 &amp; mgr; g / ml insulin, 10 ug / ml Transferrin, 10 ng / ml Selen, 1 x 10 -3 M Ethanolamin und 0,1% (v / v) NCS chelatisiert. </li><li> Bereiten Sie Composite-Medium II als Verbundmedium I außer ersetzen Chelat-Serum mit 0,1% (v / v) Nicht-Chelat-NCS. </li><li> Bereiten Verbundmedium III als Composite-Medium II außer omit Progesteron und Erhöhung Serum bis 2% (v / v) nicht-chelatisierten NCS. </li></ol></li></ol> 5. Produktion des Menschen Ösophagusmukosa Modell <ol><li> Alle Arbeiten in einer Steril, unter aseptischen Bedingungen, um eine sterile Umgebung aufrechtzuerhalten. Sterilisieren aller Werkzeuge durch Einweichen in 70% Ethanol für 5 min vor dem Spülen in sterilem PBS. </li><li> Der Tag, bevor es erforderlich ist, rehydrieren die azellulären Schweinespeiseröhren Schafott. Einen Gerüstteil, erforderlich für jedes Konstrukt hergestellt werden. <ol><li> Um das Gewebe ausreichend Platz Stücke von Schweine-Gerüst in einen Topf mit 100 ml sterilem PBS rehydrieren, zu agitieren und genießen für 10 min. DecaNT Die PBS und Ersetzen mit frischem PBS. Wiederholung des Waschprozesses fünfmal, um die Entfernung aller Spuren Glycerin gewährleisten. </li></ol></li><li> Testen Sie das Gerüst Sterilität durch Inkubation des rehydratisierten Gewebe über Nacht in 100 ml DMEM bei 37 ° C. Wenn es keine Änderung in der Farbe oder die Trübung des Kulturmediums am Ende des Inkubationszeitraums das Gerüst wird angenommen steril sein. Sobald Sterilität bestätigt wurde, legen Sie die 5 cm 2 acellular Gerüst in eine 6-Well-Platte, submuköse Seite nach oben. </li><li> Legen Sie eine sterile medizinischem Edelstahl Ring (Innendurchmesser 10 mm, Außendurchmesser 20 mm) auf die Mitte jedes Gerüst und drücken Sie leicht mit Hilfe einer sterilen Pinzette, um eine ausreichende Abdichtung mit dem Gewebe zu gewährleisten. </li><li> Ernte der Fibroblasten unter Verwendung von Trypsin-EDTA-13, um eine Zellsuspension herzustellen. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer 14. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension (10 min, 200 xg). Zellpellet in eine? Fallte Volumen Fibroblastenmedium, um eine endgültige Zellzahl von 2,5 x 10 6 Zellen pro ml herzustellen. </li><li> In 0,2 ml Fibroblasten-Medium, enthaltend 5 x 10 5 menschliche Speiseröhre Fibroblasten, in jedem Ring. Schwemmen das Gebiet um die Außenseite des Rings mit etwa 2 ml Fibroblastenmedium. Inkubieren bei 37 ° C in einem 5% CO 2 befeuchteten Atmosphäre. </li><li> Nach 24 Stunden entfernen Sie die Ringe und Fibroblasten-Medium und in jede Vertiefung hinzufügen mindestens 5 ml frisches Medium Fibroblasten, sicherzustellen, dass das Gerüst vollständig in Medium eingetaucht. Kultur für 1 Woche, bei 37 ° C in einem 5% CO 2, feuchten Atmosphäre Ersetzen des Mediums alle 2 bis 3 Tage. </li><li> Nach 1 Woche entfernen Sie die 6-Well-Platten, die die Gerüste zu einer laminaren Flut Haube, entfernen Sie das Medium invertieren und jedes Gerüst mit einer sterilen Pinzette, indem die Schleimhautoberfläche nach oben. Dieser Zeitpunkt wird als Tag 0 bezeichnet. </li><li> Zeigen die Stahlringe auf der Schleimhautoberfläche in der Mittedas Gewebe, wie in Schritt 5.4. </li><li> Bereiten Sie die T75-Kolben von Epithelzellen