Diese Arbeit wurde durch eine CASS Stiftung Wissenschaft und Medizin Zuschuss unterstützt; (MB); a National Health &amp; Medical Research Council of Australia Projekt Grant (KLS, 338516); und von der Regierung von Victoria Operational Infrastructure Support Program (Australien).

1. Vorbereitung der Zellen, Medien und Reagenzien <ol><li> Herstellung von Methylcellulose-Medium, enthaltend <ol><li> Man löst 1,5 g Methylcellulose in 100 ml steriler Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) (ohne Zusätze) in einem 250 ml-Kolben. </li><li> Die Lösung wird auf Low in einer Mikrowelle für 5 min; kümmern sich um Überkochen zu vermeiden. </li><li> Sobald der Methylcellulose-Pulver ist halb gelöst, fügen Sie ein sauberes Magnetrührer und Medien, um das Volumen auf 125 ml zu nehmen. </li><li> Mischen, Invertzucker, und bei Raumtemperatur für 1,5 Stunden, gefolgt von Rühren bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Teilen Sie die Lösung gleichmäßig in vier 50 ml Zentrifugenröhrchen und für 1,5 Stunden bei 2300 x g. </li><li> Sammeln Sie die klare, hochviskose Überstand (ca. 90-95% der Aktien), aliquoten in sterile 50-ml-Röhrchen, und bei 4 ° C bis zu 3 Monate. </li></ol></li><li> Kultur und Markierung von Zellen <ol><li> Pflegen Eierstock-Krebszelllinien in Monolayer in einem tiUSGABE Kulturbrutschrank bei 37 ° C, 5% CO 2 in geeigneten Wachstumsmedium (DMEM KGN für die Zellen 17 und MCBD110: M199 für die OVCA429 und OVCA433 Zellinien 18) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L ergänzt -Glutamin und 1% Penicillin-Streptomycin. </li><li> Aufrechterhaltung LP9 menschlichen Mesothelzellen in M199: Hams F12-Medium, enthaltend 15% FBS, 10 ng / ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) und 400 ng / ml Hydrocortison, in einem Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Seed-Zellen in der gewünschten Größe und Kolben wachsen, um etwa 75% Konfluenz. Ernten der Zellen durch Trypsinierung mit 0,05% Trypsin / EDTA, Schleudern bei 186 × g für 5 min, und waschen Zellpellet zweimal mit PBS. </li><li> Zählen von Zellen mit einer Zählkammer. </li></ol></li><li> Optional Fluorescent Zellmarkierungsmethode <ol><li> Resuspendieren Krebszellen in einer Endkonzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml in 1 ml vorgewärmtem PBS/0.1% BSA. </li><li> In 2 ul 5 mM Stammzell Trace CSFE Lösung (oder einer anderen Markierung, die bevorzugte Zelle langfristig beibehalten wird), um Zellen in einer Endkonzentration von 10 uM und bei 37 ° C für 10-15 min in einem Wasserbad. </li><li> Die Reaktion wird mit 1 ml eiskaltem Medium mit 10% FBS und Wieder Pellet durch Zentrifugation. Resuspendieren in 10 ml des entsprechenden vorgewärmten Wachstumsmedium (siehe Schritt 1.2.1). </li><li> Samenzellen in einem 75 cm 2 Filter verschlossenen Kolben und die Kultur bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Check-Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop, um sicherzustellen, dass das Niveau der Fluoreszenz-Markierung zum Nachweis ausreichender ist. Sobald Zellen erreichen ca. 75% Konfluenz, Ernte und zählen wie in den Schritten 1.2.3 und 1.2.4 oben. </li></ol></li></ol> 2. Generation Spheroids in Methylcellulose <ol><li> Berechnen Sie das Volumen von Eierstockkrebszellen aus Abschnitt 1 für Sphäroid Generation benötigt (insgesamt 300.000 Zellen werden für jedes volle 96-Well-Platte Experiment erforderlich). Nichtte: Wenn mit verschiedenen Zelllinien als hier dargestellt, können die Zelldichten für einheitliche Sphäroid Generation brauchen, um für jede Zeile optimiert werden. </li><li> Zur Verdünnung der Zellen in Methylcellulose Medien zu berechnen, zunächst subtrahieren Sie den Zellvolumen erforderlich ist (Schritt 2.1) von 15 ml. </li><li> 3 ml Methylcellulose-Stammlösung (um 20% Methylcellulose endgültig) auf ein Volumen von geeigneten Kulturmedium für jede Zelllinie in Höhe von 15 ml minus des Zellvolumens und gründlich durch vorsichtiges Umdrehen mischen. </li><li> In 300.000 Zellen auf die Methylcellulose enthaltenden Medium und gründlich durch vorsichtiges Schwenken gemischt. </li><li> Pipette 150 ul der Zell / Methylcellulose / Media-Mix (für insgesamt 3000 Zellen / Vertiefung) in jede Vertiefung einer 96-Well-Kulturplatte mit konkaven und die Kultur bei 37 ° C, 5% CO 2 für 1-4 Tage oder bis eine einheitliche Sphäroiden bilden (1 Sphäroid / Vertiefung ist in der Regel beobachtet). </li></ol> 3. RTCA Zellinvasion Assays NOTE: Impedanzmessungen werden als Zellindex (CI), eine dimensionslose Kennzahl, die eine relative Änderung der gemessenen Zellenimpedanz, die die Zellstatus ausgedrückt. Für die Analyse, Import von Daten in einer Tabellenkalkulation wie Microsoft Excel. <ol><li> Plattenvorbereitung <ol><li> Arbeiten in Gruppen von 4 Vertiefungen in einer Zeit, 50 &amp;mgr; l Matrix (1:10 verdünnt in Serum-freien Kulturmedien) in jede Vertiefung der oberen Kammer einer 