Name: assessment of ovarian cancer spheroid attachment and invasion of mesothelial cells in real time
Uploaded: 2014-05-20T19:20:00.000+00:00
Duration: 14 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch eine CASS Stiftung Wissenschaft und Medizin Zuschuss unterstützt; (MB); a National Health &amp; Medical Research Council of Australia Projekt Grant (KLS, 338516); und von der Regierung von Victoria Operational Infrastructure Support Program (Australien).

1. Vorbereitung der Zellen, Medien und Reagenzien <ol><li> Herstellung von Methylcellulose-Medium, enthaltend <ol><li> Man löst 1,5 g Methylcellulose in 100 ml steriler Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) (ohne Zusätze) in einem 250 ml-Kolben. </li><li> Die Lösung wird auf Low in einer Mikrowelle für 5 min; kümmern sich um Überkochen zu vermeiden. </li><li> Sobald der Methylcellulose-Pulver ist halb gelöst, fügen Sie ein sauberes Magnetrührer und Medien, um das Volumen auf 125 ml zu nehmen. </li><li> Mischen, Invertzucker, und bei Raumtemperatur für 1,5 Stunden, gefolgt von Rühren bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Teilen Sie die Lösung gleichmäßig in vier 50 ml Zentrifugenröhrchen und für 1,5 Stunden bei 2300 x g. </li><li> Sammeln Sie die klare, hochviskose Überstand (ca. 90-95% der Aktien), aliquoten in sterile 50-ml-Röhrchen, und bei 4 ° C bis zu 3 Monate. </li></ol></li><li> Kultur und Markierung von Zellen <ol><li> Pflegen Eierstock-Krebszelllinien in Monolayer in einem tiUSGABE Kulturbrutschrank bei 37 ° C, 5% CO 2 in geeigneten Wachstumsmedium (DMEM KGN für die Zellen 17 und MCBD110: M199 für die OVCA429 und OVCA433 Zellinien 18) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L ergänzt -Glutamin und 1% Penicillin-Streptomycin. </li><li> Aufrechterhaltung LP9 menschlichen Mesothelzellen in M199: Hams F12-Medium, enthaltend 15% FBS, 10 ng / ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) und 400 ng / ml Hydrocortison, in einem Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Seed-Zellen in der gewünschten Größe und Kolben wachsen, um etwa 75% Konfluenz. Ernten der Zellen durch Trypsinierung mit 0,05% Trypsin / EDTA, Schleudern bei 186 × g für 5 min, und waschen Zellpellet zweimal mit PBS. </li><li> Zählen von Zellen mit einer Zählkammer. </li></ol></li><li> Optional Fluorescent Zellmarkierungsmethode <ol><li> Resuspendieren Krebszellen in einer Endkonzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml in 1 ml vorgewärmtem PBS/0.1% BSA. </li><li> In 2 ul 5 mM Stammzell Trace CSFE Lösung (oder einer anderen Markierung, die bevorzugte Zelle langfristig beibehalten wird), um Zellen in einer Endkonzentration von 10 uM und bei 37 ° C für 10-15 min in einem Wasserbad. </li><li> Die Reaktion wird mit 1 ml eiskaltem Medium mit 10% FBS und Wieder Pellet durch Zentrifugation. Resuspendieren in 10 ml des entsprechenden vorgewärmten Wachstumsmedium (siehe Schritt 1.2.1). </li><li> Samenzellen in einem 75 cm 2 Filter verschlossenen Kolben und die Kultur bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Check-Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop, um sicherzustellen, dass das Niveau der Fluoreszenz-Markierung zum Nachweis ausreichender ist. Sobald Zellen erreichen ca. 75% Konfluenz, Ernte und zählen wie in den Schritten 1.2.3 und 1.2.4 oben. </li></ol></li></ol> 2. Generation Spheroids in Methylcellulose <ol><li> Berechnen Sie das Volumen von Eierstockkrebszellen aus Abschnitt 1 für Sphäroid Generation benötigt (insgesamt 300.000 Zellen werden für jedes volle 96-Well-Platte Experiment erforderlich). Nichtte: Wenn mit verschiedenen Zelllinien als hier dargestellt, können die Zelldichten für einheitliche Sphäroid Generation brauchen, um für jede Zeile optimiert werden. </li><li> Zur Verdünnung der Zellen in Methylcellulose Medien zu berechnen, zunächst subtrahieren Sie den Zellvolumen erforderlich ist (Schritt 2.1) von 15 ml. </li><li> 3 ml Methylcellulose-Stammlösung (um 20% Methylcellulose endgültig) auf ein Volumen von geeigneten Kulturmedium für jede Zelllinie in Höhe von 15 ml minus des Zellvolumens und gründlich durch vorsichtiges Umdrehen mischen. </li><li> In 300.000 Zellen auf die Methylcellulose enthaltenden Medium und gründlich durch vorsichtiges Schwenken gemischt. </li><li> Pipette 150 ul der Zell / Methylcellulose / Media-Mix (für insgesamt 3000 Zellen / Vertiefung) in jede Vertiefung einer 96-Well-Kulturplatte mit konkaven und die Kultur bei 37 ° C, 5% CO 2 für 1-4 Tage oder bis eine einheitliche Sphäroiden bilden (1 Sphäroid / Vertiefung ist in der Regel beobachtet). </li></ol> 3. RTCA Zellinvasion Assays NOTE: Impedanzmessungen werden als Zellindex (CI), eine dimensionslose Kennzahl, die eine relative Änderung der gemessenen Zellenimpedanz, die die Zellstatus ausgedrückt. Für die Analyse, Import von Daten in einer Tabellenkalkulation wie Microsoft Excel. <ol><li> Plattenvorbereitung <ol><li> Arbeiten in Gruppen von 4 Vertiefungen in einer Zeit, 50 &amp;mgr; l Matrix (1:10 verdünnt in Serum-freien Kulturmedien) in jede Vertiefung der oberen