für Trypsinierung 13. Nachdem das PBS waschen und vor der Zugabe von Trypsin-EDTA-Lösung, 2 ml steriler 0,02% (w / v) EDTA-Lösung zu jedem Kolben. Inkubieren für 2 min bei 37 ° C. Tippen Sie auf den Kolben vorsichtig, um selektiv trennen Sie die i3T3 Feeder-Schicht, während die Epithelzellen gebunden. Hinweis: Es ist in der Regel nicht sinnvoll oder notwendig zu Patient entsprechen den Epithelzellen an die Fibroblasten in der vergangenen Woche bereits in das Modell integriert. </li><li> Gießen Sie das EDTA Lösung, die die Feeder-Schicht und fügen Trypsin-EDTA-Lösung, um die Epithelzellen 13 ernten. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer 14. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension (10 min, 200 xg). Zellpellet in einem geeigneten Volumen des Verbund Medium 1, um eine endgültige Zellzahl von 5 x 10 6 Zellen pro ml herzustellen. </li><li> In 0,2 ml Verbundmedium I, mit 1 x 10 6 Epithelzellen, innerhalb des Rings. Schwemmen das Gebiet um die Außenseite des Rings mit etwa 2 ml Verbundmedium I und legen Sie die Konstrukte in den Brutschrank bei 37 ° C in einem 5% CO 2, feuchten Atmosphäre. </li><li> Nach 24 Stunden (Tag 1) entfernen Sie die Ringe und Mittel und fügen Sie mindestens 5 ml frisches Medium Composite-I, die Gewährleistung der Gerüste sind vollständig untergetaucht und zurück in den Inkubator. Nach weiteren 24 Stunden (Tag 2) entfernen Sie das Medium und mindestens 5 ml Composite-Medium II ersetzt, wodurch ebenfalls die Gerüste sind vollständig untergetaucht und zurück in den Inkubator. </li><li> Am Tag 4 Ort sterile medizinischem Edelstahl Maschengitter (2 cm breit x 2 cm lang x 0,5 cm hoch), an die frische 6-Well-Platten, eine pro Konstrukt. Verwenden Sie sterile Pinzette, um die Konstrukte auf der Oberseite des Stahlgitter, Schleimhautoberfläche obersten übertragen. <ol><li> Gebe ausreichend Verbundmedium III so daß die Flüssigkeit die Unterseite der zusammengesetzten erreicht, allerdings ist die Oberflächeder Luft ausgesetzt wird, ist sichergestellt, daß die Probe bei einer Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche aufrechterhalten wird. Die genaue Menge an Prüfmedium benötigt, abhängig von der Dicke der Gerüst, das Volumen der Vertiefung und der genauen Höhe der Edelstahlgitter variieren. </li></ol></li><li> Aufrechterhaltung der Verbundstoffe in einem Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle für zwischen 10 und 20 Tagen (Tag 14 bis Tag 24), abhängig von den Anforderungen des Experiments. Ersetzen Sie den Composite-Medium III mit frischem Medium alle 2 bis 3 Tagen (Montag, Mittwoch, Freitag ist ein benutzerfreundliches Regime). Hinweis: Nach 5 Tagen bei einer Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche (Tag 9) die Konstrukte eine ausreichend reifen Ösophagusepithel in Experimenten der Auswirkungen von Umweltfaktoren auf die Ösophagusepithel verwendet werden. </li><li> Am Ende des Experiments, fixieren die Konstrukte für die histologische Analyse und immunhistochemische Färbung 7 oder Protein-Extrakt 15 oder RNA 11,16 aus dem Epithel für weitere Analytikist. Falls erforderlich, behalten die konditionierten Kulturmedium für die Analyse von extrazellulären Signalmolekülen 17. </li></ol>