16-Well-Platte RTCA CIM, um sicherzustellen, dass die gesamte Oberfläche bedeckt ist . Entfernen Sie 30 ul Matrix sofort, aber langsam, zu jeder überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. </li><li> Inkubieren Platte bei 37 ° C für 4 Stunden vor der Verwendung in einem Gewebekultur-Inkubator verwendet. </li><li> Hinzufügen von 30 &amp;mgr; l serumfreiem Medium (SFM) für jeden Krebszelllinie mit der oberen Kammer und 160 ul Medium mit oder ohne Serum (nach Ihrer experimentelles Design) in die untere Kammer geeignet. </li><li> Montieren Sie den CIM-Platte, indem Sie auf die untere Kammer in die obere Kammer und equilibraß in einem 37 ° C Inkubator für 1 Stunde in einem Gewebekultur-Inkubator. </li></ol></li><li> Programmierung der RTCA Instrument <ol><li> Öffnen Sie das RTCA-Programm und wählen Sie die Registerkarte &quot;Layout&quot;. Markieren Sie alle Versuchsbrunnen. </li><li> Klicken Sie rechts auf Brunnen und wählen Sie &quot;Schalten Sie Brunnen &#39;; dann in Versuchsbedingungen und Zellennamen füllen, wie gewünscht. </li><li> Um Schritte oder Teilschritte in das Programm, wählen Sie die &quot;Schedule&quot; Registerkarte, und klicken Sie rechts auf &quot;Add a step &#39;. Der erste Schritt ist eine vorprogrammierte Hintergrund Sweep, die automatisch in das Programm aufgenommen wird einmal &quot;fügen Sie einen Schritt&quot; gewählt wird. </li><li> Geben Sie die gewünschten Programmdetails für Schritt 2 des RTCA-Programm, das bei der Gründung der LP9 Monowerte aufzeichnet. In die Zeitintervalle zwischen Impedanzmessungen indem Sie die Registerkarte &quot;Interval&quot; und Eingabe von &#39;15 min &#39;. In Versuchsdauer durch Auswahl der &#39;Dauer&#39; Register eind Eingabe einer Zeit zwischen 24.12 h. </li><li> Um weitere Schritte hinzufügen, wählen Sie die &quot;Schedule&quot; Registerkarte und klicken Sie rechts auf &quot;Hinzufügen einen Schritt &#39;und geben Details der weiteren Schritte, wie oben. Schritt 3 des RTCA-Programm wird das Instrument zu Lesungen während der Sphäroid-Invasion nehmen zu leiten; Geben &#39;5 Minuten &#39;unter dem&#39; Intervall &#39;Registerkarte und &#39;48 Stunden&#39; auf der Registerkarte &#39;Dauer&#39;. </li><li> Wählen Sie &#39;Teller&#39; in der Menüleiste und sparen. </li></ol></li><li> Generierung von LP9 Monolayer und Messung der Sphäroid-Invasion <ol><li> Zeigen CIM Platte in RTCA Instrument und offenes Programm aus Schritt 3.2. Vor der Zugabe Zellen, wählen Sie &quot;Ausführen&quot; in der Menüleiste und dann &quot;Start&quot;. Ein Hintergrund-Sweep wird automatisch durchgeführt werden (Schritt 1 in den RTCA Software-Anweisungen). </li><li> Entfernen Sie die CIM-Platte aus dem Gerät nach dem Sweep Hintergrund und in einer Gewebekultur Kapuze. </li><li> Teller 50,000 LP9 Zellen in 160 ul SFM in die obere Kammer jedes CIM Platte gut suspendiert. </li><li> Die Platte wird in der RTCA Instrument und nehmen Messwerte alle 15 Minuten während der LP9 Monolage wird über Nacht Gründung (Schritt 2 des RTCA-Programm). </li><li> Ernte Krebs Sphäroiden unter Schritt 2 &quot;Generation von Sphäroiden in Methylcellulose &#39;erzeugt, vor. <ol><li> Aseptisch, schneiden 1 mm aus der Spitze von einer 1 ml-Pipettenspitze und verwenden, um sanft und rufen Sie die Inhalte von jedem. Transfer zu einem sterilen Röhrchen. </li><li> Centrifuge Sphäroide bei 120 g für 8 min, und entfernen Methylcellulose enthaltenden Medium durch leichtes Ansaugen. </li><li> Zweimal mit PBS waschen Sphäroiden, Zentrifugieren bei 120 g für 8 min zu pelletieren Sphäroiden nach jeder Wäsche. </li><li> Für jede Versuchs gut resuspendieren insgesamt 10 Kügelchen in 160 ul Medium ohne FBS. </li><li> Pause das RTCA Experiment durch Auswahl und Kontrolle und &quot;Ausführen&quot; aus der Menüleiste# 8216; Pause. Entfernen Sie die CIM-Platte aus dem Gerät, und legen in einer Gewebekultur Kapuze. Absaugen der Medien aus jeder Vertiefung und ersetzen Sphäroid haltigen Medien (10 Kugeln in 160 ul) oder frische Medien für LP9 nur Kontrollvertiefungen. </li></ol></li><li> Bringen Sie die Platte an der RTCA Instrument. Wählen Sie &quot;Ausführen&quot; aus der Menüleiste und prüfen &quot;Schritt abbrechen&quot;. Das Programm wird mit dem nächsten Schritt automatisch zu bewegen. Um das Experiment fortzusetzen, wählen Sie &quot;Ausführen&quot; aus der Menüleiste und prüfen Sie &#39;Start / Weiter &quot;. Schritt 3 in der RTCA Programm zu initiieren. </li></ol></li><li> Datenanalyse <ol><li> Um das Niveau der Sphäroid Zelle Invasivität bestimmen, subtrahieren, die für die LP9 Monoschicht nur aus den für die Eierstockkrebszelllinien zu jedem Zeitpunkt erhalten, einzelne Messwerte erhalten wurden. </li><li> Um &#39;Sphäroid-Invasion &quot;des Grundstückes, zu normalisieren alle Werte auf den Zeitpunkt, zu dem die Sphäroide wurden zu der Platte gegeben, mit setting diesem Zeitpunkt auf &#39;0 &#39;. </li></ol></li></ol>