Kammer einer 16-Well-Platte RTCA CIM, um sicherzustellen, dass die gesamte Oberfläche bedeckt ist . Entfernen Sie 30 ul Matrix sofort, aber langsam, zu jeder überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. </li><li> Inkubieren Platte bei 37 ° C für 4 Stunden vor der Verwendung in einem Gewebekultur-Inkubator verwendet. </li><li> Hinzufügen von 30 &amp;mgr; l serumfreiem Medium (SFM) für jeden Krebszelllinie mit der oberen Kammer und 160 ul Medium mit oder ohne Serum (nach Ihrer experimentelles Design) in die untere Kammer geeignet. </li><li> Montieren Sie den CIM-Platte, indem Sie auf die untere Kammer in die obere Kammer und equilibraß in einem 37 ° C Inkubator für 1 Stunde in einem Gewebekultur-Inkubator. </li></ol></li><li> Programmierung der RTCA Instrument <ol><li> Öffnen Sie das RTCA-Programm und wählen Sie die Registerkarte &quot;Layout&quot;. Markieren Sie alle Versuchsbrunnen. </li><li> Klicken Sie rechts auf Brunnen und wählen Sie &quot;Schalten Sie Brunnen &#39;; dann in Versuchsbedingungen und Zellennamen füllen, wie gewünscht. </li><li> Um Schritte oder Teilschritte in das Programm, wählen Sie die &quot;Schedule&quot; Registerkarte, und klicken Sie rechts auf &quot;Add a step &#39;. Der erste Schritt ist eine vorprogrammierte Hintergrund Sweep, die automatisch in das Programm aufgenommen wird einmal &quot;fügen Sie einen Schritt&quot; gewählt wird. </li><li> Geben Sie die gewünschten Programmdetails für Schritt 2 des RTCA-Programm, das bei der Gründung der LP9 Monowerte aufzeichnet. In die Zeitintervalle zwischen Impedanzmessungen indem Sie die Registerkarte &quot;Interval&quot; und Eingabe von &#39;15 min &#39;. In Versuchsdauer durch Auswahl der &#39;Dauer&#39; Register eind Eingabe einer Zeit zwischen 24.12 h. </li><li> Um weitere Schritte hinzufügen, wählen Sie die &quot;Schedule&quot; Registerkarte und klicken Sie rechts auf &quot;Hinzufügen einen Schritt &#39;und geben Details der weiteren Schritte, wie oben. Schritt 3 des RTCA-Programm wird das Instrument zu Lesungen während der Sphäroid-Invasion nehmen zu leiten; Geben &#39;5 Minuten &#39;unter dem&#39; Intervall &#39;Registerkarte und &#39;48 Stunden&#39; auf der Registerkarte &#39;Dauer&#39;. </li><li> Wählen Sie &#39;Teller&#39; in der Menüleiste und sparen. </li></ol></li><li> Generierung von LP9 Monolayer und Messung der Sphäroid-Invasion <ol><li> Zeigen CIM Platte in RTCA Instrument und offenes Programm aus Schritt 3.2. Vor der Zugabe Zellen, wählen Sie &quot;Ausführen&quot; in der Menüleiste und dann &quot;Start&quot;. Ein Hintergrund-Sweep wird automatisch durchgeführt werden (Schritt 1 in den RTCA Software-Anweisungen). </li><li> Entfernen Sie die CIM-Platte aus dem Gerät nach dem Sweep Hintergrund und in einer Gewebekultur Kapuze. </li><li> Teller 50,000 LP9 Zellen in 160 ul SFM in die obere Kammer jedes CIM Platte gut suspendiert. </li><li> Die Platte wird in der RTCA Instrument und nehmen Messwerte alle 15 Minuten während der LP9 Monolage wird über Nacht Gründung (Schritt 2 des RTCA-Programm). </li><li> Ernte Krebs Sphäroiden unter Schritt 2 &quot;Generation von Sphäroiden in Methylcellulose &#39;erzeugt, vor. <ol><li> Aseptisch, schneiden 1 mm aus der Spitze von einer 1 ml-Pipettenspitze und verwenden, um sanft und rufen Sie die Inhalte von jedem. Transfer zu einem sterilen Röhrchen. </li><li> Centrifuge Sphäroide bei 120 g für 8 min, und entfernen Methylcellulose enthaltenden Medium durch leichtes Ansaugen. </li><li> Zweimal mit PBS waschen Sphäroiden, Zentrifugieren bei 120 g für 8 min zu pelletieren Sphäroiden nach jeder Wäsche. </li><li> Für jede Versuchs gut resuspendieren insgesamt 10 Kügelchen in 160 ul Medium ohne FBS. </li><li> Pause das RTCA Experiment durch Auswahl und Kontrolle und &quot;Ausführen&quot; aus der Menüleiste# 8216; Pause. Entfernen Sie die CIM-Platte aus dem Gerät, und legen in einer Gewebekultur Kapuze. Absaugen der Medien aus jeder Vertiefung und ersetzen Sphäroid haltigen Medien (10 Kugeln in 160 ul) oder frische Medien für LP9 nur Kontrollvertiefungen. </li></ol></li><li> Bringen Sie die Platte an der RTCA Instrument. Wählen Sie &quot;Ausführen&quot; aus der Menüleiste und prüfen &quot;Schritt abbrechen&quot;. Das Programm wird mit dem nächsten Schritt automatisch zu bewegen. Um das Experiment fortzusetzen, wählen Sie &quot;Ausführen&quot; aus der Menüleiste und prüfen Sie &#39;Start / Weiter &quot;. Schritt 3 in der RTCA Programm zu initiieren. </li></ol></li><li> Datenanalyse <ol><li> Um das Niveau der Sphäroid Zelle Invasivität bestimmen, subtrahieren, die für die LP9 Monoschicht nur aus den für die Eierstockkrebszelllinien zu jedem Zeitpunkt erhalten, einzelne Messwerte erhalten wurden. </li><li> Um &#39;Sphäroid-Invasion &quot;des Grundstückes, zu normalisieren alle Werte auf den Zeitpunkt, zu dem die Sphäroide wurden zu der Platte gegeben, mit setting diesem Zeitpunkt auf &#39;0 &#39;. </li></ol></li></ol>

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Open access fee paid for by ACEA Biosciences, Inc. and MIMR-PHI Institute of Medical Research.