<ol>
	<li>Pera, M., Manterola, C., Vidal, O., Grande, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+esophageal+adenocarcinoma.">Epidemiology of esophageal adenocarcinoma.</a> J. Surg. Oncol. 92 (3), 151-159 (2005).</li><li>Manea, G. S., Lupusoru, C., Caruntu, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+study+on+the+effect+of+bile,+and+bile+and+hydrochloric+acid+mixture+on+the+esophageal+mucosa.">Experimental study on the effect of bile, and bile and hydrochloric acid mixture on the esophageal mucosa.</a> Rom. J. Morphol. Embryol. 50 (1), 61-66 (2009).</li><li>Andl, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+mediates+increased+cell+proliferation,+migration,+and+aggregation+in+esophageal+keratinocytes+in+vitro+and+in+vivo.">Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo.</a> J. Biol. Chem. 278 (3), 1824-1830 (2003).</li><li>Underwood, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+primary+oesophageal+squamous+epithelial+cells+with+HET-1A+in+organotypic+culture.">A comparison of primary oesophageal squamous epithelial cells with HET-1A in organotypic culture.</a> Biol. Cell. 102 (12), 635-644 (2010).</li><li>Nystrom, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture.">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> J. Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).</li><li>Okawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+interplay+between+EGFR+overexpression,+hTERT+activation,+and+p53+mutation+in+esophageal+epithelial+cells+with+activation+of+stromal+fibroblasts+induces+tumor+development,+invasion,+and+differentiation.">The functional interplay between EGFR overexpression, hTERT activation, and p53 mutation in esophageal epithelial cells with activation of stromal fibroblasts induces tumor development, invasion, and differentiation.</a> Genes &amp; Development. 21 (21), 2788-2803 (2007).</li><li>Green, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+characterization+of+an+organotypic+tissue-engineered+human+esophageal+mucosal+model.">The development and characterization of an organotypic tissue-engineered human esophageal mucosal model.</a> Tissue Eng Part A. 16 (3), 1053-1064 (2010).</li><li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+induces+immortalization+of+human+esophageal+keratinocytes+without+p16INK4a+inactivation.">Telomerase induces immortalization of human esophageal keratinocytes without p16INK4a inactivation.</a> Mol. Cancer Res. 1 (10), 729-738 (2003).</li><li>Bhargava, S., Chapple, C. R., Bullock, A. J., Layton, C., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+buccal+mucosa+for+substitution+urethroplasty.">Tissue-engineered buccal mucosa for substitution urethroplasty.</a> BJU. Int. 93 (6), 807-811 (2004).</li><li>Ralston, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocytes+contract+human+dermal+extracellular+matrix+and+reduce+soluble+fibronectin+production+by+fibroblasts+in+a+skin+composite+model.">Keratinocytes contract human dermal extracellular matrix and reduce soluble fibronectin production by fibroblasts in a skin composite model.</a> Br. J. Plast. Surg. 50 (6), 408-415 (1997).</li><li>Green, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsatile+exposure+to+simulated+reflux+leads+to+changes+in+gene+expression+in+a+3D+model+of+oesophageal+mucosa.">Pulsatile exposure to simulated reflux leads to changes in gene expression in a 3D model of oesophageal mucosa.</a> Int. J. Exp. Pathol. 95 (3), 216-228 (2014).</li><li>Wang, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+culture+of+epithelial+cells+from+primary+breast+carcinomas+using+irradiated+3T3+cells+as+feeder+layer.">Selective culture of epithelial cells from primary breast carcinomas using irradiated 3T3 cells as feeder layer.</a> Pathol. Res. Pract. 197 (3), 175-181 (2001).</li><li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsinizing+and+subculturing+mammalian+cells.">Trypsinizing and subculturing mammalian cells.</a> J. Vis. Exp. (16), e755 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+Hemacytometer+to+Count+Cells.">Using a Hemacytometer to Count Cells.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2014).</li><li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory,+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> N. Am. J. Med. Sci. 4 (9), 429-434 (2012).</li><li>Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Northern+blot+analysis+for+detection+and+quantification+of+RNA+in+pancreatic+cancer+cells+and+tissues.">Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues.</a> Nat. Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).</li><li>Morgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometric+bead+array:+a+multiplexed+assay+platform+with+applications+in+various+areas+of+biology.">Cytometric bead array: a multiplexed assay platform with applications in various areas of biology.</a> Clin. Immunol. 110 (3), 252-266 (2004).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+abnormal+expression+of+retinoic+acid+receptor-beta,+p+53+and+Ki67+protein+in+normal,+premalignant+and+malignant+esophageal+tissues.">The abnormal expression of retinoic acid receptor-beta, p 53 and Ki67 protein in normal, premalignant and malignant esophageal tissues.</a> World J. Gastroenterol. 8 (2), 200-202 (2002).</li><li>Moll, R., Divo, M., Langbein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+keratins:+biology+and+pathology.">The human keratins: biology and pathology.</a> Histochem. Cell Biol. 129 (6), 705-733 (2008).</li><li>Rice, R. H., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+in+human+epidermal+cells+of+a+soluble+protein+precursor+of+the+cross-linked+envelope:+activation+of+the+cross-linking+by+calcium+ions.">Presence in human epidermal cells of a soluble protein precursor of the cross-linked envelope: activation of the cross-linking by calcium ions.</a> Cell. 18 (3), 681-694 (1979).</li><li>Eves, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+invasion+in+reconstructed+human+skin+is+influenced+by+skin+cells+-+investigation+of+the+role+of+proteolytic+enzymes.">Melanoma invasion in reconstructed human skin is influenced by skin cells - investigation of the role of proteolytic enzymes.</a> Clin. Exp. Metastasis. 20 (8), 685-700 (2003).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Diese Handschrift beschreibt die Herstellung und Charakterisierung einer biologisch relevanten menschlichen Ösophagus-Schleimhaut-Modell geeignet für den Einsatz als experimentelle Plattform, um die Auswirkungen der Exposition gegenüber belastenden Umweltfaktoren auf die Ösophagusepithel studieren. Die wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Produktion eines menschlichen Schleimhaut der Speiseröhre Modells sind: Sicherstellung, dass die Mehrheit der Epithelzellen bleibt proliferative...

