Name: in vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion
Uploaded: 2011-11-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 35 s
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Wir möchten Dr. Paul Weigel an der Univ danken. of Oklahoma für den Einsatz des monoklonalen Antikörpers 30 für Erkennung der HARE/Stabilin-2 Rezeptor und Janet Weigel für ihre technische Unterstützung. Diese Forschung wird von University of Nebraska-Forschungsgelder finanziert.

1. Excision der Leber (übernommen von PO Seglen 12 und R. Blomhoff 13 mit Modifikationen 14,15) <ol><li> Fügen Sie 10 ml 30% Isofluran in Polyethylenglykol in eine Petrischale in einem geschlossenen 5,5 L Kammer. Es ist optimal, 10-15 min nach der Zugabe von Isofluran auf eine stabilisierte Luft innerhalb der Kabine zu schaffen warten. </li><li> Legen Sie eine Ratte in der verschlossenen Kammer und lassen Sie es sich betäubt. Volle Auswirkungen der Narkose sind offensichtlich, wenn das Tier wird schlaff, reagiert und weist tiefe Atmung. </li><li> Platz 2 mL von Isofluran in Polyethylenglykol in einigen Wattebällchen auf den Boden einer 30 ml Spritze Rohr. </li><li> Legen Sie die Ratte auf dem Rücken auf einer Windel bedeckt, und bewahren Sie die Spritze Rohr über die Schnauze. </li><li> Unmittelbar bestätigen tiefe Narkose durch Benetzung des Bauches mit 70% Ethanol. Lassen Sie sich nicht das Tier von Isofluran Überdosis sterben. </li><li> Mit Bandage Scheren und Zangen, setzen die gesamte abdominal Hohlraum. </li><li> Suchen Sie die Pfortader und mit einer Pinzette ziehen zwei Stränge der chirurgischen Seide oder Polyester Faden (Ligatur) unter der Pfortader unmittelbar oberhalb der mesenterialen Branche. </li><li> Ziehen Sie die Zange und Krawatte ein loses Überhandknoten. </li><li> Mit einer Pinzette unter die Pfortader und vorsichtig wieder zu begradigen die Vene, kanülieren die Vene mit einer Insyte Autoguard Katheter (18 GA, 1,3 x 300 mm, BD Biosciences) oder ähnliche Katheter. Der Katheter sollte einige mm über der Schleife durch das Gewinde geformt gehen. </li><li> Einfahren und entfernen Sie die Nadel durch die Freigabe der federbelastete Trigger auf dem Katheter. Blut sollte beginnen sickern bis in den Katheter der Angabe der richtigen Ligatur Platzierung. </li><li> Ziehen Sie die Überhandknoten und sichern Sie es mit einem anderen Überhandknoten. </li><li> Sever entweder die untere Hohlvene oder absteigenden Aorta (Aorta abdominalis), damit Blut aus dem Kreislaufsystem abtropfen lassen. </li><li> Begin Spülung der Leber mit sauerstoffreichemTBS bei 37 ° C, um das Blut (Blanchieren) bei einer Flussrate von 20 ml / min zu entfernen. Die Leber sollte von einem rötlich-violett zu einem Lehm verfärben. </li><li> Während die Leber Spülung, Verbrauchssteuern der Leber durch das Wegschneiden des GI-Trakts und des Bindegewebes. Es ist wichtig, nicht auf die Leber oder Punktion der Glisson&#39;sche Kapsel zerreißen. </li><li> Legen Sie die Leber auf einem Kunststoff-Netz über einen Trichter, Puffern gesammelt und rückgeführt werden können. Puffer an dieser Stelle sollte nicht zurückgeführt werden, sondern fließen in den Abfall Becher. Die Spülung sollte nicht länger als 10 min. (Abb. 2A). Bereiten Sie die Endozytose Lösung in Schritt 2.1 erforderlich. </li></ol> 2. Die Internalisierung von 125 I-SA-b-Hep (oder einem anderen geeigneten markierten Liganden) <ol><li> Um 50 mL RPMI-Medium in einem kleinen Becherglas, bis zu einer Endkonzentration 0,05% BSA und 0,01 mCi 125 I-SA-b-Hep oder anderen entsprechend markierten Liganden für Endozytose hinzuzufügen. </li><li> Bringen Sie diesen Becher auf die Apparatus für Sauerstoffzufuhr zu ermöglichen. </li><li> Schalten Sie die Pumpe, schalten Sie den Zulaufschlauch und dann an der Pumpe drehen bei 20 mL / min. </li><li> Wie die Bezeichnung RPMI Ansätze der Leber, schalten Sie die Pumpe und lassen überschüssige Flüssigkeit in den Trichter und Schlauch abtropfen lassen. </li><li> Setzen Sie den Ablaufschlauch in die Medien Becherglas Rückführung von markierten Medien ermöglichen und starten Sie dann die Pumpe. </li><li> Lassen Flüssigkeiten durch die Leber nicht mehr als 1 Stunde umwälzen. </li><li> Während dieser Verinnerlichung Schritt sicher, dass die Temperatur in der Leber ist stabil durch Abdecken und bereiten die Kollagenase für die Verdauung. </li></ol> 3. Die Verdauung der Leber durch Kollagenaseverdau <ol><li> Frisch gelöst und filtriert (0,45 um) Kollagenase (100 mg / kg Ratte Gewicht) sollte hinzugefügt werden, um 2 in einem Gesamtvolumen von nicht zu 60 mL bei 37 ° C übersteigen Buffer werden Die Lautstärke ist abhängig von der Länge / Innenvolumen des Rohrs und sollte entsprechend angepasst werden. </li><li> Stoppen Sie die Pumpe und den Austausch derZulaufschlauch aus der Medien-Becher auf die TBS. </li><li> Flush in der Leber für 2 min bei 50 mL / min, die zum Lösen der desmosomalen Zellkontakte, die Calcium-abhängig sind erlaubt. </li><li> Während die Leber Spülung, den Austausch der Medien Becherglas mit der