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Open access fee paid for by ACEA Biosciences, Inc. and MIMR-PHI Institute of Medical Research.

Invasion der Eierstockkrebszellen interagieren mit einer Vielzahl von Zelltypen an der Oberfläche des Bauchfells, einschließlich Fibroblasten, Adipozyten und Mesothelzellen und bidirektionale Kommunikation zwischen den Krebszellen und Peritonealzellen wird gedacht, um eine Schlüsselrolle bei der Vertreibung der metastatischen Prozess 2 zu spielen. Sobald sie beherrscht, ist die hier beschriebene Protokoll leicht an der Untersuchung dieser Wechselwirkungen innerhalb der Bauchmikroumgebung, z. B. durch die Zugabe von exogenen Cytokinen, Wachstumsfaktoren oder spezifischen Inhibitoren auf die oberen oder unteren Kammern des CIM-Platte gut oder Genmanipulation der Krebs oder peritonealen Zelllinien. Darüber hinaus kann diese Methode mit primären Eierstocktumorzellen frisch aus malignem Aszites und / oder primäre Bauch Zellen geerntet, direkte Einblicke in die Regulationssignale und zelluläre Wechselwirkungen, die die Einrichtung einer metastatischen Läsion in der Bauchhöhle regieren zu gewinnen verwendet werden <sbis&gt; 2. Die Nutzung der RTCA Instrument, um die invasive Kapazität der einzelnen Zellen oder Kügelchen messen bietet mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Einzel Endpunkt-Assays und Bild Zeitraffer-Analysen. Der RTCA Gerät misst Zellinvasion in definierten Abständen kontinuierlich innerhalb eines Assays, die Stunden oder Tage sein kann. Dies ermöglicht die Bestimmung von Änderungen in der Geschwindigkeit der Invasion im Laufe der Zeit, die die Grenzen der einzelnen Endpunkt-Assays überwindet. Beispielsweise die Prüfung der Invasion von Daten aus den verschiedenen Krebszelllinien in einem einzigen Endpunkt (Fig. 2), z. B. 3 Stunden, möglicherweise fehlerhaften Ergebnis, dass KGN und OVCA433 Zellen waren viel invasiv als OVCA429 Zellen geführt. Ein weiterer Vorteil dieser Technologie ist, dass die RTCA Gerät misst Änderungen in der elektrischen Impedanz. Dies bedeutet, dass Tests können ohne Markierung von Zellen mit einer exogenen Mittel, die unbeabsichtigten Auswirkungen auf die Zell phen haben könnte ausgeführt werdenOTYPE oder Funktion. Dies wird besonders wichtig, wenn das Studium primären Eierstockkrebszellen von malignem Aszites, mit dem es zwingend notwendig, um Manipulationen auf ein Minimum zu halten, um zu vermeiden, um die Einführung der molekularen und phänotypischen Veränderungen, die nicht repräsentativ für ihre in vivo Natur 2 abgeleitet. Außerdem Nutzung des RTCA Instrument ermöglicht die Erfassung von quantitativen Daten in Echtzeit, die nicht nur vermeidet die zeitaufwendige Analysen mit Zeitraffer-Mikroskopie verbunden, sondern ermöglicht auch die schnelle Bestimmung von Schlüssel experimentelle Fenster für die Assay-Optimierung. Dies ist besonders nützlich, wenn man die Wirkungen einer Reihe von Faktoren auf Sphäroid Invasion, als unterschiedliche Faktoren ihre maximale Wirkung zu verschiedenen Zeitpunkten oder mit sehr unterschiedlichen Profilen über die Zeit zu nehmen. Obwohl dieses Protokoll zugänglich Veränderungen (z. B. Verwendung von verschiedenen ECM-Matrix, verschiedenen Krebszelllinien oder andere Ziel celLS), wenn dies so ist, ist es wichtig zu beachten, dass verschiedene Versuchsbedingungen zunächst optimiert werden. Beispielsweise vor Beginn der Studien der Sphäroid-Invasion, die