Die Schleimhaut der Speiseröhre besteht aus einem geschichteten, Plattenepithel über einer Schicht von Bindegewebe, der Lamina propria, und ist eine der ersten Websites, um aufgenommen belastenden Umweltfaktoren zu begegnen. Die Exposition gegenüber Nahrungsgifte ist in der Entwicklung von Ösophagus-Plattenepithel-Karzinom in Verbindung gebracht, während duodenogastro-Reflux ist ein kritischer Faktor in der Pathogenese von Barrett-Metaplasie, die mit einem erhöhten Risiko der Progression zu einem Adenokarzinom der Speiseröhre verbunden ist. Ösophagus-Karzinome sind die häufigste bösartige Tumor 8. in UK Männchen und Adenokarzinom des Ösophagus ist schnell in der westlichen Welt 1 erhöht. Weiterhin hat es eine geringe Verbesserung der Krankheitsprognose mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von etwa 15%. Folglich gibt es einen Bedarf für experimentelle Plattformen um die Auswirkungen der Exposition gegenüber Umweltbelastungen in diesem ösophagealem Epithel und deren mögliche Beteiligung an der develo untersuchenpment der Metaplasie oder Neoplasien. Obwohl immortalisierte oder Tumorzelllinien können die Forscher die Reaktion der Epithelzellen auf diese Stressfaktoren in vitro zu studieren, bleiben sie proliferative und scheitern in den reifen Epithelzellen auf den obersten Schichten der Schleimhaut der Speiseröhre gefunden zu unterscheiden. Ferner kann Zellinien, die bereits unterzogen worden sind Tumorigenese nur begrenzte Informationen über die ursprünglichen Antworten von normalen Zellen im Epithel von Umweltfaktoren zu liefern; und dies ist die Phase, wenn das Potential für die therapeutische Intervention kann höchsten sind. Schließlich herkömmlichen Zellkultursystemen nicht den potentiell wichtigen Wechselwirkungen zwischen epithelialen und mesenchymalen Zellen und zwischen diesen Zellen und der umgebenden Matrix, die in Geweben in vivo auftreten, zu erfassen. Tiermodelle bieten ein realistischeres Mikroumgebung für die Untersuchung der Reaktionen des Ösophagus epithelium und kann die künstliche Induktion von Magen-Reflux-Krankheit 2 zu integrieren. Allerdings kann es schwieriger, um die belastenden Umweltfaktoren in diesen Modellen zu manipulieren und sie können nicht vollständig repräsentativ ist die Reaktion innerhalb des menschlichen Speiseröhre. Andere experimentelle menschlichen Ösophagus Modelle entwickelt worden, die Primärzellen, immortalisierte Zellen oder Tumorzelllinien auf einem Kollagen zu verwenden, oder in Kombination Collagen / Matrigel, Gerüst Fibroblasten enthaltende 3,4. Es ist weniger arbeitsaufwendig, diese Gerüste als die in diesem Manuskript beschrieben azellulären Speiseröhren Gerüst zu erzeugen und diese organotypischen Modelle ein nützliches Mittel, insbesondere bei der Untersuchung von Tumorinvasion 5,6, bei Tumorzellinfiltration in das Kollagengel kann leicht sein, beobachtet. Aber diese Kollagen-Gele besitzen nicht-native mechanischen Eigenschaften und fehlen bestimmte Eigenschaften des ursprünglichen Gewebes, einschließlich einer spezifischen Basalmembran und der appropriate Oberflächentopographie. Dies kann das Verhalten der Zellen, was zu beeinflussen, beispielsweise, eine schlechtere Haftung zwischen dem Epithel und Gerüst bei Verwendung eines Kollagengels Gerüst 7. Als Folge der azellulären Schweinespeiseröhren Gerüst entwickelt, mit dem Vorteil, dass eine biologisch-realistische Gerüst und zur Verwendung als experimentelle Plattform somit besser geeignet. Es wurde auch gezeigt, dass es besser ist, Primärzellen in die Speiseröhre Konstrukte als immortalisierte Speiseröhre epithelialen Zellinien, wie Het-1A integrieren, da diese Zellen bilden einen mehrschichtigen Epithels aber nicht zu schichten oder zu differenzieren 4,7,8 . Daher hat dieses Protokoll von einer Methode bereits in der MacNeil Labor zur Herstellung von Tissue Engineering Haut und Mundschleimhaut 9,10 angepasst worden und verfügt über eine de-cellularized Schweine Ösophagus-Gerüst verbunden mit primären humanen Ösophagus-Epithelzellen und Fibroblasten. This Protokoll erzeugt eine ausgereifte, geschichteten Epithel, ähnlich zu derjenigen des normalen menschlichen Speiseröhre durch CK4, CK14, Ki67 und Involucrin Färbung nachgewiesen. Das resultierende Modell stellt eine experimentelle Plattform um Reaktionen auf Umweltstressfaktoren zu untersuchen, und wurde effektiv in Reaktion auf die Veränderung der Genexpression in Ösophagusepithel untersuchen, um Bauteile 11 refluxate.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td align="right">215240</td>
			<td>Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilise. Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Labtech</td>
			<td>LM-D1112</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12</td>
			<td>Labtech</td>
			<td>LM-H1236</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Calf Serum</td>
			<td>Labtech</td>
			<td>FB-1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>R+D Systems</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td>Prepare 200 &#181;g/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydorcortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0396</td>
			<td>Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2786</td>
			<td>Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2767</td>
			<td>Prepare 10 mg/ml solution in 0.01M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2036</td>
			<td>Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2752</td>
			<td>Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8052</td>
			<td>Prepare stock solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>Brand name Fungizone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>BR0014</td>
			<td>Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilise</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">10103578001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine solution</td>
			<td>Ecolab</td>
			<td>10830E</td>
			<td>Brand name Videne</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">433209</td>
			<td>Prepare 1M solution and autoclave to sterilise before use (121 &#730;C for 15 min)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td>Autoclave to sterilise before use (121 &#730;C for 15 min)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn calf serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">26010074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8783</td>
			<td>Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9508</td>
			<td>Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td>Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-phosphorylethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0503</td>
			<td>Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS (insulin, transferrin, selenium)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-838Z</td>
			<td>Used for composite media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3924</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.02% solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 culture flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td align="right">11819650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml universal tube</td>
			<td>SLS</td>
			<td>SLS7504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>180 ml pot</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-2603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>SLS</td>
			<td align="right">150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stainless steel rings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Manufactured in house - medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>steel mesh grids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Manufactured in house - sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2cm (w) x2 cm (d) x 0.5 cm (h)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ki67</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>KI67-MM1-L-CE</td>
			<td>Clone MM1 Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9004</td>
			<td>Clone 6B10 Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK14</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>LL002-L-CE</td>
			<td>Clone LL002 Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Involucrin</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>INV</td>
			<td>Clone&#160; SY5 Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OE21</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">96062201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OE33</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">96070808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Het-1A</td>
			<td>ATCC-LGC</td>
			<td>CRL-2692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse 3T3 fibroblasts</td>
			<td>ATCC-LGC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td>previously growth arrested by irradiation (60 Gy)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, characterization and potential uses of a 3d tissue-engineered human esophageal mucosal model