Invasion der Eierstockkrebszellen interagieren mit einer Vielzahl von Zelltypen an der Oberfläche des Bauchfells, einschließlich Fibroblasten, Adipozyten und Mesothelzellen und bidirektionale Kommunikation zwischen den Krebszellen und Peritonealzellen wird gedacht, um eine Schlüsselrolle bei der Vertreibung der metastatischen Prozess 2 zu spielen. Sobald sie beherrscht, ist die hier beschriebene Protokoll leicht an der Untersuchung dieser Wechselwirkungen innerhalb der Bauchmikroumgebung, z. B. durch die Zugabe von exogenen Cytokinen, Wachstumsfaktoren oder spezifischen Inhibitoren auf die oberen oder unteren Kammern des CIM-Platte gut oder Genmanipulation der Krebs oder peritonealen Zelllinien. Darüber hinaus kann diese Methode mit primären Eierstocktumorzellen frisch aus malignem Aszites und / oder primäre Bauch Zellen geerntet, direkte Einblicke in die Regulationssignale und zelluläre Wechselwirkungen, die die Einrichtung einer metastatischen Läsion in der Bauchhöhle regieren zu gewinnen verwendet werden <sbis&gt; 2. Die Nutzung der RTCA Instrument, um die invasive Kapazität der einzelnen Zellen oder Kügelchen messen bietet mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Einzel Endpunkt-Assays und Bild Zeitraffer-Analysen. Der RTCA Gerät misst Zellinvasion in definierten Abständen kontinuierlich innerhalb eines Assays, die Stunden oder Tage sein kann. Dies ermöglicht die Bestimmung von Änderungen in der Geschwindigkeit der Invasion im Laufe der Zeit, die die Grenzen der einzelnen Endpunkt-Assays überwindet. Beispielsweise die Prüfung der Invasion von Daten aus den verschiedenen Krebszelllinien in einem einzigen Endpunkt (Fig. 2), z. B. 3 Stunden, möglicherweise fehlerhaften Ergebnis, dass KGN und OVCA433 Zellen waren viel invasiv als OVCA429 Zellen geführt. Ein weiterer Vorteil dieser Technologie ist, dass die RTCA Gerät misst Änderungen in der elektrischen Impedanz. Dies bedeutet, dass Tests können ohne Markierung von Zellen mit einer exogenen Mittel, die unbeabsichtigten Auswirkungen auf die Zell phen haben könnte ausgeführt werdenOTYPE oder Funktion. Dies wird besonders wichtig, wenn das Studium primären Eierstockkrebszellen von malignem Aszites, mit dem es zwingend notwendig, um Manipulationen auf ein Minimum zu halten, um zu vermeiden, um die Einführung der molekularen und phänotypischen Veränderungen, die nicht repräsentativ für ihre in vivo Natur 2 abgeleitet. Außerdem Nutzung des RTCA Instrument ermöglicht die Erfassung von quantitativen Daten in Echtzeit, die nicht nur vermeidet die zeitaufwendige Analysen mit Zeitraffer-Mikroskopie verbunden, sondern ermöglicht auch die schnelle Bestimmung von Schlüssel experimentelle Fenster für die Assay-Optimierung. Dies ist besonders nützlich, wenn man die Wirkungen einer Reihe von Faktoren auf Sphäroid Invasion, als unterschiedliche Faktoren ihre maximale Wirkung zu verschiedenen Zeitpunkten oder mit sehr unterschiedlichen Profilen über die Zeit zu nehmen. Obwohl dieses Protokoll zugänglich Veränderungen (z. B. Verwendung von verschiedenen ECM-Matrix, verschiedenen Krebszelllinien oder andere Ziel celLS), wenn dies so ist, ist es wichtig zu beachten, dass verschiedene Versuchsbedingungen zunächst optimiert werden. Beispielsweise vor Beginn der Studien der Sphäroid-Invasion, die optimale Anzahl von Krebszellen / CIM Platte sollte auch zunächst durch Assay der Zellzahl Titrationen in Monolayer-Kultur bestimmt werden. Die optimale Anzahl von Sphäroiden pro gut gebrauchen wird dann auf dieser Analyse. Beispielsweise in der aktuellen Methode, Sphäroide enthalten etwa 3.000 Zellen jeweils als erstes erzeugt. Wenn Anfangszellzahl Titrationen zeigen, dass 30.000 Zellen in Monolayer sind optimal für die Detektion in Invasion analysiert, dann 10 Sphäroide pro CIM Platte hinzugefügt. Wenn ferner die Durchführung Co-Kultur-Experimente ist es wichtig, das Verhalten der &quot;Ziel&quot;-Zellmonoschicht getrennt, um zu bestimmen, ob diese Zellen sind von Natur aus invasiv, da dies die Ergebnisse verwechseln studieren. In dem Beispiel gezeigt werden Krebs Sphäroide auf der Oberseite eines Zell LP9 Monola plattiertyer, mit und ohne FBS an der Unterseite hinzugefügt sowie ein chemoattractant. Parallel werden LP9 Zellen allein unter jedem Behandlungszustand kultiviert. Ebenso, wenn die Untersuchung der Invasionskapazität von Zellen und Sphäroiden, ist es auch wichtig, ihre Migrations Kapazitäten, um die beiden Verhaltensweisen (dh Invasion erfordert den proteolytischen Abbau eines ECM-Barriere während der Migration nicht) unterscheiden zu untersuchen als auch. Um dies zu tun, lassen Sie den ECM-Schranke (Schritte 3.1.1 - 3.1.3) und führen den Test parallel mit der ECM-Barriere im Ort. Letztere &quot;Invasion&quot; Maßnahme kann auf der ehemaligen &quot;Migration&quot; Maß korrigiert werden, falls gewünscht. Schließlich ist es wichtig zu beachten, dass die Informationen aus Maßnahmen der elektrischen Impedanz gewonnen begrenzten: einmal Zellen in der unteren Kammer eingedrungen, können Veränderungen in ihrer Befestigung, Verbreitung, und Proliferation auf der Unterseite der Membran auf Veränderungen beitragen Impedanz reaDellen. Daher ist diese Methode sehr informativ, wenn sie in Verbindung mit anderen Tests der Sphäroid Zelllebensfähigkeit, Adhäsion, Migration und Morphologie, um umfassend zu beurteilen Sphäroid Zellverhalten verwendet. Zum Beispiel ideal, um die Sphäroid-mesothelial Wechselwirkungen zu verstehen, separaten Co-Kulturen sollte auch in regelmäßigen Abständen unter Standard-Phasenmikroskopie abgebildet werden, so dass qualitative Beurteilungen der Sphäroid Morphologie und Gesundheit können parallel mit quantitativen Assays RTCA der Invasion gemacht werden. Wenn das optionale Markierungsschritt durchgeführt wird, dann werden die Verhaltensweisen der einzelnen Krebszellen unter Fluoreszenzmikroskopie bestimmt werden, da sie von der Sphäroid zerlegen und interagieren mit den unmarkierten Mesothelzellen. Ein zusätzlicher Vorteil der Fluoreszenzmarkierung, die Krebszellen bei Co-Kultivierung mit einem zweiten Zelltyp ist, dass es dann möglich, zu bestätigen, dass nur die Krebszellen durch die Zelle und ECM Barrieren fallen. <p class="jove_content"&gt; Zusammenfassend stellt diese Methode einen hohen Durchsatz quantitative Analyse von Eierstockkrebs Sphäroid Invasion der Mesothelzellen und ECM-Barrieren. Durch die Zugabe von exogenen Zytokinen, Wachstumsfaktoren, oder spezifische Inhibitoren zu den oberen oder unteren Kammern des CIM-Platte gut, ermöglicht diese Methode eine schnelle Bestimmung von Faktoren, die die Wechselwirkungen zwischen Eierstockkrebs-Zellen eindringende Sphäroid durch Mesothelzellen und Matrixbarrieren über Regulierung Zeit.

