Das Plattenepithelkarzinom des Ösophagus, ESCC, ist tödlich und weltweit weit verbreitet. Dreidimensionale Organoide können verwendet werden, um den Fortschritt in der Praxis zu beschleunigen und die schwere Belastung durch ESCC zu bekämpfen. Aus Einzelzellen gewonnene 3D-Organoide von Mäusen, die mit 4NQO behandelt wurden, können leicht und kostengünstig manipuliert werden, um die molekularen Veränderungen, die mit der Initiierung und Entwicklung von ESCC einhergehen, funktionell zu annotieren.
Dieses Modell erfasst die genetische Heterogenität von mutageninduzierten Tumoren. Daher bieten diese Organoide eine physiologisch relevante Plattform, um neue therapeutische Strategien zu testen oder die hervorstechenden genetischen Veränderungen zu identifizieren, die die Tumorentstehung vorantreiben. Bei der Demonstration der Tiersektion und Organentnahme wird Yasuto Tomita, ein Mitarbeiter, helfen, und Norihiro Matsuura, ein Postdoktorand aus meinem Labor, wird die Herstellung von Organoiden für das Paraffineinbettungsverfahren demonstrieren.
Öffnen Sie zunächst die Haut der euthanasierten Mäuse, indem Sie das Mittelbauchfell kneifen und mit einer chirurgischen Schere einen kraniokaudalen, ventralen Mittellinienschnitt vom Unterbauch bis zum Kinn machen. Machen Sie ausgehend vom Mittellinienschnitt radiale Schnitte, die sich bis zu den Gliedmaßen auf beiden Seiten der Maus erstrecken, und blasen Sie die Hautlappen auf. Um die zervikale Luftröhre freizulegen, teilen Sie mit einer Präparierschere die Speicheldrüsen an der Mittellinie.
Um die thorakale Luftröhre freizulegen, entfernen Sie das Brustbein. Kneifen und heben Sie das Bauchfell vorsichtig mit einer Pinzette an und teilen Sie das Bauchfell mit einer Schere kraniokaudal. und seitlich entlang des Brustkorbs.
Ziehen Sie die Leber vorsichtig von der kaudalen Oberfläche des Zwerchfells zurück und machen Sie mit einer Schere einen kleinen Schnitt im Zwerchfell an der Sternumkerbe, insbesondere an der dorsalen Oberfläche des Xipoidfortsatzes. Sobald der Brustkorb vom Brustinhalt getrennt ist, führen Sie eine Schere in den Einschnitt im Zwerchfell ein und präparieren Sie den Halsgürtel kranial zum Halsgürtel, der eng an der dorsalen Oberfläche des Brustbeins anliegt, um Schäden an den darunter liegenden Organen zu vermeiden. Schneiden Sie die Rippen auf beiden Seiten des Brustbeins mit einer Schere ab und entfernen Sie das Brustbein.
Um die Bauchösophagus freizulegen, heben Sie den Magen sanft nach vorne an, indem Sie das Antrum mit einer Pinzette festhalten. Sezieren Sie mit einer Schere die Milz, die Bauchspeicheldrüse und das Mesenterium aus Magen und Speiseröhre. Um die thorakale Speiseröhre freizulegen, heben Sie die Luftröhre vorsichtig unmittelbar kaudal zum Schilddrüsenknorpel an und präparieren Sie die Speiseröhre der dorsalen Seite der Luftröhre mit einer Irisschere.
Durchtrennen Sie die Luftröhre am Schilddrüsenknorpel mit einer Irisschere. Ziehen Sie die Luftröhre vom Rest der Speiseröhre ab, indem Sie sie vorsichtig in kaudaler Richtung präparieren. Entfernen Sie Lunge, Herz und Thymusdrüse zusammen mit der Luftröhre.
Den Magen am Pylorus mit einer Schere teilen. Trennen Sie die Speiseröhre vom Wirbel, indem Sie das Antrum mit einer Pinzette festhalten und kranial präparieren. Teilen Sie die Speiseröhre auf Höhe des Schilddrüsenknorpels und entnehmen Sie die Speiseröhre und den Magen insgesamt.
Trennen Sie Magen und Speiseröhre, indem Sie die Speiseröhre an der Kardia teilen und alle Faszien an der äußeren Oberfläche der Speiseröhre präparieren. Um eine Probe für die Histologie zu reservieren, spalten Sie sie in Längsrichtung mit einer Schere. Legen Sie die verbleibende intakte Speiseröhre und das kalte PBS auf Eis.
Öffnen Sie den Bauch entlang der größeren Krümmung und waschen Sie ihn ausreichend mit PBS. Trennen Sie den Vormagen und waschen Sie ihn mit kaltem PBS. Um die Zunge zu ernten, entfernen Sie die Nadel aus der Nase und ziehen Sie die Zunge mit einer Pinzette heraus.
Schneiden Sie die Zunge so lang wie möglich ab und legen Sie sie in kaltes PBS auf Eis. Nachdem das dissoziierte Gewebe in eine Kulturschale überführt wurde, wird die Muskelschicht vorsichtig mit einer Pinzette aus dem Epithel entfernt. Das Epithel wird in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 Mikrolitern 0,25%igem Trypsin überführt und 10 Minuten lang in einem Thermomischer bei 37 Grad Celsius und 800 U/min inkubiert.
Nach kurzer Zentrifugation wird die Zellsuspension durch ein 100-Mikrometer-Zellsieb übertragen, das auf einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen mit breiter Spitze mit kreisenden Bewegungen aufbewahrt wird, dann 3 Milliliter Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (STI) mit kreisenden Bewegungen durch das Sieb zum Waschen zugeben und dann das Sieb mit dem Boden eines 1-Milliliter-Tuberkulin-Spritzenkolbens schrubben, um die Zellen hindurchzudrücken. Waschen Sie das Sieb 3 bis 5 Mal mit 3 Millilitern PBS und schrubben Sie das Sieb zwischen den Wäschen mit dem Boden der Spritze. Entfernen Sie nach dem Pelletieren der Zellen durch Zentrifugation den Überstand und lassen Sie 1 Milliliter Lösung im Röhrchen zur erneuten Suspension.
Sobald das Pellet resuspendiert ist, überführen Sie die Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Nachdem Sie das Röhrchen erneut zentrifugiert haben, resuspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern Maus-Organoid-Medium (MOM) und führen Sie eine automatisierte Zellzählung durch. Platte 5.000 lebensfähige Zellen in 75 % Basalmembranextrakt (BME) und MOM mit 50 Mikrolitern Gesamtvolumen pro Well.
Geben Sie mit einer 200-Mikroliter-Spitze mit breitem Durchmesser langsam ein 50-Mikroliter-Tröpfchen in die Mitte jedes Wells und vermeiden Sie den Kontakt zwischen der Spitze und dem Boden oder den Seiten des Wells. Lassen Sie den BME 30 Minuten lang in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid und 95 % relativer Luftfeuchtigkeit erstarren. Geben Sie nach der Inkubation vorsichtig 500 Mikroliter MOM pro Vertiefung hinzu.
Wechseln Sie das MOM am 3. oder 4. Tag und danach alle 2 bis 3 Tage, bis es für die Passage bereit ist. Bewahren Sie den aufgetauten BME vor Gebrauch auf Eis auf, erwärmen Sie MOM, 0,05 % Trypsin und STI auf 37 Grad Celsius. Sammeln Sie mit einer Mikropipettenspitze mit breitem Durchmesser die Organoide in der BME-Kuppel zusammen mit dem Überstand und stören Sie den BME, indem Sie auf und ab pipettieren.
Nachdem das Organoid-Pellet durch kurzes Zentrifugieren erhalten wurde, wird es nach dem Lösen in 500 Mikrolitern 0,05%igem Trypsin resuspendiert. Inkubieren Sie das Röhrchen in einem Thermomischer bei 37 Grad Celsius und 800 U/min für 10 Minuten. Inaktivieren Sie das Trypsin mit 600 Mikrolitern STI.
Nach dem Zentrifugieren und Verwerfen des Überstands wird das Zellpellet in 100 Mikrolitern MOM resuspendiert. Führen Sie eine automatische Zellenzählung durch Trypanblau-Ausschluss durch. Um die Organoide zu fixieren, lösen Sie das Pellet vorsichtig und resuspendieren Sie es in 300 Mikrolitern 4%Paraformaldehyd über Nacht bei 4 Grad Celsius.
Bereiten Sie als Nächstes eine Einbettfläche vor, indem Sie ein Mikrozentrifugenröhrchengestell umdrehen und die Oberfläche mit einer Deckenfolie abdecken und dann mit der entsprechenden Organoid-ID beschriften. Überlagern Sie vorsichtig das Paraformaldehyd, das in PBS-gewaschenen Organoid-Pellets entfernt wurde, indem Sie 50 Mikroliter Agar an der Seite des Röhrchens hinzufügen. Wiederholen Sie diesen Schritt.
Ohne das Pellet zu stören, übertragen Sie das Pellet im Agar-Gel-Tröpfchen auf die Deckenfolie auf der Einbettfläche, um es 45 Minuten lang bei 4 Grad Celsius zu erstarren. Übertragen Sie das Tröpfchen mit dem erstarrten Organoid-Pellet vorsichtig mit einer Pinzette in eine markierte Pathologiekassette. Die normalen Organoide der murinen Ösophaguszunge und des Vormagens wurden morphologisch mittels Hellfeldbildgebung und histologischer Färbung analysiert.
Das Plattenepithelkarzinom des Ösophagus einer mit 4NQO behandelten Maus zeigte eine nukleäre Atypie und eine abrupte Keratinisierung. Die Selbsterneuerungskapazität von Organoiden, die durch die Bestimmung der Organoidbildungsrate in der Subkultur bewertet wurde, zeigte, dass die Bildungsrate in Abhängigkeit von der Zeit abnimmt, was die Abnahme der proliferativen basaloiden Zellen in den gereiften Organoiden widerspiegelt. Die Wachstumskinetik der Organoide zeigt sich in ihrer Morphologie zu verschiedenen Zeitpunkten.
Die Verhornung des inneren Kerns von Organoiden wird am 10. Tag deutlich. Die proliferativen basaloiden Zellen verbleiben in der äußersten Zellschicht, auch zu den Zeitpunkten des 14. und 21. Tages. Eine Populationsverdopplungskurve normaler Mauszungen-Organoide, die von 4NQO-unbehandelten Mäusen generiert wurden, zeigt ihr stetiges Wachstum über mehrere Passagen und eine langfristige Kultur.
Organoide sind Plattformen für Hochdurchsatz-Screenings zur Identifizierung neuer therapeutischer Ziele, CRISPR-basierte Editierung zur Abfrage spezifischer Genfunktionen oder Kokulturen, um zu definieren, welche Interaktionen in der Tumormikroumgebung die Transformation beeinflussen. Diese Technik hat es uns ermöglicht, Phänomene wie partielle EMT- und HPV-Infektionen sowie deren Interaktion mit dem Immunsystem in der Biologie von Plattenepithelkarzinomen des aerodigestiven Trakts zu untersuchen.