Die Inzidenz von beiden Adenokarzinom des Ösophagus und seine Vorläufer, Barrett-Metaplasie, steigen schnell in der westlichen Welt. Darüber Adenokarzinom des Ösophagus hat in der Regel eine schlechte Prognose, mit wenig Verbesserung der Überlebensraten in den letzten Jahren. Dies sind schwierigen Bedingungen zu untersuchen, und es wurde ein Mangel an geeigneten Versuchsplattformen Störungen der Schleimhaut der Speiseröhre zu untersuchen. Ein Modell der menschlichen Schleimhaut der Speiseröhre in der MacNeil Labor, welches im Gegensatz zu herkömmlichen 2D-Zellkultursystemen, fasst die Zell-Zell- und Zell-Matrix-Wechselwirkungen in vivo vorhanden ist und erzeugt ein reifes, geschichteten Epithel ähnlich der der normalen menschlichen entwickelt Ösophagus. Kurz gesagt, verwendet das Modell nicht transformierten normalen primären humanen Ösophagus-Fibroblasten und Epithelzellen innerhalb eines Schweine-abgeleiteten acellular Ösophagus-Gerüst gezüchtet. Immunhistochemische Charakterisierung dieses Modellvon CK4, CK14, Ki67 und Involucrin Färbung zeigt entsprechende Wiederholung der Histologie des normalen menschlichen Schleimhaut der Speiseröhre. Dieses Modell bietet eine robuste, biologisch relevanten experimentellen Modell der menschlichen Schleimhaut der Speiseröhre. Es kann leicht verändert werden, um eine Reihe von Forschungsfragen auch auf die Wirksamkeit von pharmakologischen Mitteln und die Auswirkungen der Einwirkung von Umweltfaktoren wie beispielsweise Alkohol, Toxine, hoher Temperatur oder gastroösophagealen refluxate Komponenten zu untersuchen. Das Modell erleichtert auch mit herkömmlichen 2D-Zellkultur, so dass unter anderem erreichbare erweiterte Kulturperioden, die Studie über die Auswirkungen einer wiederholten Exposition eines reifen Epithel an den Agenten von Interesse für die bis zu 20 Tage. Ferner ist eine Vielzahl von Zelllinien, wie die von Speiseröhrentumoren oder Barrett-Metaplasie abgeleitet können in das Modell eingearbeitet, um Prozesse wie Tumorinvasion und Drogen responsivene untersuchenss in einer biologisch relevanten Umfeld.

