Wir möchten Dr. Paul Weigel an der Univ danken. of Oklahoma für den Einsatz des monoklonalen Antikörpers 30 für Erkennung der HARE/Stabilin-2 Rezeptor und Janet Weigel für ihre technische Unterstützung. Diese Forschung wird von University of Nebraska-Forschungsgelder finanziert.

1. Excision der Leber (übernommen von PO Seglen 12 und R. Blomhoff 13 mit Modifikationen 14,15) <ol><li> Fügen Sie 10 ml 30% Isofluran in Polyethylenglykol in eine Petrischale in einem geschlossenen 5,5 L Kammer. Es ist optimal, 10-15 min nach der Zugabe von Isofluran auf eine stabilisierte Luft innerhalb der Kabine zu schaffen warten. </li><li> Legen Sie eine Ratte in der verschlossenen Kammer und lassen Sie es sich betäubt. Volle Auswirkungen der Narkose sind offensichtlich, wenn das Tier wird schlaff, reagiert und weist tiefe Atmung. </li><li> Platz 2 mL von Isofluran in Polyethylenglykol in einigen Wattebällchen auf den Boden einer 30 ml Spritze Rohr. </li><li> Legen Sie die Ratte auf dem Rücken auf einer Windel bedeckt, und bewahren Sie die Spritze Rohr über die Schnauze. </li><li> Unmittelbar bestätigen tiefe Narkose durch Benetzung des Bauches mit 70% Ethanol. Lassen Sie sich nicht das Tier von Isofluran Überdosis sterben. </li><li> Mit Bandage Scheren und Zangen, setzen die gesamte abdominal Hohlraum. </li><li> Suchen Sie die Pfortader und mit einer Pinzette ziehen zwei Stränge der chirurgischen Seide oder Polyester Faden (Ligatur) unter der Pfortader unmittelbar oberhalb der mesenterialen Branche. </li><li> Ziehen Sie die Zange und Krawatte ein loses Überhandknoten. </li><li> Mit einer Pinzette unter die Pfortader und vorsichtig wieder zu begradigen die Vene, kanülieren die Vene mit einer Insyte Autoguard Katheter (18 GA, 1,3 x 300 mm, BD Biosciences) oder ähnliche Katheter. Der Katheter sollte einige mm über der Schleife durch das Gewinde geformt gehen. </li><li> Einfahren und entfernen Sie die Nadel durch die Freigabe der federbelastete Trigger auf dem Katheter. Blut sollte beginnen sickern bis in den Katheter der Angabe der richtigen Ligatur Platzierung. </li><li> Ziehen Sie die Überhandknoten und sichern Sie es mit einem anderen Überhandknoten. </li><li> Sever entweder die untere Hohlvene oder absteigenden Aorta (Aorta abdominalis), damit Blut aus dem Kreislaufsystem abtropfen lassen. </li><li> Begin Spülung der Leber mit sauerstoffreichemTBS bei 37 ° C, um das Blut (Blanchieren) bei einer Flussrate von 20 ml / min zu entfernen. Die Leber sollte von einem rötlich-violett zu einem Lehm verfärben. </li><li> Während die Leber Spülung, Verbrauchssteuern der Leber durch das Wegschneiden des GI-Trakts und des Bindegewebes. Es ist wichtig, nicht auf die Leber oder Punktion der Glisson&#39;sche Kapsel zerreißen. </li><li> Legen Sie die Leber auf einem Kunststoff-Netz über einen Trichter, Puffern gesammelt und rückgeführt werden können. Puffer an dieser Stelle sollte nicht zurückgeführt werden, sondern fließen in den Abfall Becher. Die Spülung sollte nicht länger als 10 min. (Abb. 2A). Bereiten Sie die Endozytose Lösung in Schritt 2.1 erforderlich. </li></ol> 2. Die Internalisierung von 125 I-SA-b-Hep (oder einem anderen geeigneten markierten Liganden) <ol><li> Um 50 mL RPMI-Medium in einem kleinen Becherglas, bis zu einer Endkonzentration 0,05% BSA und 0,01 mCi 125 I-SA-b-Hep oder anderen entsprechend markierten Liganden für Endozytose hinzuzufügen. </li><li> Bringen Sie diesen Becher auf die Apparatus für Sauerstoffzufuhr zu ermöglichen. </li><li> Schalten Sie die Pumpe, schalten Sie den Zulaufschlauch und dann an der Pumpe drehen bei 20 mL / min. </li><li> Wie die Bezeichnung RPMI Ansätze der Leber, schalten Sie die Pumpe und lassen überschüssige Flüssigkeit in den Trichter und Schlauch abtropfen lassen. </li><li> Setzen Sie den Ablaufschlauch in die Medien Becherglas Rückführung von markierten Medien ermöglichen und starten Sie dann die Pumpe. </li><li> Lassen Flüssigkeiten durch die Leber nicht mehr als 1 Stunde umwälzen. </li><li> Während dieser Verinnerlichung Schritt sicher, dass die Temperatur in der Leber ist stabil durch Abdecken und bereiten die Kollagenase für die Verdauung. </li></ol> 3. Die Verdauung der Leber durch Kollagenaseverdau <ol><li> Frisch gelöst und filtriert (0,45 um) Kollagenase (100 mg / kg Ratte Gewicht) sollte hinzugefügt werden, um 2 in einem Gesamtvolumen von nicht zu 60 mL bei 37 ° C übersteigen Buffer werden Die Lautstärke ist abhängig von der Länge / Innenvolumen des Rohrs und sollte entsprechend angepasst werden. </li><li> Stoppen Sie die Pumpe und den Austausch derZulaufschlauch aus der Medien-Becher auf die TBS. </li><li> Flush in der Leber für 2 min bei 50 mL / min, die zum Lösen der desmosomalen Zellkontakte, die Calcium-abhängig sind erlaubt. </li><li> Während die Leber Spülung, den Austausch der Medien Becherglas mit der Becher mit Kollagenase auf das Gerät. </li><li> Unmittelbar nach dem Spülen, beginnen die Verdauung mit Kollagenase in einem Kreislauf