Eierstockkrebs hat die höchste Sterblichkeitsrate aller gynäkologischen Krebserkrankungen ein. Weltweit gibt es ~ 230.000 Fälle und mehr als 100.000 Todesfälle durch die Krankheit jedes Jahr ein. Die meisten Patienten (&gt; 75%) werden diagnostiziert, nachdem der Krebs bereits Metastasen gebildet hat, wenn die Behandlung durch erhöhte Resistenz gegen Chemotherapie kompliziert und die Prognose ist schlecht 2. Patienten mit Stadium III-IV Metastasen haben 5 Jahres-Überlebensraten von nur 30-40% 3. Somit besteht ein dringender Bedarf für ein besseres Verständnis der zellulären Verhaltensweisen, um effektiv zu behandeln fortgeschrittener Erkrankung zugrunde liegenden Eierstockkrebsmetastasen. Das aktuelle Modell von Eierstock-Krebs Metastasen schlägt mehrere Schritte in der metastatischen Prozess, von denen jeder tritt in einer ausgeprägten Mikro welche Auswirkungen auf Tumorverhalten. Metastasierenden Eierstockkrebszellen zunächst aus dem Primärtumors zu vergießen und zu überleben in einer nonadherent Zustand innerhalb der Peritonealflüssigkeit als einzelne Zellen oder dreidimensionale Strukturen vielzelligen, genannt vielzelligen Aggregaten oder Sphäroiden 2,4,5. Zellen, die in Suspension nicht Sphäroide bilden, sind anfälliger für anoikis 2,4,5. Sphäroide auch eine erhöhte Resistenz gegen Chemotherapeutika, Beitrag zur Resterkrankung und nachfolgende Wiederauftreten des Krebses 2,4,5. Ein zweiter kritischer Schritt bei Eierstockkrebsmetastasen ist der Übergang von Zuschlagstoffen aus frei schwebenden Cluster etabliert Sekundärtumoren in der Bauchwand und Netz 5,6. Zell-Zell-und Zell-Substrat-Wechselwirkungen in Aggregatbildung, das Überleben und die Einhaltung der extrazellulären Matrix (ECM) von der Mesothelzellen Auskleidung des Bauchfells 4-11 hergestellten Verbindung gebracht. Bisher werden diese Prozesse kaum verstanden. Um die Mechanismen bei der Verbreitung von Eierstockkrebs beteiligt zu definieren, können Sphäroiden Gener seinte an etablierten Tumorzelllinien unter Verwendung von nicht-adhärenten Kulturmethoden, die Aufrechterhaltung Zellen in Suspension entweder durch Zugabe von Methylcellulose zu den Kulturmedien 12,13 oder durch Kultivieren von Zellen auf Low-Befestigungsplatten 2,14. Wenn auf diese Weise kultiviert, montieren Eierstockkrebszellen in multizellulären Aggregaten oder Kügelchen, die ähnlich zellulären, molekularen und biochemischen Eigenschaften denen von Tumor Aggregate in vivo 2,14 gefunden aufweisen. Nach der Bildung kann Sphäroide anschließend von dem nicht anhaftenden Medium geerntet und auf eine Vielzahl von festen Oberflächen für die weitere funktionelle Studien wieder ausplattiert werden. Dies stellt einen Fortschritt gegenüber Assays in Monolayer-Kultur, die nicht genau zu modellieren sie das Verhalten der metastasierenden Eierstockkrebszellen in einem nicht-adhärenten Umgebung wie die intraperitoneale Flüssigkeit. Die invasive Kapazität von Krebs Sphäroiden in traditionellen Endpunkt-Assays in Boyden-Kammern 2 bewertet </sup&gt;, aber dieser Ansatz kann irreführend sein, da Eierstockkrebszellinvasion ist ein dynamischer Prozess über die Zeit. Eine aktuelle Echtzeit-Verfahren wurde mit Zeitraffer-Videomikroskopie von Mesothelzelle Freigabe durch eindringende Eierstockkrebs entwickelt Sphäroiden 15,16; jedoch ist die Analyse von Zeitreihen-Daten zeitaufwendig und kann subjektiv sein. Hierbei wird eine schnelle, quantitative Methode zur Bestimmung der invasiven Verhalten von Eierstockkrebs Sphäroide in Echtzeit beschrieben. Zunächst wurde ein Sphäroid-Mesothelzelle Modell eingesetzt, der die Bühne von Eierstockkrebsmetastasen stellt, wenn mehrzelligen Sphäroiden befestigen und dringen in die Bauchfellfutter zur sekundären Tumoren bilden. Dann Methodik für eine Echtzeit Zell Analyzer (RTCA, siehe Tabelle Materialien für Firmendaten) wurde angepasst, um quantitative Echtzeit-Messungen der Invasionskapazität von verschiedenen Eierstockkrebszelllinien als Sphäroiden gewachsen und in diesem Modell getestet befragen. In der RTCA inInstrument, zelluläre Reaktionen werden kontinuierlich über den Verlauf eines Assays durch Messung von Veränderungen der elektrischen Impedanz überwacht wird, ohne die Notwendigkeit einer exogenen Etiketten. Speziell entwickelten Kulturplatten mit Gold beschichteten Mikroelektroden unter einer mikroporösen Membran an der Grenzfläche zwischen den oberen und unteren Kammern eines Kammer 2 gut (&quot;CIM&quot;-Platten) liegt. Die Lage der Elektroden in der unteren Kammer ermöglicht die Messung von Veränderungen in der elektrischen Impedanz als Zellen eindringen oder durch eine ECM ECM / Zellbarriere. Die Membran-Grenzfläche zwischen den 2 Kammern jedes CIM Platte auch zunächst mit der ECM-Komponente von Interesse beschichtet. In der Sphäroid-Mesothelzelle Modellsystem wird die Schnittstelle mit einer Schicht aus Matrigel (siehe Tabelle Materialien für Firmendaten), um die komplexe ECM die Mesothelzellen Auskleidung der Bauchfell zugrunde liegenden imitieren, gefolgt von einem Monolayer der menschlichen Mesothelzellen &#39;beschichtet Ziel &quot;-Zellen. Schließlich sind die vorgeformten Eierstockkrebs Sphäroiden Anzeigeded. Eierstockkrebs Sphäroid Zellen müssen aktiv durch die Zielzellen Schicht und Matrix eindringen, um die Bodenkammer zu erreichen und elektrische Impedanzmesswerte verändern. Zielzellen allein sind ebenfalls bewertet, um sicherzustellen, dass sie nicht durch die Matrixschicht eindringen und sich in diesem Assay geeignet.