Becher mit Kollagenase auf das Gerät. </li><li> Unmittelbar nach dem Spülen, beginnen die Verdauung mit Kollagenase in einem Kreislauf Schleife bei einer Flussrate von 20 ml / min für bis zu 15 min. Da Kollagenase Chargen von Lot-Nummer ändern, müssen Schwankungen in der Menge und der Zeit der Verdauung, für jede neue Charge von Kollagenase optimiert werden. Collagenase ist auch Calcium-abhängig. Schalten Sie die Pumpe und die Schalter der Puffer-und Gasleitungen von Flask A bis Flask B. Übertragung des Abwassers Linie von den Abfallbehälter zu Flask B (Abb. 2B). </li><li> Stoppen Sie die Pumpe, entfernen Sie den Katheter und den Transfer der Leber zu einer Schale mit 20-30 mL Puffer 1. </li><li> Ziehen Sie die Glisson&#39;sche Kapsel der Leber und schütteln Sie die Zelles in der Flüssigkeit. </li><li> Da die Flüssigkeit trübt sich mit zellulären Material, übertragen Sie die Zellen durch ein 100 um Sieb durch Filtration durch ein 30 um Maschenweite und dann in eine 50 ml konischen auf Eis. </li><li> Fügen Sie weitere Puffer 1 für die Leber und weiter Schütteln Zellen aus der Leber-Matrix, die Übertragung der Flüssigkeit auf die Siebe und konisch. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte von 3,7 bis 3,9, bis keine Zellen mehr mit vertretbarem Schütteln der Leber verdrängt werden. </li></ol> 4. Hepatozyten und SEC Reinigung <ol><li> Zentrifugieren Sie die 50 ml konische enthaltenden Zellen bei 150 xg für 3 min. Zum Pelletieren der Hepatozyten. </li><li> Die Flüssigkeit enthaltende Fraktion nicht Parenchymzellen an die frische 50 ml konische auf Eis. </li><li> Waschen Sie den Hepatozyten werden Resuspendieren des Pellets in Puffer 3 und wiederholen Sie die Schritte 4.1 und 4.2 noch dreimal. </li><li> Am Ende des wäscht, werden die Pellets ≥ 97% reinem Hepatozyten. Um die SECS, Zentrifuge alle Rohre containing gebündelt Überstand (enthält Blutstammzellen, SECS, und KCS und einige kleine Hepatozyten) bei 200 xg für 10 min. bei 4 ° C. </li><li> Saugen Sie den Puffer und resuspendieren alle Pellets in 5 ml RPMI / BSA bei 4 ° C. </li><li> Pool der Zellen zusammen in 2 Röhren und fügen RPMI / BSA bis zu einem Volumen von 35 mL. </li><li> Zentrifugieren Sie die konische bei 100 xg für 3 min. </li><li> Sammeln Sie die Top 25 ml Flüssigkeit aufnehmen und in sauberen 50 ml konischen. </li><li> Das Pellet in den restlichen 10 mL Medien und fügen Sie wieder 25 ml kaltem RPMI / BSA und Zentrifuge bei 100 xg für 3 min. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.8 und 3.9 noch einmal, verwerfen das Zellpellet und unteren 10 mL Medien. </li><li> Zentrifugieren Sie die Überstände an Pellet SECS, KCS, und HSCs bei 200 xg für 10 min. bei 4 ° C. </li><li> Bereiten Sie drei 50-ml-Röhrchen mit 20 ml 25% Percoll in PBS auf Eis. Unterlage mit 15 mL 50% Percoll in jeder Röhre. </li><li> Resuspendieren der Zellpellets in einem Gesamtvolumen von 30 mL RPMI / BSA. </li><li> Sorgfältig Overlay each Steigung mit 10 ml Zellen und Zentrifuge bei 900 xg für 20 min bei 4 ° C. </li><li> SECs und KCS haben sehr enge Auftrieb Dichten und sind an der 25/50%-Schnittstelle. HSK sind in der Regel bei 25% / media aufgrund ihrer höheren Auftrieb als Lipid speichernden Zellen-Schnittstelle. Alle verbleibenden Hepatozyten und Blutzellen der unteren Auftriebskräfte und pelletiert. Absaugen von oben nach unten in der Nähe der 25/50%-Schnittstelle und entsorgen Sie dieses Materials. </li><li> Sammeln Sie die Zellen in der 25/50%-Schnittstelle und den Transfer zu einem neuen konischen mit kaltem RPMI. Das endgültige Volumen sollte ca. 40 ml zu verdünnen die Percoll werden. </li><li> Centrifuge den konischen bei 350 xg für 10 min bei 4 ° C die Zellen zu pelletieren. </li><li> Resuspendieren der Zellen in ~ 10 mL vorgewärmtes RPMI mit 100 U / mL Penicillin/100 g / ml Streptomycin und Platz Zellen in einer Säure-gewaschene Glas Petrischale oder Kristallisierschale. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen für 15 min. bei 37 ° C in einem Gewebekultur-Inkubator. </li><li> Rock oder schwenken Sie die Platte ein wenigund dann sammeln die SECs im Überstand. Die KCS auf das Glas viel schneller als SECs halten. Alternativ können SECs aus KCS durch immunopurification mit anti-CD31 oder anti-Stabilin2/HARE Antikörpern, konjugiert an magnetische Kügelchen getrennt werden. </li><li> Die Lebensfähigkeit und Zellzahl kann durch Trypanblau-Ausschluss mit einem Hämazytometer oder mit einem automatisierten Zelle Zähler beurteilt werden. </li><li> Kultur der SECs auf Fibronektin-beschichteten Plastikschalen bei 37 ° C, 5% CO 2, RPMI/0.25% BSA mit 40 ng / mL VEGF, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin oder mit Hepatozyten-konditionierten Medien. </li><li> Hepatozyten, KCS, und SECs kann für die Internalisierung des markierten Materials beurteilen durch die Verwendung eines Gamma-Counter und Normalisierung zu gesamten zellulären Proteins oder durch Mikroskopie (wenn fluoreszenzmarkierten) mit diesen Kultivierungsverfahren. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Hepatocyte Reinigung ist ≥ 97% und SEC Reinigung TypikVerbündeter ≥ 95% mit dieser Methode. Excision der Bauchhöhle, Kanülierung der Pfortader und Blanchieren der Leber alle sollten innerhalb einer Minute für die besten Ergebnisse auftreten. HARE/Stabilin-2 ist ein spezifischer Rezeptor auf Leber SECs und nicht in andere Leber Zelltypen exprimiert. In diesem Beispiel wurden Zelllysate beider Hepatozyten und SECs um 5% SDS-PAGE getrennt und sondiert mit einem monoklonalen Antikörper gegen beide Isoformen von Stabilin-2 (Abb. 3). Unfraktioniertem Heparin in die Blutbahn injiziert wird von der Leber 16 gelöscht. Die Clearance ist in erster Linie von der Leber SECs im Gegensatz zu Hepatozyten und KC 17 durchgeführt. Die Stabilin-2/HARE Rezeptor ist die wichtigste Spiel-Rezeptor bindet und internalisiert in SECs 18 Heparin. In unserem Beispiel hier, beschriftet wir Heparin mit einer Biotin-Tag auf der Carboxylatgruppe von GlcNAc / NS. Die Biotin konjugiert mit jodhaltigen Streptavidin zum Nachweis von Heparin verinnerlicht proteoglycan. Injektion des markierten Heparin gefolgt von Ausbluten 30 Minuten nach der Injektion ermöglicht es uns, zu überwachen, welche Organe diese Form von Heparin zu verinnerlichen. In dieser kurzen Zeitspanne ist die Leber das primäre Organ-Clearance (Abb. 4). Um besser zu verstehen, welcher Zelltyp verantwortlich für die Freigabe ist, haben wir 125 I-SA-b-Hep zu RPMI-Medium mit 0,05% BSA ergänzt und erlaubt es durch die Leber für 20 min zirkulieren. Nach Kollagenaseverdau und zellulären Reinigung wird die überwiegende Mehrheit der markierten Heparin durch SECs im Gegensatz zu Hepatozyten (Abb. 5) verinnerlicht. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Grundlegende Leber-Architektur. SECs bilden die Wände der Sinusoide und sind in der Regel gefenstert (kleine Cluster von Kreisen). Sternzellen (HSC) sind im Raum der Disse im Gegensatz zu Kupffer c gefundenEllen (KCS), die normalerweise in der Mikrovaskulatur der Sinusoide vorhanden sind. Hepatozyten besetzen die andere Seite des Raums der Disse. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Schematische Darstellung des Perfusionsapparatur. A) Set-up des Geräts während der Spülung / Waschen der Sinusoide der Leber. TBS ist in einer 1 L Flasche. B) Ein 125 ml Kolben mit ~ 60 ml Puffer 2 mit Kollagenase ist für die Verdauung der Leber in einem geschlossenen Kreislauf verwendet. Das Abwasser Leitung ist auch aus dem Abfallbehälter zu Kolben B durch eine Kerbe in den Gummistopfen geändert. Der Sauerstoff-Leitung ist nicht in den Puffer mit Kollagenase (Kolben B) Schaumbildung zu vermeiden untergetaucht. Die Anschläge auf jeder Flasche sind eingekerbt, um eine effiziente Übertragung der Abwasser Linie zu ermöglichen und zu einem erhöhten Druck aus dem Sauerstoff zu verhindern. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. </strong&gt; Hepatocyte Präparate sind nicht mit SECs kontaminiert. Gleiche Mengen von Zelllysaten aus gereinigten Chargen von Hepatozyten (Spur 1) und Sekunden (Spur 2) wurden um 5% SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrocellulose geblottet. Monoklonale Antikörper # 30, das spezifisch gegen beide Isoformen (315 kDa und 190 kDa) von HARE/Stabilin-2 wurde verwendet, um die Lysate Sonde. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4. Vertrieb von markiertem Heparin in Organen. Die Ratten wurden über die laterale Schwanzvene mit 125 I-SA-b-hep warten Sie 30 Minuten injiziert und dann verblutet. Das Blut wurde aufgefangen, so dass nicht alle Organe künstlich hoch Lesungen geben. Counts pro Minute (CPM) von jedem Organ gegen das Gewicht der Orgel in g normalisiert. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig5.jpg" alt="Abbildung 5"/> Abbildung 5. Menge an markiertem Heparin in Hepatozyten und Sekunden. RPMIch Medien mit 125 I-SA-b-Hep durfte durch eine intakte Leber für 20 min durch Kollagenaseverdau und zellulären Reinigung gefolgt zirkulieren. Gleiche Mengen von Hepatozyten und SEC Zellproteins Lysate wurden mit dem Bradford-Assay quantifiziert und zählte mit einem Gamma-Counter. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig6.jpg" alt="Abbildung 6"/> Abbildung 6. Kupffer-Zellen werden aus SECs durch Adhäsion auf Glas getrennt. Die Zellen wurden in einer Säure-gewaschene Glas Kristallisierschale gegeben und man ließ sie für 15 min bei 37 ° C einzuhalten, 5% CO 2. Der Überstand mit nicht eingehalten Zellen wurde sanft geschwenkt und in ein Zentrifugenröhrchen. Lysate von beiden eingehalten Zellen auf Glas (Spur 1) und aus nicht-anhaftenden Zellen (Spur 2) wurden von 8% SDS-PAGE aufgetrennt, geblottet und sondiert mit einem Antikörper gegen CD163, die spezifisch für den Kupffer-Zellen ist. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig7.jpg" alt="Abbildung 7"/> Abbildung 7. SECs auf Fibronektin beschichteten Kunststoff verchromt 6-Well-Schalen wurden über Nacht in RPMI inkubiert ergänzt mit 0,1% BSA. Phasenkontrast-Bilder wurden bei (A) 100x und (B) 200x Vergrößerung.