Schleife bei einer Flussrate von 20 ml / min für bis zu 15 min. Da Kollagenase Chargen von Lot-Nummer ändern, müssen Schwankungen in der Menge und der Zeit der Verdauung, für jede neue Charge von Kollagenase optimiert werden. Collagenase ist auch Calcium-abhängig. Schalten Sie die Pumpe und die Schalter der Puffer-und Gasleitungen von Flask A bis Flask B. Übertragung des Abwassers Linie von den Abfallbehälter zu Flask B (Abb. 2B). </li><li> Stoppen Sie die Pumpe, entfernen Sie den Katheter und den Transfer der Leber zu einer Schale mit 20-30 mL Puffer 1. </li><li> Ziehen Sie die Glisson&#39;sche Kapsel der Leber und schütteln Sie die Zelles in der Flüssigkeit. </li><li> Da die Flüssigkeit trübt sich mit zellulären Material, übertragen Sie die Zellen durch ein 100 um Sieb durch Filtration durch ein 30 um Maschenweite und dann in eine 50 ml konischen auf Eis. </li><li> Fügen Sie weitere Puffer 1 für die Leber und weiter Schütteln Zellen aus der Leber-Matrix, die Übertragung der Flüssigkeit auf die Siebe und konisch. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte von 3,7 bis 3,9, bis keine Zellen mehr mit vertretbarem Schütteln der Leber verdrängt werden. </li></ol> 4. Hepatozyten und SEC Reinigung <ol><li> Zentrifugieren Sie die 50 ml konische enthaltenden Zellen bei 150 xg für 3 min. Zum Pelletieren der Hepatozyten. </li><li> Die Flüssigkeit enthaltende Fraktion nicht Parenchymzellen an die frische 50 ml konische auf Eis. </li><li> Waschen Sie den Hepatozyten werden Resuspendieren des Pellets in Puffer 3 und wiederholen Sie die Schritte 4.1 und 4.2 noch dreimal. </li><li> Am Ende des wäscht, werden die Pellets ≥ 97% reinem Hepatozyten. Um die SECS, Zentrifuge alle Rohre containing gebündelt Überstand (enthält Blutstammzellen, SECS, und KCS und einige kleine Hepatozyten) bei 200 xg für 10 min. bei 4 ° C. </li><li> Saugen Sie den Puffer und resuspendieren alle Pellets in 5 ml RPMI / BSA bei 4 ° C. </li><li> Pool der Zellen zusammen in 2 Röhren und fügen RPMI / BSA bis zu einem Volumen von 35 mL. </li><li> Zentrifugieren Sie die konische bei 100 xg für 3 min. </li><li> Sammeln Sie die Top 25 ml Flüssigkeit aufnehmen und in sauberen 50 ml konischen. </li><li> Das Pellet in den restlichen 10 mL Medien und fügen Sie wieder 25 ml kaltem RPMI / BSA und Zentrifuge bei 100 xg für 3 min. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.8 und 3.9 noch einmal, verwerfen das Zellpellet und unteren 10 mL Medien. </li><li> Zentrifugieren Sie die Überstände an Pellet SECS, KCS, und HSCs bei 200 xg für 10 min. bei 4 ° C. </li><li> Bereiten Sie drei 50-ml-Röhrchen mit 20 ml 25% Percoll in PBS auf Eis. Unterlage mit 15 mL 50% Percoll in jeder Röhre. </li><li> Resuspendieren der Zellpellets in einem Gesamtvolumen von 30 mL RPMI / BSA. </li><li> Sorgfältig Overlay each Steigung mit 10 ml Zellen und Zentrifuge bei 900 xg für 20 min bei 4 ° C. </li><li> SECs und KCS haben sehr enge Auftrieb Dichten und sind an der 25/50%-Schnittstelle. HSK sind in der Regel bei 25% / media aufgrund ihrer höheren Auftrieb als Lipid speichernden Zellen-Schnittstelle. Alle verbleibenden Hepatozyten und Blutzellen der unteren Auftriebskräfte und pelletiert. Absaugen von oben nach unten in der Nähe der 25/50%-Schnittstelle und entsorgen Sie dieses Materials. </li><li> Sammeln Sie die Zellen in der 25/50%-Schnittstelle und den Transfer zu einem neuen konischen mit kaltem RPMI. Das endgültige Volumen sollte ca. 40 ml zu verdünnen die Percoll werden. </li><li> Centrifuge den konischen bei 350 xg für 10 min bei 4 ° C die Zellen zu pelletieren. </li><li> Resuspendieren der Zellen in ~ 10 mL vorgewärmtes RPMI mit 100 U / mL Penicillin/100 g / ml Streptomycin und Platz Zellen in einer Säure-gewaschene Glas Petrischale oder Kristallisierschale. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen für 15 min. bei 37 ° C in einem Gewebekultur-Inkubator. </li><li> Rock oder schwenken Sie die Platte ein wenigund dann sammeln die SECs im Überstand. Die KCS auf das Glas viel schneller als SECs halten. Alternativ können SECs aus KCS durch immunopurification mit anti-CD31 oder anti-Stabilin2/HARE Antikörpern, konjugiert an magnetische Kügelchen getrennt werden. </li><li> Die Lebensfähigkeit und Zellzahl kann durch Trypanblau-Ausschluss mit einem Hämazytometer oder mit einem automatisierten Zelle Zähler beurteilt werden. </li><li> Kultur der SECs auf Fibronektin-beschichteten Plastikschalen bei 37 ° C, 5% CO 2, RPMI/0.25% BSA mit 40 ng / mL VEGF, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin oder mit Hepatozyten-konditionierten Medien. </li><li> Hepatozyten, KCS, und SECs kann für die Internalisierung des markierten Materials beurteilen durch die Verwendung eines Gamma-Counter und Normalisierung zu gesamten zellulären Proteins oder durch Mikroskopie (wenn fluoreszenzmarkierten) mit diesen Kultivierungsverfahren. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Hepatocyte Reinigung ist ≥ 97% und SEC Reinigung TypikVerbündeter ≥ 95% mit dieser Methode. Excision der Bauchhöhle, Kanülierung der Pfortader und Blanchieren der Leber alle sollten innerhalb einer Minute für die besten Ergebnisse auftreten. HARE/Stabilin-2 ist ein spezifischer Rezeptor auf Leber SECs und nicht in andere Leber Zelltypen exprimiert. In diesem Beispiel wurden Zelllysate beider Hepatozyten und SECs um 5% SDS-PAGE getrennt und sondiert mit einem monoklonalen Antikörper gegen beide Isoformen von Stabilin-2 (Abb. 3). Unfraktioniertem Heparin in die Blutbahn injiziert wird von der Leber 16 gelöscht. Die Clearance ist in erster Linie von der Leber SECs im Gegensatz zu Hepatozyten und KC 17 durchgeführt. Die Stabilin-2/HARE Rezeptor ist die wichtigste Spiel-Rezeptor bindet und internalisiert in SECs 18 Heparin. In unserem Beispiel hier, beschriftet wir Heparin mit einer Biotin-Tag auf der Carboxylatgruppe von GlcNAc / NS. Die Biotin konjugiert mit jodhaltigen Streptavidin zum Nachweis von Heparin verinnerlicht proteoglycan. Injektion des markierten Heparin gefolgt von Ausbluten 30 Minuten nach der Injektion ermöglicht es uns, zu überwachen, welche Organe diese Form von Heparin zu verinnerlichen. In dieser kurzen Zeitspanne ist die Leber das primäre Organ-Clearance (Abb. 4). Um besser zu verstehen, welcher Zelltyp verantwortlich für die Freigabe ist, haben wir 125 I-SA-b-Hep zu RPMI-Medium mit 0,05% BSA ergänzt und erlaubt es durch die Leber für 20 min zirkulieren. Nach Kollagenaseverdau und zellulären Reinigung wird die überwiegende Mehrheit der markierten Heparin durch SECs im Gegensatz zu Hepatozyten (Abb. 5) verinnerlicht. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Grundlegende Leber-Architektur. SECs bilden die Wände der Sinusoide und sind in der Regel gefenstert (kleine Cluster von Kreisen). Sternzellen (HSC) sind im Raum der Disse im Gegensatz zu Kupffer c gefundenEllen (KCS), die normalerweise in der Mikrovaskulatur der Sinusoide vorhanden sind. Hepatozyten besetzen die andere Seite des Raums der Disse. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Schematische Darstellung des Perfusionsapparatur. A) Set-up des Geräts während der Spülung / Waschen der Sinusoide der Leber. TBS ist in einer 1 L Flasche. B) Ein 125 ml Kolben mit ~ 60 ml Puffer 2 mit Kollagenase ist für die Verdauung der Leber in einem geschlossenen Kreislauf verwendet. Das Abwasser Leitung ist auch aus dem Abfallbehälter zu Kolben B durch eine Kerbe in den Gummistopfen geändert. Der Sauerstoff-Leitung ist nicht in den Puffer mit Kollagenase (Kolben B) Schaumbildung zu vermeiden untergetaucht. Die Anschläge auf jeder Flasche sind eingekerbt, um eine effiziente Übertragung der Abwasser Linie zu ermöglichen und zu einem erhöhten Druck aus dem Sauerstoff zu verhindern. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. </strong&gt; Hepatocyte Präparate sind nicht mit SECs kontaminiert. Gleiche Mengen von Zelllysaten aus gereinigten Chargen von Hepatozyten (Spur 1) und Sekunden (Spur 2) wurden um 5% SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrocellulose geblottet. Monoklonale Antikörper # 30, das spezifisch gegen beide Isoformen (315 kDa und 190 kDa) von HARE/Stabilin-2 wurde verwendet, um die Lysate Sonde. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4. Vertrieb von markiertem Heparin in Organen. Die Ratten wurden über die laterale Schwanzvene mit 125 I-SA-b-hep warten Sie 30 Minuten injiziert und dann verblutet. Das Blut wurde aufgefangen, so dass nicht alle Organe künstlich hoch Lesungen geben. Counts pro Minute (CPM) von jedem Organ gegen das Gewicht der Orgel in g normalisiert. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig5.jpg" alt="Abbildung 5"/> Abbildung 5. Menge an markiertem Heparin in Hepatozyten und Sekunden. RPMIch Medien mit 125 I-SA-b-Hep durfte durch eine intakte Leber für 20 min durch Kollagenaseverdau und zellulären Reinigung gefolgt zirkulieren. Gleiche Mengen von Hepatozyten und SEC Zellproteins Lysate wurden mit dem Bradford-Assay quantifiziert und zählte mit einem Gamma-Counter. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig6.jpg" alt="Abbildung 6"/> Abbildung 6. Kupffer-Zellen werden aus SECs durch Adhäsion auf Glas getrennt. Die Zellen wurden in einer Säure-gewaschene Glas Kristallisierschale gegeben und man ließ sie für 15 min bei 37 ° C einzuhalten, 5% CO 2. Der Überstand mit nicht eingehalten Zellen wurde sanft geschwenkt und in ein Zentrifugenröhrchen. Lysate von beiden eingehalten Zellen auf Glas (Spur 1) und aus nicht-anhaftenden Zellen (Spur 2) wurden von 8% SDS-PAGE aufgetrennt, geblottet und sondiert mit einem Antikörper gegen CD163, die spezifisch für den Kupffer-Zellen ist. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig7.jpg" alt="Abbildung 7"/> Abbildung 7. SECs auf Fibronektin beschichteten Kunststoff verchromt 6-Well-Schalen wurden über Nacht in RPMI inkubiert ergänzt mit 0,1% BSA. Phasenkontrast-Bilder wurden bei (A) 100x und (B) 200x Vergrößerung.