optimale Anzahl von Krebszellen / CIM Platte sollte auch zunächst durch Assay der Zellzahl Titrationen in Monolayer-Kultur bestimmt werden. Die optimale Anzahl von Sphäroiden pro gut gebrauchen wird dann auf dieser Analyse. Beispielsweise in der aktuellen Methode, Sphäroide enthalten etwa 3.000 Zellen jeweils als erstes erzeugt. Wenn Anfangszellzahl Titrationen zeigen, dass 30.000 Zellen in Monolayer sind optimal für die Detektion in Invasion analysiert, dann 10 Sphäroide pro CIM Platte hinzugefügt. Wenn ferner die Durchführung Co-Kultur-Experimente ist es wichtig, das Verhalten der &quot;Ziel&quot;-Zellmonoschicht getrennt, um zu bestimmen, ob diese Zellen sind von Natur aus invasiv, da dies die Ergebnisse verwechseln studieren. In dem Beispiel gezeigt werden Krebs Sphäroide auf der Oberseite eines Zell LP9 Monola plattiertyer, mit und ohne FBS an der Unterseite hinzugefügt sowie ein chemoattractant. Parallel werden LP9 Zellen allein unter jedem Behandlungszustand kultiviert. Ebenso, wenn die Untersuchung der Invasionskapazität von Zellen und Sphäroiden, ist es auch wichtig, ihre Migrations Kapazitäten, um die beiden Verhaltensweisen (dh Invasion erfordert den proteolytischen Abbau eines ECM-Barriere während der Migration nicht) unterscheiden zu untersuchen als auch. Um dies zu tun, lassen Sie den ECM-Schranke (Schritte 3.1.1 - 3.1.3) und führen den Test parallel mit der ECM-Barriere im Ort. Letztere &quot;Invasion&quot; Maßnahme kann auf der ehemaligen &quot;Migration&quot; Maß korrigiert werden, falls gewünscht. Schließlich ist es wichtig zu beachten, dass die Informationen aus Maßnahmen der elektrischen Impedanz gewonnen begrenzten: einmal Zellen in der unteren Kammer eingedrungen, können Veränderungen in ihrer Befestigung, Verbreitung, und Proliferation auf der Unterseite der Membran auf Veränderungen beitragen Impedanz reaDellen. Daher ist diese Methode sehr informativ, wenn sie in Verbindung mit anderen Tests der Sphäroid Zelllebensfähigkeit, Adhäsion, Migration und Morphologie, um umfassend zu beurteilen Sphäroid Zellverhalten verwendet. Zum Beispiel ideal, um die Sphäroid-mesothelial Wechselwirkungen zu verstehen, separaten Co-Kulturen sollte auch in regelmäßigen Abständen unter Standard-Phasenmikroskopie abgebildet werden, so dass qualitative Beurteilungen der Sphäroid Morphologie und Gesundheit können parallel mit quantitativen Assays RTCA der Invasion gemacht werden. Wenn das optionale Markierungsschritt durchgeführt wird, dann werden die Verhaltensweisen der einzelnen Krebszellen unter Fluoreszenzmikroskopie bestimmt werden, da sie von der Sphäroid zerlegen und interagieren mit den unmarkierten Mesothelzellen. Ein zusätzlicher Vorteil der Fluoreszenzmarkierung, die Krebszellen bei Co-Kultivierung mit einem zweiten Zelltyp ist, dass es dann möglich, zu bestätigen, dass nur die Krebszellen durch die Zelle und ECM Barrieren fallen. <p class="jove_content"&gt; Zusammenfassend stellt diese Methode einen hohen Durchsatz quantitative Analyse von Eierstockkrebs Sphäroid Invasion der Mesothelzellen und ECM-Barrieren. Durch die Zugabe von exogenen Zytokinen, Wachstumsfaktoren, oder spezifische Inhibitoren zu den oberen oder unteren Kammern des CIM-Platte gut, ermöglicht diese Methode eine schnelle Bestimmung von Faktoren, die die Wechselwirkungen zwischen Eierstockkrebs-Zellen eindringende Sphäroid durch Mesothelzellen und Matrixbarrieren über Regulierung Zeit.