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Commun. 218, 314-319 (1996).</li><li>Duryee, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+is+a+cofactor+for+malondialdehyde-acetaldehyde+adduct-mediated+cytokine/chemokine+release+by+rat+sinusoidal+liver+endothelial+and+Kupffer+cells.">Lipopolysaccharide is a cofactor for malondialdehyde-acetaldehyde adduct-mediated cytokine/chemokine release by rat sinusoidal liver endothelial and Kupffer cells.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 28, 1931-1938 (2004).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Anästhesie der Ratte durch die hängenden Tropfen Methode, bei der Isofluran-Dampf verursacht Bewusstlosigkeit ist die bevorzugte Methode für unsere Studien. Ein Verdampfer kann auch anstelle einer Spritze mit Baumwolle, das Tier außerhalb der Kammer zu halten verwendet werden, aber die chirurgischen Eingriffe sind so schnell, es ist nicht erforderlich. Polyethylenglykol ist es, die Isofluran hinzugefügt, um den Dampfdruck und Verdunstung zu verringern. Zu viel Isofluran Dampf wird der Tod zu schnell zu induzieren. Wenn das Tier stirbt, bevor die Leber durchbohrt und blanchiert mit TBS, die Bündelung Blut Gerinnsel in der Leber und verhindern eine effiziente Reinigung der Sinusoide und Verdauung mit Kollagenase. Die Zugabe von Heparin kann nützlich sein, als Antikoagulans ist aber nicht in diesen Studien verwendet werden, da wir beschriftet Heparin als unsere Sonde verwenden. Gey-Salzlösung (GBSS) wird oft von anderen Laboratorien für die Reinigung von SECs ersetzt. Zwar ist es für SEC Reinigung, hep nützlichatocytes tolerieren keine GBSS sowie Puffer 1-3 und Bewohnbarkeit sind nicht annähernd so hoch. Bei der Messung der Endozytose, ist es ratsam, Hintergrundwerte in der Orgel und in gereinigtem Hepatozyten zu messen. Diese Methode ist eine von zwei für die effiziente Reinigung von SECs nach der Leberperfusion mit Collagenase. Die andere Methode trennt die Nicht-Parenchymzellen durch Auswaschen Zentrifugation 19 statt Percoll-Gradienten. Die Vorteile für die Verwendung von Schlämmen über Percoll Gradienten sind etwas höher Zellvitalitäten und Zahlen. Der Nachteil ist, dass Elutriation Zentrifugation eine spezielle Rotor, gewidmet Zentrifuge und Schlauchpumpe zusammen, die Zehntausende von Dollar kostet erfordert. Diese Methode erfordert nur die Verwendung einer Tischzentrifuge und Schlauchpumpe, die Standard in vielen Labors ist. Trennung von SECs und KCS durch selektive Adhäsion ist eine Standardmethode20-22. Es ist zwar richtig, dass SECs wird auf das Glas und Kunststoff haften, ist der entscheidende Punkt, um acid-washed sauberes Glas mit nicht mehr als eine 15-minütige Inkubation Verwendung bei 37 ° C bei 5% CO 2. KC wird immer haften schneller als SECs und es ist ratsam, vorsichtig waschen die KCS mit den Medien, um alle verbleibenden SECs, dass sich lose extrahieren. Pronase und andere Proteasen sind auch im Kollagenaseverdau Schritte in diesem Protokoll weggelassen, um Bewohnbarkeit der Zellen zu erhöhen. Proteasen verdauen extrazellulären Rezeptoren und kann zelluläre Adhäsion in den letzten Reinigungsschritte zu hemmen. Die hier vorgestellte Methode hat eine Vielzahl von Anwendungen. Obwohl wir das Endergebnis in dem Heparin zunächst up ist für die Abfertigung, die Durchblutung der Leber für den Erhalt von primären Hepatozyten aufgenommen wurden, zeigen, kann KC, SECS, und HSCs werden für eine Reihe von Studien, bei denen Stoffwechselwege, Immunregulation, Scavenger-Aktivitäten und andere nützliche physiologischen studies. Der schwierigste Teil dieses Verfahrens ist eine gute Zugänge, die Verdauung der Leber, und die Handhabung der Leber, ohne den Katheter gleiten aus der Pfortader.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;Buffer 1: 142 mM NaCl 6.7 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.5% BSA, pH 7.4&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Buffer 2 (perfusion buffer): 67.0 mM NaCl, 6.7 mM KCl, 4.8 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-H2O, 101.0 mM HEPES, BSA 1.5%, pH 7.4.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Buffer 3: 137 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 0.7 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1.2 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 10 mM HEPES, 1.5% BSA, pH 7.4&lt;/li&gt; &lt;li&gt;RPMI/BSA: 15g/L BSA in RPMI&lt;/li&gt; &lt;li&gt;TRIS-buffered Saline (TBS): 154 mM NaCl, 10 mM Trizma Base salt.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Collagenase: Collagenase A (#11088785103) from Roche, Collagenase Type I (#LS004691) from Worthington Biochemical or Collagenase I (#C0130) or IA (#C9891) from Sigma-Aldrich.&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;All salts are from Sigma-Aldrich&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td>20L water bath</td><td>ThermoFisher</td><td>2231</td><td>Water is about 45 &amp;deg;C to compensate for cooling within the tubing.</td></tr><tr><td>Peristaltic Pump</td><td>Cole-Parmer</td><td>7553-70</td><td>Masterflex series</td></tr><tr><td>Refrigerated Centrifuge</td><td>Sorvall</td><td>Legend XTR</td><td></td></tr><tr><td>Catheter </td><td>BD Biosciences</td><td>381444</td><td></td></tr><tr><td>Dessicator chamber</td><td>Fisher</td><td>08595E</td><td>Use internal plate</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma</td><td>P4937</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>SeraCare</td><td>AP-4510-01</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m mesh</td><td>Spectrum labs</td><td>146488</td><td></td></tr><tr><td>30 &amp;mu;m mesh</td><td>Spectrum labs</td><td>146506</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>21870</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene glycol</td><td>Spectrum labs</td><td>PO107</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion

Die Leber ist das metabolische Zentrum der Körper von Säugetieren und dient als Filter für das Blut. Die grundlegende Architektur der Leber ist in Abbildung 1, in denen mehr als 85% der Leber Masse der Hepatozyten besteht und die restlichen 15% der Zellmasse wird von Kupffer-Zellen (KCS), Sternzellen (HSC) zusammen dargestellt und Sinus-Endothelzellen (Sekunden). SECs bilden die Wände der Blutgefäße in der Leber und enthalten spezielle Morphologie genannt fenestrae in in das Zytoplasma. Fenestration des Cytoplasmas ist das Auftreten von Bohrungen (~ 100 Mikrometer) innerhalb der Zellen, so dass die SECs wirken wie ein Sieb, in dem die meisten Chylomikronen, Chylomikronen Reste und Makromolekülen, nicht aber Zellen, bis hin zu den Hepatozyten und HSCs 1 (Abb. Pass 1). Durch das Fehlen einer Basalmembran, bilden die Lücke zwischen den SECs und Hepatozyten the Space of Disse. HSCs besetzen diesen Platz und spielen eine herausragende Rolle bei der Regulierung und der Reaktion auf injury, Lagerung von Retinsäure und Immunregulation in der Leber 2. SECs gehören zu den endocytically aktiven Zellen des Körpers die Anzeige einer Reihe von Scavenger-Rezeptoren auf ihrer Zelloberfläche Oberfläche 3. Dazu gehören SR-A, Stabilin-1 und Stabilin-2. Generell sind kleine Kolloidteilchen weniger als 230 nm und Makromolekülen in Puffer-Phase von SECs genommen, während große Partikel und Zelltrümmer durch Endozytose (phagozytiert) von KC 4. So wird der Großteil Clearance von extrazellulären Material wie die Glykosaminoglykane aus dem Blut weitgehend abhängig von der Gesundheit und endocytischen Funktionen SECs 5,6. Zum Beispiel ist ein Anstieg im Blut Hyaluronsäure Ebenen Anzeichen für Lebererkrankungen leichten bis schweren Klassen 7. Mit Ausnahme von einem Bericht 8, gibt es keine verewigt SEC-Zelllinien in der Existenz. Auch dieser immortalisierten Zelllinie ist de-differenziertenEINZELNEN SEKTOREN in, dass es nicht ausdrücken Scavenger-Rezeptoren, die derzeit auf primären SECs (unsere Daten nicht gezeigt). Alle zellbiologischen Studien müssen auf Primärzellen frisch vom Tier stammen, durchgeführt werden. Leider dedifferenzieren SECs unter Standard-Kulturbedingungen und muss innerhalb von 1 oder 2 Tage nach Isolierung aus dem Tier eingesetzt werden. Differenzierung von SECs ist durch die Expression von Stabilin-2 oder Hasen-Rezeptor 9, CD31, und das Vorhandensein von zytoplasmatischen fenestration 1 gekennzeichnet. Differenzierung von SECs kann durch die Zugabe von VEGF in Kulturmedien oder durch Kultivierung von Zellen in Hepatozyten konditionierten Medium 10,11 ausgedehnt werden. In diesem Bericht werden wir die Endozytose-Aktivität von SECs im intakten Organ demonstrieren mit radioaktiv markiertem Heparin für Hyaluronan für die SEC-spezifischen Stabilin-2-Rezeptor. Wir werden dann zu reinigen Hepatozyten und Sekunden aus dem perfundierten Leber Endozytose zu messen.