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Commun. 218, 314-319 (1996).</li><li>Duryee, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+is+a+cofactor+for+malondialdehyde-acetaldehyde+adduct-mediated+cytokine/chemokine+release+by+rat+sinusoidal+liver+endothelial+and+Kupffer+cells.">Lipopolysaccharide is a cofactor for malondialdehyde-acetaldehyde adduct-mediated cytokine/chemokine release by rat sinusoidal liver endothelial and Kupffer cells.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 28, 1931-1938 (2004).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Anästhesie der Ratte durch die hängenden Tropfen Methode, bei der Isofluran-Dampf verursacht Bewusstlosigkeit ist die bevorzugte Methode für unsere Studien. Ein Verdampfer kann auch anstelle einer Spritze mit Baumwolle, das Tier außerhalb der Kammer zu halten verwendet werden, aber die chirurgischen Eingriffe sind so schnell, es ist nicht erforderlich. Polyethylenglykol ist es, die Isofluran hinzugefügt, um den Dampfdruck und Verdunstung zu verringern. Zu viel Isofluran Dampf wird der Tod zu schnell zu induzieren. Wenn das Tier stirbt, bevor die Leber durchbohrt und blanchiert mit TBS, die Bündelung Blut Gerinnsel in der Leber und verhindern eine effiziente Reinigung der Sinusoide und Verdauung mit Kollagenase. Die Zugabe von Heparin kann nützlich sein, als Antikoagulans ist aber nicht in diesen Studien verwendet werden, da wir beschriftet Heparin als unsere Sonde verwenden. Gey-Salzlösung (GBSS) wird oft von anderen Laboratorien für die Reinigung von SECs ersetzt. Zwar ist es für SEC Reinigung, hep nützlichatocytes tolerieren keine GBSS sowie Puffer 1-3 und Bewohnbarkeit sind nicht annähernd so hoch. Bei der Messung der Endozytose, ist es ratsam, Hintergrundwerte in der Orgel und in gereinigtem Hepatozyten zu messen. Diese Methode ist eine von zwei für die effiziente Reinigung von SECs nach der Leberperfusion mit Collagenase. Die andere Methode trennt die Nicht-Parenchymzellen durch Auswaschen Zentrifugation 19 statt Percoll-Gradienten. Die Vorteile für die Verwendung von Schlämmen über Percoll Gradienten sind etwas höher Zellvitalitäten und Zahlen. Der Nachteil ist, dass Elutriation Zentrifugation eine spezielle Rotor, gewidmet Zentrifuge und Schlauchpumpe zusammen, die Zehntausende von Dollar kostet erfordert. Diese Methode erfordert nur die Verwendung einer Tischzentrifuge und Schlauchpumpe, die Standard in vielen Labors ist. Trennung von SECs und KCS durch selektive Adhäsion ist eine Standardmethode20-22. Es ist zwar richtig, dass SECs wird auf das Glas und Kunststoff haften, ist der entscheidende Punkt, um acid-washed sauberes Glas mit nicht mehr als eine 15-minütige Inkubation Verwendung bei 37 ° C bei 5% CO 2. KC wird immer haften schneller als SECs und es ist ratsam, vorsichtig waschen die KCS mit den Medien, um alle verbleibenden SECs, dass sich lose extrahieren. Pronase und andere Proteasen sind auch im Kollagenaseverdau Schritte in diesem Protokoll weggelassen, um Bewohnbarkeit der Zellen zu erhöhen. Proteasen verdauen extrazellulären Rezeptoren und kann zelluläre Adhäsion in den letzten Reinigungsschritte zu hemmen. Die hier vorgestellte Methode hat eine Vielzahl von Anwendungen. Obwohl wir das Endergebnis in dem Heparin zunächst up ist für die Abfertigung, die Durchblutung der Leber für den Erhalt von primären Hepatozyten aufgenommen wurden, zeigen, kann KC, SECS, und HSCs werden für eine Reihe von Studien, bei denen Stoffwechselwege, Immunregulation, Scavenger-Aktivitäten und andere nützliche physiologischen studies. Der schwierigste Teil dieses Verfahrens ist eine gute Zugänge, die Verdauung der Leber, und die Handhabung der Leber, ohne den Katheter gleiten aus der Pfortader.