<table><tbody><tr><td>xCELLigence RTCA DP Analyser</td><td>ACEA biosciences</td><td>RTCA DP</td><td></td></tr><tr><td>xCELLigence CIM plates&amp;nbsp;</td><td>ACEA biosciences</td><td>5665817001</td><td></td></tr><tr><td>Cell TraceTM CFSE&amp;nbsp;</td><td>Molecular Probes</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Methylcellulose (4,000 centipose)</td><td>Sigma</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>11150067</td><td></td></tr><tr><td>Ham&#039;s F-12 Nutrient mix</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>11765062</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal Growth Factor (EGF)</td><td>PeproTech&amp;nbsp;</td><td>100-15</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>96-well concave culture plate&amp;nbsp;</td><td>Grenier Bio-One</td><td>650185</td><td></td></tr><tr><td>LP9 Human mesothelial cell line</td><td>Coriell Institute for Medical Research&amp;nbsp;</td><td>AG07086</td><td></td></tr><tr><td>Growth Factor-reduced Matrigel matrix</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>354230</td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of ovarian cancer spheroid attachment and invasion of mesothelial cells in real time

Eierstockkrebs Metastasen durch den Abbau in die Bauchfellflüssigkeit und Dispergieren distalen Stellen innerhalb des Bauchfells. Monolayer-Kulturen nicht genau das Verhalten von Krebszellen zu modellieren innerhalb einer nichthaftende Umwelt, wie Krebszellen in sich zusammenfassen in multizellulären Strukturen, die auf den metastatischen Prozess, indem es an und Eindringen in die Bauchfellfutter zur sekundären Tumoren bilden beitragen. Um diese wichtige Phase von Eierstockkrebs Metastasen, vielzelligen Aggregaten, Sphäroiden oder modellieren, können von etablierten Eierstockkrebszelllinien unter Bedingungen gehalten, nicht anhaftende erzeugt werden. In die Bauchmikroumgebung von Tumorzellen in vivo angetroffen nachzuahmen, wurde ein Sphäroid-Mesothelzellen Co-Kulturmodell etabliert, in dem vorgeformten Kügelchen werden auf einem menschlichen Mesothelzellen Zellmonoschicht überzogen, auf einer extrazellulären Matrix Barriere gebildet. Methoden wurden dann mit Hilfe eines Echtzeit-Zellanalysegerät, um quantitative real durchzuführen entwickeltZeitmessungen der invasiven Kapazität von verschiedenen Eierstockkrebszelllinien als Sphäroiden gewachsen. Dieser Ansatz ermöglicht die kontinuierliche Messung der Invasion über lange Zeiträume, die mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Endpunkt-Assays und mühsamer Bild Echtzeit-Mikroskopie analysiert hat. Kurz gesagt, ermöglicht diese Methode eine schnelle Bestimmung von Faktoren, die die Wechselwirkungen zwischen Eierstockkrebs-Zellen eindringende Sphäroid durch Mesothelzellen und Matrix-Barrieren im Laufe der Zeit zu regulieren.

Ovarialkarzinom Sphäroide können aus vielen Arten von Zelllinien durch Kultivieren derselben in Suspension oder durch Ernten primäre Tumorzellen von malignem Aszites 2,14 erzeugt werden. Hier zwei epithelialen Ovarialkarzinom-Zelllinien, OVCA433 und OVCA429 und ein Eierstock-Granulosazelltumor Tumorlinie, KGN, wurden verwendet, um Sphäroiden (Abbildung 1A) zu generieren. Bei diesem Verfahren werden Zellen in U-förmigen Vertiefungen gezüchtet, während in Medien, die durch Zugabe von Methylcellulose viskos gemacht wurde, suspendiert. Unter diesen Bedingungen sind viele Eierstockkrebszellen weisen eine inhärente Fähigkeit zu aggregieren, um Sphäroide 13 zu bilden. Nach Übernacht-Kultur in Methylcellulose / Medium suspendiert, gebildet alle drei Zelllinien kompakten kugelförmigen Strukturen von ungefähr 400-500 &amp;mgr; m im Durchmesser (Fig. 1A). Währenddessen wird die RTCA CIM-Platte hergestellt, zunächst durch Beschichten des porösen Membranoberfläche mit Matrix und eine konfluente Monoschicht der menschlichen Melothelial Zellen (1B). Einmal gebildet, Sphäroide werden dann auf die vorbereitete CIM-Platte übertragen. Geerntet Krebs Sphäroide auf dem LP9 Monoschicht plattiert und bewertet, wie unten beschrieben. Bilder