Eierstockkrebs hat die höchste Sterblichkeitsrate aller gynäkologischen Krebserkrankungen ein. Weltweit gibt es ~ 230.000 Fälle und mehr als 100.000 Todesfälle durch die Krankheit jedes Jahr ein. Die meisten Patienten (&gt; 75%) werden diagnostiziert, nachdem der Krebs bereits Metastasen gebildet hat, wenn die Behandlung durch erhöhte Resistenz gegen Chemotherapie kompliziert und die Prognose ist schlecht 2. Patienten mit Stadium III-IV Metastasen haben 5 Jahres-Überlebensraten von nur 30-40% 3. Somit besteht ein dringender Bedarf für ein besseres Verständnis der zellulären Verhaltensweisen, um effektiv zu behandeln fortgeschrittener Erkrankung zugrunde liegenden Eierstockkrebsmetastasen. Das aktuelle Modell von Eierstock-Krebs Metastasen schlägt mehrere Schritte in der metastatischen Prozess, von denen jeder tritt in einer ausgeprägten Mikro welche Auswirkungen auf Tumorverhalten. Metastasierenden Eierstockkrebszellen zunächst aus dem Primärtumors zu vergießen und zu überleben in einer nonadherent Zustand innerhalb der Peritonealflüssigkeit als einzelne Zellen oder dreidimensionale Strukturen vielzelligen, genannt vielzelligen Aggregaten oder Sphäroiden 2,4,5. Zellen, die in Suspension nicht Sphäroide bilden, sind anfälliger für anoikis 2,4,5. Sphäroide auch eine erhöhte Resistenz gegen Chemotherapeutika, Beitrag zur Resterkrankung und nachfolgende Wiederauftreten des Krebses 2,4,5. Ein zweiter kritischer Schritt bei Eierstockkrebsmetastasen ist der Übergang von Zuschlagstoffen aus frei schwebenden Cluster etabliert Sekundärtumoren in der Bauchwand und Netz 5,6. Zell-Zell-und Zell-Substrat-Wechselwirkungen in Aggregatbildung, das Überleben und die Einhaltung der extrazellulären Matrix (ECM) von der Mesothelzellen Auskleidung des Bauchfells 4-11 hergestellten Verbindung gebracht. Bisher werden diese Prozesse kaum verstanden. Um die Mechanismen bei der Verbreitung von Eierstockkrebs beteiligt zu definieren, können Sphäroiden Gener seinte an etablierten Tumorzelllinien unter Verwendung von nicht-adhärenten Kulturmethoden, die Aufrechterhaltung Zellen in Suspension entweder durch Zugabe von Methylcellulose zu den Kulturmedien 12,13 oder durch Kultivieren von Zellen auf Low-Befestigungsplatten 2,14. Wenn auf diese Weise kultiviert, montieren Eierstockkrebszellen in multizellulären Aggregaten oder Kügelchen, die ähnlich zellulären, molekularen und biochemischen Eigenschaften denen von Tumor Aggregate in vivo 2,14 gefunden aufweisen. Nach der Bildung kann Sphäroide anschließend von dem nicht anhaftenden Medium geerntet und auf eine Vielzahl von festen Oberflächen für die weitere funktionelle Studien wieder ausplattiert werden. Dies stellt einen Fortschritt gegenüber Assays in Monolayer-Kultur, die nicht genau zu modellieren sie das Verhalten der metastasierenden Eierstockkrebszellen in einem nicht-adhärenten Umgebung wie die intraperitoneale Flüssigkeit. Die invasive Kapazität von Krebs Sphäroiden in traditionellen Endpunkt-Assays in Boyden-Kammern 2 bewertet </sup&gt;, aber dieser Ansatz kann irreführend sein, da Eierstockkrebszellinvasion ist ein dynamischer Prozess über die Zeit. Eine aktuelle Echtzeit-Verfahren wurde mit Zeitraffer-Videomikroskopie von Mesothelzelle Freigabe durch eindringende Eierstockkrebs entwickelt Sphäroiden 15,16; jedoch ist die Analyse von Zeitreihen-Daten zeitaufwendig und kann subjektiv sein. Hierbei wird eine schnelle, quantitative Methode zur Bestimmung der invasiven Verhalten von Eierstockkrebs Sphäroide in Echtzeit beschrieben. Zunächst wurde ein Sphäroid-Mesothelzelle Modell eingesetzt, der die Bühne von Eierstockkrebsmetastasen stellt, wenn mehrzelligen Sphäroiden befestigen und dringen in die Bauchfellfutter zur sekundären Tumoren bilden. Dann Methodik für eine Echtzeit Zell Analyzer (RTCA, siehe Tabelle Materialien für Firmendaten) wurde angepasst, um quantitative Echtzeit-Messungen der Invasionskapazität von verschiedenen Eierstockkrebszelllinien als Sphäroiden gewachsen und in diesem Modell getestet befragen. In der RTCA inInstrument, zelluläre Reaktionen werden kontinuierlich über den Verlauf eines Assays durch Messung von Veränderungen der elektrischen Impedanz überwacht wird, ohne die Notwendigkeit einer exogenen Etiketten. Speziell entwickelten Kulturplatten mit Gold beschichteten Mikroelektroden unter einer mikroporösen Membran an der Grenzfläche zwischen den oberen und unteren Kammern eines Kammer 2 gut (&quot;CIM&quot;-Platten) liegt. Die Lage der Elektroden in der unteren Kammer ermöglicht die Messung von Veränderungen in der elektrischen Impedanz als Zellen eindringen oder durch eine ECM ECM / Zellbarriere. Die Membran-Grenzfläche zwischen den 2 Kammern jedes CIM Platte auch zunächst mit der ECM-Komponente von Interesse beschichtet. In der Sphäroid-Mesothelzelle Modellsystem wird die Schnittstelle mit einer Schicht aus Matrigel (siehe Tabelle Materialien für Firmendaten), um die komplexe ECM die Mesothelzellen Auskleidung der Bauchfell zugrunde liegenden imitieren, gefolgt von einem Monolayer der menschlichen Mesothelzellen &#39;beschichtet Ziel &quot;-Zellen. Schließlich sind die vorgeformten Eierstockkrebs Sphäroiden Anzeigeded. Eierstockkrebs Sphäroid Zellen müssen aktiv durch die Zielzellen Schicht und Matrix eindringen, um die Bodenkammer zu erreichen und elektrische Impedanzmesswerte verändern. Zielzellen allein sind ebenfalls bewertet, um sicherzustellen, dass sie nicht durch die Matrixschicht eindringen und sich in diesem Assay geeignet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="734">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">xCELLigence RTCA DP Analyser</td>
			<td style="width:291px;">ACEA biosciences</td>
			<td style="width:87px;">RTCA DP</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">xCELLigence CIM plates&#160;</td>
			<td>ACEA biosciences</td>
			<td>5665817001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell TraceTM CFSE&#160;</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylcellulose (4000 centipose)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:293px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>11966-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Medium 199&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:87px;">11150067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Ham&#39;s F-12 Nutrient mix</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:87px;">11765062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrocortisone&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin EDTA</td>
			<td style="width:291px;">Gibco-Invitrogen</td>
			<td style="width:87px;">15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well concave culture plate&#160;</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>650185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LP9 Human mesothelial cell line</td>
			<td>Coriell Institute for Medical Research&#160;</td>
			<td>AG07086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Growth Factor-reduced Matrigel matrix</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of ovarian cancer spheroid attachment and invasion of mesothelial cells in real time

Eierstockkrebs Metastasen durch den Abbau in die Bauchfellflüssigkeit und Dispergieren distalen Stellen innerhalb des Bauchfells. Monolayer-Kulturen nicht genau das Verhalten von Krebszellen zu modellieren innerhalb einer nichthaftende Umwelt, wie Krebszellen in sich zusammenfassen in multizellulären Strukturen, die auf den metastatischen Prozess, indem es an und Eindringen in die Bauchfellfutter zur sekundären Tumoren bilden beitragen. Um diese wichtige Phase von Eierstockkrebs Metastasen, vielzelligen Aggregaten, Sphäroiden oder modellieren, können von etablierten Eierstockkrebszelllinien unter Bedingungen gehalten, nicht anhaftende erzeugt werden. In die Bauchmikroumgebung von Tumorzellen in vivo angetroffen nachzuahmen, wurde ein Sphäroid-Mesothelzellen Co-Kulturmodell etabliert, in dem vorgeformten Kügelchen werden auf einem menschlichen Mesothelzellen Zellmonoschicht überzogen, auf einer extrazellulären Matrix Barriere gebildet. Methoden wurden dann mit Hilfe eines Echtzeit-Zellanalysegerät, um quantitative real durchzuführen entwickeltZeitmessungen der invasiven Kapazität von verschiedenen Eierstockkrebszelllinien als Sphäroiden gewachsen. Dieser Ansatz ermöglicht die kontinuierliche Messung der Invasion über lange Zeiträume, die mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Endpunkt-Assays und mühsamer Bild Echtzeit-Mikroskopie analysiert hat. Kurz gesagt, ermöglicht diese Methode eine schnelle Bestimmung von Faktoren, die die Wechselwirkungen zwischen Eierstockkrebs-Zellen eindringende Sphäroid durch Mesothelzellen und Matrix-Barrieren im Laufe der Zeit zu regulieren.