<ul>
<li>Buffer 1: 142 mM NaCl 6.7 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.5% BSA, pH 7.4</li>
<li>Buffer 2 (perfusion buffer): 67.0 mM NaCl, 6.7 mM KCl, 4.8 mM CaCl2-H2O, 101.0 mM HEPES, BSA 1.5%, pH 7.4.</li>
<li>Buffer 3: 137 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 0.7 mM MgSO4, 1.2 mM CaCl2-2H2O, 10 mM HEPES, 1.5% BSA, pH 7.4</li>
<li>RPMI/BSA: 15g/L BSA in RPMI</li>
<li>TRIS-buffered Saline (TBS): 154 mM NaCl, 10 mM Trizma Base salt.</li>
<li>Collagenase: Collagenase A (#11088785103) from Roche, Collagenase Type I (#LS004691) from Worthington Biochemical or Collagenase I (#C0130) or IA (#C9891) from Sigma-Aldrich.</li>
</ul>
All salts are from Sigma-Aldrich
<table border="1">			
<tbody>
<tr>
	<td>Name</td>
	<td>Company</td> 		
	<td>Model/catalog #	</td>
 <td>Comment</td>
</tr>
<tr>
	<td>20L water bath</td>
	<td>ThermoFisher</td>
	<td>2231</td>
 <td>Water is about 45&#176;C to compensate for cooling within the tubing.</td>
</tr>
<tr>
	<td>Peristaltic Pump</td>
	<td>Cole-Parmer</td>
	<td>7553-70</td>
 <td>Masterflex series</td>
</tr>
<tr>
	<td>Refrigerated Centrifuge</td>
	<td>Sorvall</td>
	<td>Legend XTR</td>
 <td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
	<td>Catheter		</td>
	<td>BD Biosciences</td>
	<td>381444</td>
 <td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
	<td>Dessicator chamber</td>
	<td>Fisher</td>
	<td>08595E</td>
 <td>Use internal plate</td>
</tr>
<tr>
	<td>Percoll</td>
	<td>Sigma</td>
	<td>P4937</td>
 <td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
	<td>Bovine Serum Albumin</td>
	<td>SeraCare</td>
	<td>AP-4510-01</td>
 <td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
	<td>100 &mu;m mesh</td>
	<td>Spectrum labs</td>
	<td>146488</td>
 <td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
	<td>30 &mu;m mesh</td>
	<td>Spectrum labs</td>
	<td>146506</td>
 <td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
	<td>RPMI 1640</td>
	<td>Invitrogen</td>
	<td>21870</td>
 <td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
	<td>Polyethylene glycol</td>
	<td>Spectrum labs</td>
	<td>PO107</td>
 <td>&nbsp;</td>
</tr>
</tbody>
</table>

in vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion

Die Leber ist das metabolische Zentrum der Körper von Säugetieren und dient als Filter für das Blut. Die grundlegende Architektur der Leber ist in Abbildung 1, in denen mehr als 85% der Leber Masse der Hepatozyten besteht und die restlichen 15% der Zellmasse wird von Kupffer-Zellen (KCS), Sternzellen (HSC) zusammen dargestellt und Sinus-Endothelzellen (Sekunden). SECs bilden die Wände der Blutgefäße in der Leber und enthalten spezielle Morphologie genannt fenestrae in in das Zytoplasma. Fenestration des Cytoplasmas ist das Auftreten von Bohrungen (~ 100 Mikrometer) innerhalb der Zellen, so dass die SECs wirken wie ein Sieb, in dem die meisten Chylomikronen, Chylomikronen Reste und Makromolekülen, nicht aber Zellen, bis hin zu den Hepatozyten und HSCs 1 (Abb. Pass 1). Durch das Fehlen einer Basalmembran, bilden die Lücke zwischen den SECs und Hepatozyten the Space of Disse. HSCs besetzen diesen Platz und spielen eine herausragende Rolle bei der Regulierung und der Reaktion auf injury, Lagerung von Retinsäure und Immunregulation in der Leber 2. SECs gehören zu den endocytically aktiven Zellen des Körpers die Anzeige einer Reihe von Scavenger-Rezeptoren auf ihrer Zelloberfläche Oberfläche 3. Dazu gehören SR-A, Stabilin-1 und Stabilin-2. Generell sind kleine Kolloidteilchen weniger als 230 nm und Makromolekülen in Puffer-Phase von SECs genommen, während große Partikel und Zelltrümmer durch Endozytose (phagozytiert) von KC 4. So wird der Großteil Clearance von extrazellulären Material wie die Glykosaminoglykane aus dem Blut weitgehend abhängig von der Gesundheit und endocytischen Funktionen SECs 5,6. Zum Beispiel ist ein Anstieg im Blut Hyaluronsäure Ebenen Anzeichen für Lebererkrankungen leichten bis schweren Klassen 7. Mit Ausnahme von einem Bericht 8, gibt es keine verewigt SEC-Zelllinien in der Existenz. Auch dieser immortalisierten Zelllinie ist de-differenziertenEINZELNEN SEKTOREN in, dass es nicht ausdrücken Scavenger-Rezeptoren, die derzeit auf primären SECs (unsere Daten nicht gezeigt). Alle zellbiologischen Studien müssen auf Primärzellen frisch vom Tier stammen, durchgeführt werden. Leider dedifferenzieren SECs unter Standard-Kulturbedingungen und muss innerhalb von 1 oder 2 Tage nach Isolierung aus dem Tier eingesetzt werden. Differenzierung von SECs ist durch die Expression von Stabilin-2 oder Hasen-Rezeptor 9, CD31, und das Vorhandensein von zytoplasmatischen fenestration 1 gekennzeichnet. Differenzierung von SECs kann durch die Zugabe von VEGF in Kulturmedien oder durch Kultivierung von Zellen in Hepatozyten konditionierten Medium 10,11 ausgedehnt werden. In diesem Bericht werden wir die Endozytose-Aktivität von SECs im intakten Organ demonstrieren mit radioaktiv markiertem Heparin für Hyaluronan für die SEC-spezifischen Stabilin-2-Rezeptor. Wir werden dann zu reinigen Hepatozyten und Sekunden aus dem perfundierten Leber Endozytose zu messen.

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In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

Das Studium der Leber sinusförmige Endothelzellen (SECS) muss mit primären Zellen aus dem Tier erhalten, da keine Zelllinien existieren durchgeführt werden. Diese Methode basiert auf Leber Verdauung und differentielle Zentrifugation für SEC Reinigung für nachfolgende Kultivierung und Experimentieren.

In vivo Leber Endozytose durch Reinigung von Leberzellen durch Leberperfusion Gefolgt

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

in-vivo-liver-endocytosis-followed-purification-liver-cells-liver

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

18.9K Aufrufe.  University of Nebraska, Lincoln. Das Studium der Leber sinusförmige Endothelzellen (SECS) muss mit primären Zellen aus dem Tier erhalten, da keine Zelllinien existieren durchgeführt werden. Diese Methode basiert auf Leber Verdauung und differentielle Zentrifugation für SEC Reinigung für nachfolgende Kultivierung und Experimentieren.