Diese Handschrift beschreibt den Prozess erforderlich ist, in schematischer Form in 1 dargestellt ist, die Kultur von 3D-Modellen des menschlichen Ösophagusepithel erfolgreich. Um die Eignung des Modells bestätigen, als Experimentierplattform histologischen und immunhistochemischen Untersuchungen wurden unternommen, den Vergleich der kultivierten Geweben mit normalen menschlichen Ösophagus-Schleimhaut. Histologische Beurteilung der nach dem beschriebenen Verfahren hergest...

Watch this Scientific Journal Video about Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model at JoVE.com

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Diese Handschrift beschreibt die Herstellung, Charakterisierung und Anwendungsmöglichkeiten eines mittels Tissue Engineering 3D-Ösophagus-Konstrukt von normalen primären humanen Ösophagus-Fibroblasten und Plattenepithelzellen in einem de-cellularized Schweine Gerüst ausgesät vorbereitet. Die Ergebnisse zeigen die Bildung eines reifen geschichteten Epithel ähnlich dem normalen menschlichen Speiseröhre.

Herstellung, Charakterisierung und Einsatzmöglichkeiten von 3D-Tissue-Engineering Menschen Ösophagus-Schleimhaut-Modell

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

production-characterization-potential-uses-3d-tissue-engineered-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.4K Aufrufe.  University of Sheffield.  Diese Handschrift beschreibt die Herstellung, Charakterisierung und Anwendungsmöglichkeiten eines mittels Tissue Engineering 3D-Ösophagus-Konstrukt von normalen primären humanen Ösophagus-Fibroblasten und Plattenepithelzellen in einem de-cellularized Schweine Gerüst ausgesät vorbereitet. Die Ergebnisse zeigen die Bildung eines reifen geschichteten Epithel ähnlich dem normalen menschlichen Speiseröhre. 

Serie: Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of tri-leaflet polymer valve prostheses. However, identification of a protocol for initial assessment of polymer valve hydrodynamic functionality is paramount during the early stages of the design process. Traditional in vitro pulse duplicator systems are not configured to accommodate flexible tri-leaflet materials; in addition, assessment of polymer valve functionality needs to be made in a relative context to native and prosthetic heart valves under identical test conditions so that variability in measurements from different instruments can be avoided. Accordingly, we conducted hydrodynamic assessment of i) native (n = 4, mean diameter, D = 20 mm), ii) bi-leaflet mechanical (n= 2, D = 23 mm) and iii) polymer valves (n = 5, D = 22 mm) via the use of a commercially available pulse duplicator system (ViVitro Labs Inc, Victoria, BC) that was modified to accommodate tri-leaflet valve geometries. Tri-leaflet silicone valves developed at the University of Florida comprised the polymer valve group. A mixture in the ratio of 35:65 glycerin to water was used to mimic blood physical properties. Instantaneous flow rate was measured at the interface of the left ventricle and aortic units while pressure was recorded at the ventricular and aortic positions. Bi-leaflet and native valve data from the literature was used to validate flow and pressure readings. The following hydrodynamic metrics were reported: forward flow pressure drop, aortic root mean square forward flow rate, aortic closing, leakage&#160;and regurgitant volume, transaortic closing, leakage, and total energy losses. Representative results indicated that hydrodynamic metrics from the three valve groups could be successfully obtained by incorporating a custom-built assembly into a commercially available pulse duplicator system and subsequently, objectively compared to provide insights on functional aspects of polymer valve design.

There has been renewed interest in developing polymer valves. Here, the objectives are to demonstrate the feasibility of modifying a commercial pulse duplicator to accommodate tri-leaflet geometries and to define a protocol to present polymer valve hydrodynamic data in comparison to native and prosthetic valve data collected under near-identical conditions.

Protokoll für Relative Hydrodynamische Beurteilung der Tri-Polymer Merkblatt Ventile

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Forschung

Biotechnik

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

Generierung und Pfropfen von Tissue Engineering Gefäße in einem Maus-Modell

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is limited to cell proliferation and gene expression endpoints. However, in the organism, mammary morphogenesis occurs in a 3D environment. 3D culture systems help bridge the gap between monolayer cell culture (2D) and the complexity of the organism. Herein, we describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action. It uses the commercially available hormone-responsive human breast epithelial cell line, T47D, and rat tail collagen type 1 as a matrix. This 3D culture model responds to the main mammotropic hormones: estradiol, progestins and prolactin. The influence of these hormones on epithelial morphogenesis can be observed after 1- or 2-week treatment according to the endpoint. The 3D cultures can be harvested for analysis of epithelial morphogenesis, cell proliferation and gene expression.

We describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action.

Ein Hormon ansprechenden 3D-Kultur Modell des menschlichen Brustdrüse Epithel

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific mutational background. The model is generated on a decellularized porcine scaffold that reproduces tissue-specific characteristics regarding extracellular matrix composition and architecture including the basement membrane. We standardized a protocol that allows artificial tumor tissue generation within 14 days including three days of drug treatment. Our article provides several detailed descriptions of 3D read-out screening techniques like the determination of the proliferation index Ki67 staining&#39;s, apoptosis from supernatants by M30-ELISA and assessment of epithelial to mesenchymal transition (EMT), which are helpful tools for evaluating the effectiveness of therapeutic compounds. We could show compared to 2D culture a reduction of proliferation in our 3D tumor model that is related to the clinical situation. Despite of this lower proliferation, the model predicted EGFR-targeted drug responses correctly according to the biomarker status as shown by comparison of the lung carcinoma cell lines HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) and A549 (EGFR wild-type, KRAS-mutated) treated with the tyrosine-kinase inhibitor (TKI) gefitinib. To investigate drug responses of more advanced tumor cells, we induced EMT by long-term treatment with TGF-beta-1 as assessed by vimentin/pan-cytokeratin immunofluorescence staining. A flow-bioreactor was employed to adjust culture to physiological conditions, which improved tissue generation. Furthermore, we show the integration of drug responses upon gefitinib treatment or TGF-beta-1 stimulation - apoptosis, proliferation index and EMT - into a Boolean in silico model. Additionally, we explain how drug responses of tumor cells with a specific mutational background and counterstrategies against resistance can be predicted. We are confident that our 3D in vitro approach especially with its in silico expansion provides an additional value for preclinical drug testing in more realistic conditions than in 2D cell culture.