Ovarialkarzinom Sphäroide können aus vielen Arten von Zelllinien durch Kultivieren derselben in Suspension oder durch Ernten primäre Tumorzellen von malignem Aszites 2,14 erzeugt werden. Hier zwei epithelialen Ovarialkarzinom-Zelllinien, OVCA433 und OVCA429 und ein Eierstock-Granulosazelltumor Tumorlinie, KGN, wurden verwendet, um Sphäroiden (Abbildung 1A) zu generieren. Bei diesem Verfahren werden Zellen in U-förmigen Vertiefungen gezüchtet, während in Medien, die durch Zugabe von Methylcellulose viskos gemacht wurde, suspendiert. Unter diesen Bedingungen sind viele Eierstockkrebszellen weisen eine inhärente Fähigkeit zu aggregieren, um Sphäroide 13 zu bilden. Nach Übernacht-Kultur in Methylcellulose / Medium suspendiert, gebildet alle drei Zelllinien kompakten kugelförmigen Strukturen von ungefähr 400-500 &amp;mgr; m im Durchmesser (Fig. 1A). Währenddessen wird die RTCA CIM-Platte hergestellt, zunächst durch Beschichten des porösen Membranoberfläche mit Matrix und eine konfluente Monoschicht der menschlichen Melothelial Zellen (1B). Einmal gebildet, Sphäroide werden dann auf die vorbereitete CIM-Platte übertragen. Geerntet Krebs Sphäroide auf dem LP9 Monoschicht plattiert und bewertet, wie unten beschrieben. Bilder unter Standard-Phasenmikroskopie (oder unter Fluoreszenzmikroskopie, wenn die optionale Zellmarkierung Schritt folgte) von Parallelkulturen werden in regelmäßigen Abständen in der Interpretation der Daten RTCA (Abbildung 1C) Hilfe genommen. Es ist informativ, sowohl das Basisniveau der Invasion einer Krebszelllinie, sowie chemoattractant-induzierte Invasion zu beurteilen. Typischerweise wird die basale Invasivität durch Zugabe von SFM auf den oberen und unteren Kammern gemessen. Vollmedium (10% FBS), die vielen möglichen chemischen Lockstoffe enthält, wird in dem vorliegenden Beispiel verwendet werden, um &quot;Chemoattractant-induzierte Invasion (Fig. 2) zu prüfen. Parallelstudien von LP9 Mesothelzellen allein bestätigt, dass diese Zellen minimalinvasive über 2 Tage entweder unter basalen oder &quot;chemoattractant &#39;induzierten Bedingungen und damit waren eine gute Zelltyp in Co-Kultur-Assays mit Eierstockkrebszellen (2A und 2B). Im Gegensatz dazu zeigten Eierstock erzeugt unter Verwendung einer der drei Krebszelllinien Sphäroide in der Lage, zu einem Chemoattraktor (FBS) (Fig. 2A-2C) einzudringen. Der große Vorteil der Verwendung der RTCA Echtzeit gegenüber herkömmlichen Instrumenten Endpunkt-Assays ist, dass Veränderungen in der Zell / Sphäroid Verhalten kann über die Zeit quantifiziert werden. Mit dem 2-tägigen Versuches, die KGN, OVCA429 und OVCA433 Zellinien zeigten alle die Fähigkeit, zu einem Chemoattraktor (durch Erhöhung Zellindizes angegeben), aber niedrige basale Niveaus der Invasion (2C) einzudringen. Die Zelllinien zeigten ähnliche Raten von Invasion, wie die parallel Steigungen der Kurven (Abbildung 2C) angegeben; jedoch zeigte die Kurve OVCA429 eine höhere obere Asymptote,die eine höhere maximale Höhe der Invasion angegeben im Vergleich zu den anderen Zelllinien. Darüber hinaus zeigten die Zelllinien Unterschiede in ihrer Zeit zu Beginn der Invasion, wobei die KGN-Zellen schnell Invasion der Zell-und Matrixbarrieren und die OVCA433 und OVCA429 Zellen unter 3-5x mehr zu erobern, bzw. (2D). Wichtig ist, dass ihr Verhalten zu Beginn der Invasion war kein Anzeichen für ihre allgemeine Fähigkeit zur Invasion (2C und 2D). Dies legt nahe, verschiedene inhärente Funktionen der Krebszelllinien als auch anzeigen, dass verschiedene Faktoren frühen und späten invasive Verhalten von Sphäroiden zu regulieren. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51655/51655fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1 Sphäroid-Generation und das Modell der experimentellen einen Satz:.. IMagier unter Phasenkontrastmikroskopie von Sphäroiden bilden in Methylcellulose / media (oben) und der passenden Zelllinie als Monoschicht (unten) gewachsen. B: Schematische Darstellung der RTCA 2 Kammern CIM Platte gut aufgestellt, in dem vorgeformten Eierstockkrebs Sphäroide auf einer Monoschicht aus einem LP9 Mesothelzellen Schicht / Barrierematrix in der oberen Kammer und Medien ± FBS als chemoattraktive plattiert ist, um die untere Kammer gegeben. Elektroden unterhalb der Schnittstelle der zwei Kammern Maßnahme Erhöhung der elektrischen Impedanz mehr Zellen eindringen durch die Barrieren in die untere Kammer C:. Bilder von KGN Sphäroiden auf der LP9 Mono unter Phasenkontrastmikroskopie (links) oder Fluoreszenzmikroskopie (rechts). Maßstabsbalken = 100 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51655/51655fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> .. Abbildung 2 Echtzeit-Eierstockkrebs Sphäroid Invasion Daten A - B: Repräsentative Ergebnisse einer RTCA Invasionstest mit und ohne FBS in der Bodenkammer eines CIM-Platte gut durchgeführt. KGN Zellinvasion auf LP9 Mesothelzellen verglichen. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SD Zell Index von drei Vertiefungen an der 24-Stunden-Zeitpunkt (A) und über einen gesamten Zeitraum 2 Tage-Test (B) gezeigt C - D:. Ein Vergleich der invasiven Kapazität von KGN, OVCA429 und OVCA433 Zelle Leitungen über einen Zeitraum von 24 Std. (C) und in detaillierter Art und Weise über einen Zeitraum 2,5 h (D) dargestellt.