Serie: In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In addition, liver stem cells are hypothesized to be the precursors for a subset of liver cancer, Hepatocellular carcinoma. One of the primary challenges to stem cell work in any solid organ like the liver is the isolation of a rare population of cells for detailed analysis. For example, the vast majority of cells in the liver are hepatocytes (parenchymal fraction), which are significantly larger than non-parenchymal cells. By enriching the specific cellular compartments of the liver (i.e. parenchymal and non-parenchymal fractions), and selecting for CD45 negative cells, we are able to enrich the starting population of stem cells by over 600-fold.The proceduresdetailed in this report allow for a relatively rare population of cells from a solid organ to be sorted efficiently. This process can be utilized to isolateliver stem cells from normal murine liver as well as chronic liver injury models, which demonstrate increased liver stem cell proliferation. This method has clear advantages over standard immunohistochemistry of frozen or formalin fixed liver as functional studies using live cells can be performed after initial co-localization experiments. To accomplish the procedure outlined in this report, a working relationship with a research based flow-cytometry core is strongly encouraged as the details of FACS isolation are highly dependent on specialized instrumentation and a strong working knowledge of basic flow-cytometry procedures. The specific goal of this process is to isolate a population of liver stem cells that can be clonally expanded in vitro.

Here we describe the isolation of CD133 expressing liver stem cells and cancer stem cells from whole murine liver, a process that requires tissue digestion, cell enrichment, and flow cytometry isolation. We include methods for advanced single cell isolation and clonal expansion.

Isolierung von CD133 + Leber-Stammzellen für die klonale Expansion

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In ...

Forschung

Biologie

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Liver fibrosis is defined by the excessive deposition of extracellular matrix by activated myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic myofibroblasts, including hepatic stellate cells, portal fibroblasts and bone marrow derived fibroblasts 1. Hepatic stellate cells have been the best studied, but portal fibroblasts are increasingly recognized as important contributors to the myofibroblast pool, particularly in biliary fibrosis 2. Portal fibroblasts undergo proliferation in response to biliary epithelial injury, potentially playing a key role in the early stages of biliary scarring 3-5. A method of isolating portal fibroblasts would allow in vitro study of this cell population and lead to greater understanding of the role portal fibroblasts play in biliary fibrosis.
Portal fibroblasts have been isolated using various techniques including outgrowth 6, 7 and liver perfusion with enzymatic digestion followed by size selection 8. The advantage of the digestion and size selection technique compared to the outgrowth technique is that cells can be studied without the necessity of passage in culture. Here, we describe a modified version of the original technique described by Kruglov and Dranoff 8 for isolation of portal fibroblasts from rat liver that results in a relatively pure population of primary cells.

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

A technique for isolating portal fibroblasts from rat liver is described. Livers are perfused and digested in situ with collagenase, followed by ex vivo digestion of the liver slurry and size selection of cells. This method provides a pure population of portal fibroblasts without the need for passage in culture.

Isolierung von Ratten-Portal Fibroblasten durch<em&gt; In-situ</em&gt; Leberperfusion

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

Do-It-Yourself Einrichtung zur Rückgewinnung von kryokonservierten Proben versehentlich fallengelassen in Kryo-Lagerbehälter

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. As such, hepatocytes are an important model for a large variety of research questions. In particular, the use of human hepatocytes is especially important in the fields of pharmacokinetics, toxicology, liver regeneration and translational research. Thus, this method presents a modified version of a two-step collagenase perfusion procedure to isolate hepatocytes as described by Seglen 1.
Previously, hepatocytes have been isolated by mechanical methods. However, enzymatic methods have been shown to be superior as hepatocytes retain their structural integrity and function after isolation. This method presented here adapts the method designed previously for rat livers to human liver pieces and results in a large yield of hepatocytes with a viability of 77&plusmn;10%. The main difference in this procedure is the process of cannulization of the blood vessels. Further, the method described here can also be applied to livers from other species with comparable liver or blood vessel sizes.

A modified two-step collagenase perfusion procedure for isolation of human hepatocytes is described. This method can also be applied to other mammalian livers. The isolated hepatocytes are available in high yield and viability, making them a suitable model for scientific research in areas such as liver regeneration, pharmacokinetics and toxicology.

Isolierung von humanen Hepatozyten durch eine Zwei-Schritt-Verfahren Collagenase Perfusion

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures - both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.

The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.

Eine standardisierte Methode für die Analyse von Leber sinusoidalen Endothelzellen und ihre Fenestrationen durch Rasterelektronenmikroskopie

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A deeper understanding of the changes in gene expression that occur during repopulation could help identify therapeutic targets to promote the restoration of liver function in the setting of injuries. Nonetheless, methods to isolate specifically the repopulating hepatocytes are inhibited by a lack of cell markers, limited cell numbers, and the fragility of these cells. The development of translating ribosome affinity purification (TRAP) technology in conjunction with the Fah-/- mouse model to recapitulate repopulation in the setting of liver injury allows gene expression profiling of the repopulating hepatocytes. With TRAP, cell type-specific translating mRNA is rapidly and efficiently isolated. We developed a method that utilizes TRAP with affinity-based isolation of translating mRNA from hepatocytes that selectively express the green fluorescent protein (GFP)-tagged ribosomal protein (RP), GFP:RPL10A. TRAP circumvents the long time period required for fluorescence-activated cell sorting that could change the gene expression profile. Furthermore, since only the repopulating hepatocytes express the GFP:RPL10A fusion protein, the isolated mRNA is devoid of contamination from the surrounding injured hepatocytes and other cell types in the liver. The affinity-purified mRNA is of high quality and allows downstream PCR- or high-throughput sequencing-based analysis of gene expression.