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In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

Das Studium der Leber sinusförmige Endothelzellen (SECS) muss mit primären Zellen aus dem Tier erhalten, da keine Zelllinien existieren durchgeführt werden. Diese Methode basiert auf Leber Verdauung und differentielle Zentrifugation für SEC Reinigung für nachfolgende Kultivierung und Experimentieren.

In vivo Leber Endozytose durch Reinigung von Leberzellen durch Leberperfusion Gefolgt

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

19.0K Aufrufe.  University of Nebraska, Lincoln. Das Studium der Leber sinusförmige Endothelzellen (SECS) muss mit primären Zellen aus dem Tier erhalten, da keine Zelllinien existieren durchgeführt werden. Diese Methode basiert auf Leber Verdauung und differentielle Zentrifugation für SEC Reinigung für nachfolgende Kultivierung und Experimentieren.

Serie: In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for culturing or for obtaining cell lysates. In this protocol, the portal vein is used as the site for catheterization, rather than the vena cava, as this limits contamination of other possible cell types in the final liver preparation. No special instrumentation is required throughout the procedure. A water bath is used as a source of heat to maintain the temperature of all the buffers and solutions. A standard peristaltic pump is used to drive the fluid, and a refrigerated table-top centrifuge is required for the centrifugation procedures. The only limitation of this technique is the placement of the catheter within the portal vein, which is challenging on some of the mice in the 18 - 25 g size range. An advantage of this technique is that only one vein is utilized for the perfusion and the access to the vein is quick, which minimizes ischemia and reperfusion of the liver that reduces hepatic cell viability. Another advantage to this protocol is that it is easy to distinguish live from dead hepatocytes by eyesight due to the difference in cellular density during the centrifugation steps. Cells from this protocol may be used in cell culture for any downstream application as well as processed for any biochemical assessment.

The goal of this protocol is to obtain high viability and high yield of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from liver. This is accomplished by perfusing the liver with a type IV collagenase solution via the portal vein, followed by differential centrifugation to obtain hepatocytes and sinusoidal endothelial cells.

Reinigung von Hepatozyten und sinusförmigen Endothelzellen aus Maus Leber Perfusion

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Forschung

Biochemie

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in cell-to-cell communication by shuttling bioactive molecules such as RNA or protein from one cell to another. Most studies of EVs have been performed in cell culture models or in EVs isolated from body fluids. There is emerging interest in the isolation of EVs from tissues to study their contribution to physiological processes and how they are altered in disease. The isolation of EVs with sufficient yield from tissues is technically challenging because of the need for tissue dissociation without cellular damage. This method describes a procedure for the isolation of EVs from mouse liver tissue. The method involves a two-step process starting with in situ collagenase digestion followed by differential ultra-centrifugation. Tissue perfusion using collagenase provides an advantage over mechanical cutting or homogenization of liver tissue due to its increased yield of obtained EVs. The use of this two-step process to isolate EVs from the liver will be useful for the study of tissue EVs.