unter Standard-Phasenmikroskopie (oder unter Fluoreszenzmikroskopie, wenn die optionale Zellmarkierung Schritt folgte) von Parallelkulturen werden in regelmäßigen Abständen in der Interpretation der Daten RTCA (Abbildung 1C) Hilfe genommen. Es ist informativ, sowohl das Basisniveau der Invasion einer Krebszelllinie, sowie chemoattractant-induzierte Invasion zu beurteilen. Typischerweise wird die basale Invasivität durch Zugabe von SFM auf den oberen und unteren Kammern gemessen. Vollmedium (10% FBS), die vielen möglichen chemischen Lockstoffe enthält, wird in dem vorliegenden Beispiel verwendet werden, um &quot;Chemoattractant-induzierte Invasion (Fig. 2) zu prüfen. Parallelstudien von LP9 Mesothelzellen allein bestätigt, dass diese Zellen minimalinvasive über 2 Tage entweder unter basalen oder &quot;chemoattractant &#39;induzierten Bedingungen und damit waren eine gute Zelltyp in Co-Kultur-Assays mit Eierstockkrebszellen (2A und 2B). Im Gegensatz dazu zeigten Eierstock erzeugt unter Verwendung einer der drei Krebszelllinien Sphäroide in der Lage, zu einem Chemoattraktor (FBS) (Fig. 2A-2C) einzudringen. Der große Vorteil der Verwendung der RTCA Echtzeit gegenüber herkömmlichen Instrumenten Endpunkt-Assays ist, dass Veränderungen in der Zell / Sphäroid Verhalten kann über die Zeit quantifiziert werden. Mit dem 2-tägigen Versuches, die KGN, OVCA429 und OVCA433 Zellinien zeigten alle die Fähigkeit, zu einem Chemoattraktor (durch Erhöhung Zellindizes angegeben), aber niedrige basale Niveaus der Invasion (2C) einzudringen. Die Zelllinien zeigten ähnliche Raten von Invasion, wie die parallel Steigungen der Kurven (Abbildung 2C) angegeben; jedoch zeigte die Kurve OVCA429 eine höhere obere Asymptote,die eine höhere maximale Höhe der Invasion angegeben im Vergleich zu den anderen Zelllinien. Darüber hinaus zeigten die Zelllinien Unterschiede in ihrer Zeit zu Beginn der Invasion, wobei die KGN-Zellen schnell Invasion der Zell-und Matrixbarrieren und die OVCA433 und OVCA429 Zellen unter 3-5x mehr zu erobern, bzw. (2D). Wichtig ist, dass ihr Verhalten zu Beginn der Invasion war kein Anzeichen für ihre allgemeine Fähigkeit zur Invasion (2C und 2D). Dies legt nahe, verschiedene inhärente Funktionen der Krebszelllinien als auch anzeigen, dass verschiedene Faktoren frühen und späten invasive Verhalten von Sphäroiden zu regulieren. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51655/51655fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1 Sphäroid-Generation und das Modell der experimentellen einen Satz:.. IMagier unter Phasenkontrastmikroskopie von Sphäroiden bilden in Methylcellulose / media (oben) und der passenden Zelllinie als Monoschicht (unten) gewachsen. B: Schematische Darstellung der RTCA 2 Kammern CIM Platte gut aufgestellt, in dem vorgeformten Eierstockkrebs Sphäroide auf einer Monoschicht aus einem LP9 Mesothelzellen Schicht / Barrierematrix in der oberen Kammer und Medien ± FBS als chemoattraktive plattiert ist, um die untere Kammer gegeben. Elektroden unterhalb der Schnittstelle der zwei Kammern Maßnahme Erhöhung der elektrischen Impedanz mehr Zellen eindringen durch die Barrieren in die untere Kammer C:. Bilder von KGN Sphäroiden auf der LP9 Mono unter Phasenkontrastmikroskopie (links) oder Fluoreszenzmikroskopie (rechts). Maßstabsbalken = 100 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51655/51655fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> .. Abbildung 2 Echtzeit-Eierstockkrebs Sphäroid Invasion Daten A - B: Repräsentative Ergebnisse einer RTCA Invasionstest mit und ohne FBS in der Bodenkammer eines CIM-Platte gut durchgeführt. KGN Zellinvasion auf LP9 Mesothelzellen verglichen. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SD Zell Index von drei Vertiefungen an der 24-Stunden-Zeitpunkt (A) und über einen gesamten Zeitraum 2 Tage-Test (B) gezeigt C - D:. Ein Vergleich der invasiven Kapazität von KGN, OVCA429 und OVCA433 Zelle Leitungen über einen Zeitraum von 24 Std. (C) und in detaillierter Art und Weise über einen Zeitraum 2,5 h (D) dargestellt.