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.

Ein kombiniertes 3D-Gewebezüchtungen<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Lungentumormodell für Hintergründe in bestimmten Mutations Drug Wirksamkeit vorhersagen

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

Entwicklung eines unter Schwerelosigkeits Vielzellige Dreidimensionale Organotypischen Modell des menschlichen Darmschleimhaut Grown

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

Dreidimensionale Gewebezüchtungen ausgerichtet Astrozyten Netzwerke Nervensystem Regeneration zu rekapitulieren Entwicklungsmechanismen

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.

Eine neuartige Tenorrhaphy-Nahttechnik mit tissue engineered Collagen Graft zur Reparatur großer Sehnendefekte

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue culture systems lack a three-dimensional (3D) matrix, resulting in a significant disconnect between results collected in vitro and in vivo. To address this limitation, researchers have engineered 3D hydrogel tissue culture platforms that can mimic the biochemical and biophysical properties of the in vivo cell microenvironment. This research has motivated the need to develop material platforms that support 3D cell encapsulation and downstream biochemical assays. Recombinant protein engineering offers a unique toolset for 3D hydrogel material design and development by allowing for the specific control of protein sequence and therefore, by extension, the potential mechanical and biochemical properties of the resultant matrix. Here, we present a protocol for the expression of recombinantly-derived elastin-like protein (ELP), which can be used to form hydrogels with independently tunable mechanical properties and cell-adhesive ligand concentration. We further present a methodology for cell encapsulation within ELP hydrogels and subsequent immunofluorescent staining of embedded cells for downstream analysis and quantification.

Recombinant protein-engineered hydrogels are advantageous for 3D cell culture as they allow for complete tunability of the polymer backbone and therefore, the cell microenvironment. Here, we describe the process of recombinant elastin-like protein purification and its application in 3D hydrogel cell encapsulation.

Produktion von Elastin-Like Protein Hydrogele für Kapselung und Immunostaining Zellen in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Nachweis von Endotoxin im Nano-Rezepturen mit Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional tissue. Tissue engineering holds great promise as a potential solution with its ability to integrate cells and signaling molecules into a 3-dimensional scaffold. Recent work with tissue engineered tracheal grafts (TETGs) has seen some success but their translation has been limited by graft stenosis, graft collapse, and delayed epithelialization. In order to investigate the mechanisms driving these issues, we have developed a mouse model for tissue engineered tracheal graft implantation. TETGs were constructed using electrospun polymers polyethylene terephthalate (PET) and polyurethane (PU) in a mixture of PET and PU (20:80 percent weight). Scaffolds were then seeded using bone marrow mononuclear cells isolated from 6-8 week-old C57BL/6 mice by gradient centrifugation. Ten million cells per graft were seeded onto the lumen of the scaffold and allowed to incubate overnight before implantation between the third and seventh tracheal rings. These grafts were able to recapitulate the findings of stenosis and delayed epithelialization as demonstrated by histological analysis and lack of Keratin 5 and Keratin 14 basal epithelial cells on immunofluorescence. This model will serve as a tool for investigating cellular and molecular mechanisms involved in host remodeling.

Graft stenosis poses a critical obstacle in tissue engineered airway replacement. To investigate cellular mechanisms underlying stenosis, we utilize a murine model of tissue engineered tracheal replacement with seeded bone marrow mononuclear cells (BM-MNC). Here, we detail our protocol, including scaffold manufacturing, BM-MNC isolation, graft seeding, and implantation.

Aussaat und Implantation von einem biosynthetischen Tissue-Engineering trachealen Transplantat in einem Mausmodell

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...