This is a protocol to isolate tissue extracellular vesicles (EVs) from the liver. The protocol describes a two-step process involving collagenase perfusion followed by differential ultracentrifugation to isolate liver tissue EVs.

Isolierung von Gewebe extrazellulären Vesikeln aus der Leber

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Ex Vivo Hepatic Perfusion Through the Portal Vein in Mouse

Metabolic diseases such as diabetes, pre-diabetes, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), and nonalcoholic steatohepatitis (NASH) are becoming increasingly common. Ex vivo liver perfusions allow for a comprehensive analysis of liver metabolism using nuclear magnetic resonance (NMR), in nutritional conditions that can be rigorously controlled. As in silico simulations remain a primarily theoretical means of assessing hormone actions and the effects of pharmaceutical intervention, the perfused liver remains one of the most valuable test beds for understanding hepatic metabolism. As these studies guide basic insights into hepatic physiology, results must be accurate and reproducible. The greatest factor in the reproducibility of ex vivo hepatic perfusion is the quality of surgery. Therefore, we have introduced an organized and streamlined method to perform ex vivo mouse liver perfusions in the context of in situ NMR experiments. We also describe a unique application and discuss common issues encountered in these studies. The overall purpose is to provide an uncomplicated guide to a technique we have refined over several years that we deem the golden standard for obtaining reproducible results in hepatic resections and perfusions in the context of in situ NMR experiments. The distance to the center of the field for the magnet as well as the inaccessibility of the tissue to intervention during the NMR experiment makes our methods novel.

Ex Vivo Hepatic Perfusion Through the Portal Vein in Mouse

The protocol describes a straightforward method of resectioning an intact mouse liver for metabolic studies through portal vein perfusion.

Ex vivo Leberperfusion durch die Portalader in der Maus

Metabolic diseases such as diabetes, pre-diabetes, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), and nonalcoholic steatohepatitis (NASH) are becoming ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. As such, hepatocytes are an important model for a large variety of research questions. In particular, the use of human hepatocytes is especially important in the fields of pharmacokinetics, toxicology, liver regeneration and translational research. Thus, this method presents a modified version of a two-step collagenase perfusion procedure to isolate hepatocytes as described by Seglen 1.
Previously, hepatocytes have been isolated by mechanical methods. However, enzymatic methods have been shown to be superior as hepatocytes retain their structural integrity and function after isolation. This method presented here adapts the method designed previously for rat livers to human liver pieces and results in a large yield of hepatocytes with a viability of 77&plusmn;10%. The main difference in this procedure is the process of cannulization of the blood vessels. Further, the method described here can also be applied to livers from other species with comparable liver or blood vessel sizes.

A modified two-step collagenase perfusion procedure for isolation of human hepatocytes is described. This method can also be applied to other mammalian livers. The isolated hepatocytes are available in high yield and viability, making them a suitable model for scientific research in areas such as liver regeneration, pharmacokinetics and toxicology.

Isolierung von humanen Hepatozyten durch eine Zwei-Schritt-Verfahren Collagenase Perfusion

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Biologie

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic Stellate cells (HSC). Two-dimensional (2D) culture of primary human hepatocyte (PHH) is still considered as the &#34;gold standard&#34; for in vitro testing of drug metabolism and hepatotoxicity. It is well-known that the 2D monoculture of PHH suffers from dedifferentiation and loss of function. Recently it was shown that hepatic NPC play a central role in liver (patho-) physiology and the maintenance of PHH functions. Current research focuses on the reconstruction of in vivo tissue architecture by 3D- and co-culture models to overcome the limitations of 2D monocultures. Previously we published a method to isolate human liver cells and investigated the suitability of these cells for their use in cell cultures in Experimental Biology and Medicine1. Based on the broad interest in this technique the aim of this article was to provide a more detailed protocol for the liver cell isolation process including a video, which will allow an easy reproduction of this technique.
Human liver cells were isolated from human liver tissue samples of surgical interventions by a two-step EGTA/collagenase P perfusion technique. PHH were separated from the NPC by an initial centrifugation at 50 x g. Density gradient centrifugation steps were used for removal of dead cells. Individual liver cell populations were isolated from the enriched NPC fraction using specific cell properties and cell sorting procedures. Beside the PHH isolation we were able to separate KC, LEC and HSC for further cultivation.
Taken together, the presented protocol allows the isolation of PHH and NPC in high quality and quantity from one donor tissue sample. The access to purified liver cell populations could allow the creation of in vivo like human liver models.

A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

Protokoll für die Isolierung von primären humanen Hepatozyten und entsprechende Hauptpopulationen von Nicht-parenchymale Leberzellen

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on different needs, like time, labor, cost, and primary hepatocyte usage, resulting in various primary hepatocyte isolation protocols. However, the numerous steps and time-consuming reagent preparations in primary hepatocyte isolation are major drawbacks for efficiency. After comparing different protocols for their pros and cons, the advantages of each were combined, and a rapid and efficient primary hepatocyte isolation protocol was formulated. Within only ~35 min, this protocol could yield as much, if not more, healthy primary hepatocytes as other protocols. Further, glucose metabolism experiments performed using the isolated primary hepatocytes validated the usefulness of this protocol in in vitro liver metabolism studies. We also extensively reviewed and analyzed the significance and purpose of each step in this study so that future researchers can further optimize this protocol based on needs.

Primary hepatocytes are a valuable tool to study liver response and metabolism in vitro. Utilizing commercially available reagents, an improved time- and labor-efficient protocol for mouse primary hepatocyte isolation was developed.

Ein verbessertes zeit- und arbeitseffizientes Protokoll für die primäre Hepatozytenisolierung der Maus

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on ...

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure for primary hepatocyte isolation is technically challenging, especially in portal vein cannulation. The procedure is also prone to occasional contamination and variations in perfusion conditions due to difficulties in the assembly, optimization, or maintenance of the perfusion setup. Here, a detailed protocol for an improved two-step collagenase perfusion procedure with multiparameter perfusion control is presented. Primary rat hepatocytes were successfully and reliably isolated by taking the necessary technical precautions at critical steps of the procedure, and by reducing the operational difficulty and mitigating the variability of perfusion parameters through the adoption of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control, and real-time monitoring and alarm system. The isolated primary rat hepatocytes consistently exhibit high cell viability (85%-95%), yield (2-5 x 108 cells per 200-300 g rat) and functionality (albumin, urea and CYP activity). The procedure was complemented by an integrated perfusion system, which is compact enough to be set up in the laminar flow hood to ensure aseptic operation.

This protocol details the use of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control complemented by real-time monitoring, and an alarm system for two-step collagenase perfusion procedure to improve the consistency in the viability, yield, and functionality of isolated primary rat hepatocytes.

Isolierung primärer Rattenhepatozyten mit Multiparameter-Perfusionskontrolle

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

Isolierung und Charakterisierung von primären Leber-Sinus-Endothelzellen der Maus

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Nichtinvasive intraokulare in vivo Bildgebung von transplantierten Lebersphäroiden bei Mäusen

In Vivo Imaging of Liver Spheroids Engrafted in the Anterior Chamber of the Mouse Eye

Biomedical studies of the liver in mammals are hindered by the lack of methods for in vivo noninvasive longitudinal imaging at cellular resolution. Until now, optical imaging of the liver in situ is possible by intravital imaging, which offers high-resolution imaging at the cellular level but cannot be performed multiple times and, therefore, longitudinally in the same animal. Noninvasive imaging methods, such as bioluminescence, allow repeated imaging sessions on the same animal but do not achieve cell resolution. To address this methodology gap, we have developed a platform for noninvasive in vivo imaging of liver spheroids engrafted in the anterior chamber of the mouse eye. In the workflow described in this study, primary mouse liver spheroids are generated in vitro and transplanted into the anterior chamber of the eye of recipient mice, where they engraft on the iris. The cornea acts as a natural body window through which we can image the engrafted spheroids by conventional confocal microscopy. The spheroids survive for months in the eye, during which the cells can be studied in contexts of health and disease, as well as being monitored in response to different stimuli over repeated imaging sessions using appropriate fluorescent probes. In this protocol, we provide a breakdown of the necessary steps to implement this imaging system and explain how to best harness its potential.

Autor im Rampenlicht: Nutzung von Mausaugenkammern für nicht-invasive Leber-Sphäroid-Studien

Here, we describe a platform that allows noninvasive in vivo imaging of liver spheroids engrafted in the anterior chamber of the mouse eye. The workflow spans from generating spheroids from primary liver cells to transplantation into the mouse eye and in vivo imaging at cellular resolution by confocal microscopy.

In-vivo-Bildgebung von Lebersphäroiden, die in die vordere Kammer des Mausauges transplantiert wurden

Biomedical studies of the liver in mammals are hindered by the lack of methods for in vivo noninvasive longitudinal imaging at cellular resolution. Until ...

In vivo Leber Endozytose durch Reinigung von Leberzellen durch Leberperfusion Gefolgt

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Reinigung von Hepatozyten und sinusförmigen Endothelzellen aus Maus Leber Perfusion

Isolierung von Gewebe extrazellulären Vesikeln aus der Leber

Ex vivo Leberperfusion durch die Portalader in der Maus

Isolierung von humanen Hepatozyten durch eine Zwei-Schritt-Verfahren Collagenase Perfusion

Protokoll für die Isolierung von primären humanen Hepatozyten und entsprechende Hauptpopulationen von Nicht-parenchymale Leberzellen

Ein verbessertes zeit- und arbeitseffizientes Protokoll für die primäre Hepatozytenisolierung der Maus

Isolierung primärer Rattenhepatozyten mit Multiparameter-Perfusionskontrolle

Isolierung und Charakterisierung von primären Leber-Sinus-Endothelzellen der Maus

In-vivo-Bildgebung von Lebersphäroiden, die in die vordere Kammer des Mausauges transplantiert wurden

In-vivo-Bildgebung von Lebersphäroiden, die in die vordere Kammer des Mausauges transplantiert wurden