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Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Eierstockkrebszellinvasion in die Mesothelzellen Auskleidung des Bauchfells ist ein dynamischer Prozess über die Zeit. Mit Hilfe eines Echtzeit-Analysator, kann die invasive Kapazität von Eierstockkrebszellen in einem Sphäroid-Mesothelzelle Co-Kultur-Modell über längere Zeiträume quantifiziert werden, Einblicke in Faktoren Regelung der metastatischen Prozesses.

Beurteilung von Eierstockkrebs Sphäroid Bindung und Invasion von Mesothelzellen in Echtzeit

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

17.2K Aufrufe.  MIMR-PHI Institute of Medical Research.  Eierstockkrebszellinvasion in die Mesothelzellen Auskleidung des Bauchfells ist ein dynamischer Prozess über die Zeit. Mit Hilfe eines Echtzeit-Analysator, kann die invasive Kapazität von Eierstockkrebszellen in einem Sphäroid-Mesothelzelle Co-Kultur-Modell über längere Zeiträume quantifiziert werden, Einblicke in Faktoren Regelung der metastatischen Prozesses. 

Serie: Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of endothelial junctions and finally invasion and migration of tumor cells through the endothelial layer to enter the bloodstream as a means of transport to distant sites in the host1-3. Once in the circulatory system, cancer cells adhere to capillary walls and extravasate to the surrounding tissue to form metastatic tumors4,5. The various components of tumor cell-endothelial cell interaction can be replicated in vitro by challenging a monolayer of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) with cancer cells. Studies performed with electron and phase-contrast microscopy suggest that the in vitro sequence of events fairly represent the in vivo metastatic process6. Here, we describe an electrical-impedance based technique that monitors and quantifies in real-time the invasion of endothelial cells by malignant tumor cells.
Giaever and Keese first described a technique for measuring fluctuations in impedance when a population of cells grow on the surface of electrodes7,8. The xCELLigence instrument, manufactured by Roche, utilizes a similar technique to measure changes in electrical impedance as cells attach and spread in a culture dish covered with a gold microelectrode array that covers approximately 80% of the area on the bottom of a well. As cells attach and spread on the electrode surface, it leads to an increase in electrical impedance9-12. The impedance is displayed as a dimensionless parameter termed cell-index, which is directly proportional to the total area of tissue-culture well that is covered by cells. Hence, the cell-index can be used to monitor cell adhesion, spreading, morphology and cell density.
The invasion assay described in this article is based on changes in electrical impedance at the electrode/cell interphase, as a population of malignant cells invade through a HUVEC monolayer (Figure 1). The disruption of endothelial junctions, retraction of endothelial monolayer and replacement by tumor cells lead to large changes in impedance. These changes directly correlate with the invasive capacity of tumor cells, i.e., invasion by highly aggressive cells lead to large changes in cell impedance and vice versa. This technique provides a two-fold advantage over existing methods of measuring invasion, such as boyden chamber and matrigel assays: 1) the endothelial cell-tumor cell interaction more closely mimics the in vivo process, and 2) the data is obtained in real-time and is more easily quantifiable, as opposed to end-point analysis for other methods.

This article describes an in vitro technique for monitoring cancer cells invading through a monolayer of endothelial cells. The data is acquired in real-time as a function of changes in impedance on the surface of electrodes at the well bottom.

Eine Echtzeit-Elektrische Impedanz basierte Technik zur Invasion von Endothelzellen Monolayer von Krebs Zellen zu messen

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of ...

Forschung

Medizin

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Evaluation von Nanopartikel-Aufnahme in Tumoren in Echtzeit über Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-Photonen-Imaging der Tumorzellinvasion in einem orthotopen Mausmodell des oralen Plattenepithelkarzinoms

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

Spheroid Assay to Measure TGF-&amp;#946;-induced Invasion

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

Spheroid Assay zur TGF-β-induzierte Invasion Measure

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

In-vitro-Assay Mesothelzellen Ausverkauf, dass die Modelle der frühen Schritte der Metastasierung Eierstockkrebs

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

Liquor microRNA Profiling mittels quantitativer Real-Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

Verfahren zur Gewinnung von Primäreierstockkrebszellen von Solid Proben

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

Bereicherung für chemoresistenten Eierstockkrebs Stammzellen aus menschlichen Zelllinien

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

In vitro Anreicherung des Eierstockkrebs Tumor-initiierenden Zellen

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Dreidimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasionsassay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...