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Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Eierstockkrebszellinvasion in die Mesothelzellen Auskleidung des Bauchfells ist ein dynamischer Prozess über die Zeit. Mit Hilfe eines Echtzeit-Analysator, kann die invasive Kapazität von Eierstockkrebszellen in einem Sphäroid-Mesothelzelle Co-Kultur-Modell über längere Zeiträume quantifiziert werden, Einblicke in Faktoren Regelung der metastatischen Prozesses.

Beurteilung von Eierstockkrebs Sphäroid Bindung und Invasion von Mesothelzellen in Echtzeit

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

17.3K Aufrufe.  MIMR-PHI Institute of Medical Research.  Eierstockkrebszellinvasion in die Mesothelzellen Auskleidung des Bauchfells ist ein dynamischer Prozess über die Zeit. Mit Hilfe eines Echtzeit-Analysator, kann die invasive Kapazität von Eierstockkrebszellen in einem Sphäroid-Mesothelzelle Co-Kultur-Modell über längere Zeiträume quantifiziert werden, Einblicke in Faktoren Regelung der metastatischen Prozesses. 

Serie: Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

Spheroid Assay zur TGF-β-induzierte Invasion Measure

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Forschung

Medizin

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

In-vitro-Assay Mesothelzellen Ausverkauf, dass die Modelle der frühen Schritte der Metastasierung Eierstockkrebs

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical treatments and improved platinum-based chemotherapies, there has been little improvement in EOC survival rates for more than four decades 1,2. Whilst stage I tumors have 5-year survival rates &gt;85%, survival rates for stage III/IV disease are &lt;40%. Thus, the high rates of mortality for EOC could be significantly decreased if tumors were detected at earlier, more treatable, stages 3-5. At present, the molecular genetic and biological basis of early stage disease development is poorly understood. More specifically, little is known about the role of the microenvironment during tumor initiation; but known risk factors for EOCs (e.g. age and parity) suggest that the microenvironment plays a key role in the early genesis of EOCs. We therefore developed three-dimensional heterotypic models of both the normal ovary and of early stage ovarian cancers. For the normal ovary, we co-cultured normal ovarian surface epithelial (IOSE) and normal stromal fibroblast (INOF)&nbsp;cells, immortalized by retrovrial transduction of the catalytic subunit of human telomerase holoenzyme (hTERT) to extend the lifespan of these cells in culture. To model the earliest stages of ovarian epithelial cell transformation, overexpression of the CMYC oncogene in IOSE cells, again co-cultured with INOF cells. These heterotypic models were used to investigate the effects of aging and senescence on the transformation and invasion of epithelial cells. Here we describe the methodological steps in development of these three-dimensional model; these methodologies aren't specific to the development of normal ovary and ovarian cancer tissues, and could be used to study other tissue types where stromal and epithelial cell interactions are a fundamental aspect of the tissue maintenance and disease development.

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

We describe methodologies for establishing in vitro heterotypic three-dimensional models comprising ovarian fibroblasts and normal ovarian surface or ovarian cancer epithelial cells. We discuss the use of these models to study stromal-epithelial interactions that occur during ovarian cancer development.

Heterotypische Dreidimensionale<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellierung von Stromal-Epithelial Interaktionen beim Eierstockkrebs Initiation und Progression

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical ...

An Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer using Human Stroma to Promote Metastasis

Ovarian cancer is characterized by early, diffuse metastasis with 70% of women having metastatic disease at the time of diagnosis. While elegant transgenic mouse models of ovarian cancer exist, these mice are expensive and take a long time to develop tumors. Intraperitoneal injection xenograft models lack human stroma and do not accurately model ovarian cancer metastasis. Even patient derived xenografts (PDX) do not fully recapitulate the human stromal microenvironment as serial PDX passages demonstrate significant loss of human stroma. The ability to easily model human ovarian cancer within a physiologically relevant stromal microenvironment is an unmet need. Here, the protocol presents an orthotopic ovarian cancer mouse model using human ovarian cancer cells combined with patient-derived carcinoma-associated mesenchymal stem cells (CA-MSCs). CA-MSCs are stromal progenitor cells, which drive the formation of the stromal microenvironment and support ovarian cancer growth and metastasis. This model develops early and diffuses metastasis mimicking clinical presentation. In this model, luciferase expressing ovarian cancer cells are mixed in a 1:1 ratio with CA-MSCs and injected into the ovarian bursa of NSG mice. Tumor growth and metastasis are followed serially over time using bioluminescence imaging. The resulting tumors grow aggressively and form abdominal metastases by 14 days post injection. Mice experienced significant decreases in body weight as a marker of systemic illness and increased disease burden. By day 30 post injection, mice met endpoint criteria of &gt;10% body weight loss and necropsy confirmed intra-abdominal metastasis in 100% of mice and 60%-80% lung and parenchymal liver metastasis. Collectively, orthotopic engraftment of ovarian cancer cells and stroma cells generates tumors that closely mimic the early and diffuse metastatic behavior of human ovarian cancer. Furthermore, this model provides a tool to study the role of ovarian cancer cell: stroma cell interactions in metastatic progression.

Orthotopic engraftment of ovarian cancer cells mixed with human stromal cells provides a mouse model that exhibits rapid, diffuse metastatic behavior that is characteristic of human ovarian cancer. This model also allows for the study of tumor cell and stromal cell interactions, as well as their role in tumor progression and metastasis.

Ovarian cancer is characterized by early, diffuse metastasis with 70% of women having metastatic disease at the time of diagnosis. While elegant ...

Krebsforschung

Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with poor clinical outcomes and currently lacks effective treatment. Both the three-dimensional (3D) environment and the dynamic mechanical forces are very important factors in this metastatic cascade. However, traditional cell cultures fail to recapitulate this natural tumor microenvironment. Thus, in vivo-like models that can emulate the intraperitoneal environment are of obvious importance. In this study, a new microfluidic platform of the peritoneum was set up to mimic the situation of ovarian cancer spheroids in the peritoneal cavity during metastasis. Ovarian cancer spheroids generated under a non-adherent condition were cultured in microfluidic channels coated with peritoneal mesothelial cells subjected to physiologically relevant shear stress. In summary, this dynamic 3D ovarian cancer-mesothelium microfluidic platform can provide new knowledge on basic cancer biology and serve as a platform for potential drug screening and development.

To study ovarian tumor progression in a physiologically relevant model, multicellular spheroids were cultured in a microdevice under simulated fluid flow. This dynamic 3D model emulates the intraperitoneal environment with the cellular and mechanical components where ovarian cancer metastasis occurs.

Modellierung Ovarian Cancer Vielzellige Sphäroid-Verhalten in einer dynamischen 3D-Peritoneal Microdevice

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with ...

Biotechnik

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Dreidimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasionsassay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.

Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

Die Quantifizierung von Intraperitonealtest Ovarian Cancer Metastasis

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States.  Mortality is due to diagnosis of 75% of ...

A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.

This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.

Eine Krebszelle Spheroid Assay zur Invasion in einem 3D-Rahmen Beurteilen

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

Modeling the Early Steps of Ovarian Cancer Dissemination in an Organotypic Culture of the Human Peritoneal Cavity

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. Instead, ovarian cancer cells exfoliated from the primary tumor are carried by peritoneal fluid to metastatic sites within the peritoneal cavity. These sites, most notably the abdominal peritoneum and omentum, are organs covered by a mesothelium-lined surface. To investigate the processes of ovarian cancer dissemination, we assembled a complex three-dimensional culture system that reconstructs the lining of the peritoneal cavity in vitro. Primary human fibroblasts and mesothelial cells were isolated from human omentum. The fibroblasts were then mixed with extracellular matrix and covered with a layer of the primary human mesothelial cells to mimic the peritoneal and omental surfaces encountered by metastasizing ovarian cancer cells. The resulting organotypic model is, as shown, used to examine the early steps of ovarian cancer dissemination, including cancer cell adhesion, invasion, and proliferation. This model has been used in a number of studies to investigate the role of the microenvironment (cellular and acellular) in early ovarian cancer dissemination. It has also been successfully adapted to high throughput screening and used to identify and test inhibitors of ovarian cancer metastasis.

Here, we present a protocol to construct a three-dimensional in vitro model of the lining of the peritoneal cavity, composed of primary human mesothelial cells and fibroblasts layered with extracellular matrix, as a tool to investigate ovarian cancer cell adhesion, invasion, and proliferation.

Modellierung der frühen Schritte der Eierstockkrebs Verbreitung in einer organotypischen Kultur der Menschen Peritonealhöhle

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. ...

Modeling Ovarian Cancer Metastasis in Peritoneal Cavity Lining: A Method To Establish an In Vitro 3D Model of the Peritoneal Lining

Source: Peters, P. N. et al. <a href="https://www.jove.com/t/53541">Modeling the Early Steps of Ovarian Cancer Dissemination in an Organotypic Culture of the Human Peritoneal Cavity.</a> J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we demonstrate the development of&#160; an in vitro &#160;three-dimensional model of the lining of the peritoneal cavity. This organotypic culture can help to investigate ovarian cancer cell adhesion, invasion, and proliferation.

Modellierung der Metastasierung von Eierstockkrebs in der Peritonealhöhle: Eine Methode zur Erstellung eines In-vitro-3D-Modells der Peritonealschleimhaut

Source: Peters, P. N. et al. Modeling the Early Steps of Ovarian Cancer Dissemination in an Organotypic Culture of the Human Peritoneal Cavity. J. Vis. ...