Translating ribosome affinity purification (TRAP) enables rapid and efficient isolation of cell type-specific translating mRNA. Here, we demonstrate a method that combines hydrodynamic tail-vein injection in a mouse model of liver repopulation and TRAP to examine the expression profile of repopulating hepatocytes.

Zelltypspezifische Gene Expression Profiling in der Mausleber

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

Isolierung und Charakterisierung von primären Leber-Sinus-Endothelzellen der Maus

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Human Liver Microphysiological System for Assessing Drug-Induced Liver Toxicity In Vitro

DILI is a major cause of attrition in drug development with over 1000 FDA-approved drugs known to potentially cause DILI in humans. Unfortunately, DILI is often not detected until drugs have reached clinical stages, risking patients' safety and leading to substantial losses for the pharma industry. Taking into account that standard 2D models have limitations in detecting DILI it is essential to develop in vitro models that are more predictive to improve data translatability. To understand causality and mechanistic aspects of DILI in detail, a human liver MPS consisting of human primary liver parenchymal and non-parenchymal cells (NPCs) and cultured in 3D microtissues on an engineered scaffold under perfusion has been developed. Cryopreserved primary human hepatocytes (PHHs) and Kupffer cells (HKCs) were cocultured as microtissues in the MPS platform for up to two weeks, and each compound of interest was repeatably dosed onto liver microtissues at seven test concentrations for up to four days. Functional liver-specific endpoints were analyzed (including clinical biomarkers such as alanine aminotransferase, ALT) to evaluate liver function. Acute and chronic exposure to compounds of various DILI severities can be assessed by comparing responses to single and multi-dosed microtissues. The methodology has been validated with a broad set of severe and mildly hepatotoxic compounds. Here we show the data for pioglitazone and troglitazone, well-known hepatotoxic compounds withdrawn from the market for causing liver failures. Overall, it has been shown that the liver MPS model can be a useful tool to assess DILI and its association with changes in hepatic function. The model can additionally be used to assess how novel compounds behave in distinct patient subsets and how toxicity profiles may be affected by liver disease states (e.g., viral hepatitis, fatty liver disease).

Human Liver Microphysiological System for Assessing Drug-Induced Liver Toxicity In Vitro

Drug-induced liver injury (DILI) is a major cause of drug failure. A protocol has been developed to accurately predict the DILI liability of a compound using a liver microphysiological system (MPS). The liver model uses the coculture of primary hepatic cells and translationally relevant endpoints to assess cellular responses to treatment.

Mikrophysiologisches System der menschlichen Leber zur Beurteilung der medikamenteninduzierten Lebertoxizität in vitro

DILI is a major cause of attrition in drug development with over 1000 FDA-approved drugs known to potentially cause DILI in humans. Unfortunately, DILI is ...

Novel In Vivo Micro-Computed Tomography Imaging Techniques for Assessing the Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a growing global health issue, and the impact of NAFLD is compounded by the current lack of effective treatments. Considerable limiting factors hindering the timely and accurate diagnosis (including grading) and monitoring of NAFLD, as well as the development of potential therapies, are the current inadequacies in the characterization of the hepatic microenvironment structure and the scoring of the disease stage in a spatiotemporal and non-invasive manner. Using a diet-induced NAFLD mouse model, we investigated the use of in vivo micro-computed tomography (CT) imaging techniques as a non-invasive method to assess the progression stages of NAFLD, focusing predominantly on the hepatic vascular network due to its significant involvement in NAFLD-related hepatic dysregulation. This imaging methodology allows for longitudinal analysis of liver steatosis and functional tissue uptake, as well as the evaluation of the relative blood volume, portal vein diameter, and density of the vascular network. Understanding the adaptations of the hepatic vascular network during NAFLD progression and correlating this with other ways of characterizing the disease progression (steatosis, inflammation, fibrosis) using the proposed method can pave the way toward the establishment of new, more efficient, and reproducible approaches for NAFLD research in mice. This protocol is also expected to upgrade the value of preclinical animal models for investigating&#160;the development of novel therapies against disease progression.

Novel In Vivo Micro-Computed Tomography Imaging Techniques for Assessing the Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease

Using a diet-induced non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) mouse model, we describe the use of novel in vivo micro-computed tomography imaging techniques as a non-invasive method to assess the progression stages of NAFLD, focusing predominantly on the hepatic vascular network due to its significant involvement in NAFLD-related hepatic dysregulation.

Neuartige In-vivo-Mikro-Computertomographie-Bildgebungsverfahren zur Beurteilung des Fortschreitens der nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung