The authors would like to acknowledge support from Spinal Cord Injury Ontario, the Ontario-China Research and Innovation Fund, the Toronto General and Western Hospital Foundation, and Physicians&#8217; Services Incorporated Foundation. The authors thank Dr. Tasneem Zahir for expert advice in human spinal cord NSPC culture, and Drs. Cindi Morshead and Iris Kulbatski for their expert advice in rat spinal cord NSPC isolation.

Todos os procedimentos com animais são aprovados pelo Comitê Animal Care da University Health Network, Toronto ON Canadá, em conformidade com as políticas estabelecidas no Guia para o Cuidado e Uso de Animais Experimentais preparados pelo Canadian Council on Animal Care. Para a colheita de tecido da medula espinhal humana, a aprovação foi obtida a partir da Investigação Conselho de Ética University Health Network e do Trillium Gift of-Life Foundation, que supervisiona a doação de órgãos em Ontário, Canadá. 1. Preparação da dissecção Buffers e Meios de Cultura <ol><li> Para o isolamento da medula espinal de rato, a preparação de 100 ml de tampão de dissecção (1x PBS + 0,6% de glucose + 2% de penicilina-estreptomicina) e refrigerar. Para medula espinhal humana preparar 100 ml de tampão de dissecção (1x HBSS + 0,6% de glicose + 2% de penicilina-estreptomicina) e leve à geladeira. </li><li> Preparação de 100 ml de meio isento de soro (SFM) e aquecer a 37 ° C. Para preparar SFM, adiciona-se 2 mM de L-glutamina, 100 ug / ml-penicilina estreptomicina, 2% B27, e 10% de mistura de hormona-Neurobasal Um meio. Para preparar a mistura de hormona, fazer uma diluição 1: meio / F12 1 DMEM contendo 0,6% de glucose, 3 mM de NaHCO3, 5 mM de HEPES, 25 ng / ml de insulina, 100 ng / ml de apo-transf errina, putrescina 10 pM, 30 nM de selénio, e 20 nM de progesterona. </li><li> Prepara-se o enriquecida em factor de crescimento de EFH meios seletivos (SFM para adicionar 20 ng / ml de EGF, 20 ng / ml de bFGF, e 2 ug / ml de heparina) e aquecer a 37 ° C. Certifique-se de que EFH humano contém fatores de crescimento recombinantes humanos (ver Tabela de Materiais). </li></ol> 2. Colheita e dissecção de rato adulto Periventricular Spinal Cord Tissue <ol><li> Esterilizar instrumentos de dissecação em etanol e lave em soro fisiológico estéril, ou instrumentos de autoclave com antecedência. Submeter rato (6-8 semanas de idade) de uma injecção letal de pentobarbital de sódio (1 cc a 65 mg / ml) ou sobredose de anestésico (ou seja, 4% de isofluorano) de acordo com um protocolo aprovado pela instituição animal. Douse a parte traseira do rato com etanol a 70% e remover a pele na superfície dorsal com grandes tesouras de dissecação. </li><li> Segurando a tesoura perpendiculares à superfície dorsal, transversalmente cortar a coluna vertebral acima dos membros posteriores. Use tesouras pequenas para cortar longitudinalmente o músculo dorsal que se sobrepõe à coluna vertebral em direcção rostral para expor os processos espinhosos. </li><li> Começando na extremidade caudal exposto, inserir fórceps ou um pequeno instrumento de corte de osso romba extradurally para o aspecto lateral do canal vertebral no espaço entre a medula espinal e da coluna vertebral. Faça pequenos cortes na lâmina (arcos ósseos esquerda e direita dos processos espinhosos de cada lado das vértebras) e cuidadosamente descascar a lâmina para expor a medula espinhal (Figura 1A-D). Assegurar o ângulo das pás é raso e paralelo ao cabo de modo a medula espinhal subjacente não é danificado. </li><li> Continue laminectomy na direção rostral para exposum e da medula espinhal torácica e cervical. </li><li> Gentilmente extirpar a medula espinhal da coluna vertebral com uma pinça sem corte e uso microtesoura para cortar cuidadosamente as raízes para liberar o cabo. Coloque a medula espinal excisada numa placa de Petri contendo tampão de 4 ° C dissecção estéril de rato (descrito acima no ponto 1.1). Lave o tecido em tampão C dissecação 4 ° preparados na hora e usando uma tesoura cortar a medula espinhal transversalmente em 1 centímetro segmentos (Figura 1E). </li><li> Para cada segmento de tecido, usar uma mão para segurar o tecido com uma pinça fina. Com a outra mão, usar cuidadosamente microtesouras para remover as meninges sobrejacente, matéria branca, e a maior parte da matéria cinzenta com o auxílio de um escopo de dissecação. Em alternativa, usar uma pinça fina (Dumont # 4) para descascar a maior parte da matéria cinzenta e branca, deixando apenas a região periventricular da medula espinal que inclui o ependyma e uma pequena quantidade de matéria cinzenta circundante (Figura 1F-H).</li><li> A piscina do tecido periventricular dissecado em um prato de 10 centímetros estéril Petri contendo tampão dissecção rato frio. </li></ol> 3. Colheita e Dissecção da Human Adulto Periventricular Spinal Cord Tissue Nota: O tecido da medula espinal humano é colhido a partir de doadores de transplante de órgãos adultos (dadores variaram na idade de 2 a 60 anos de idade) após os outros órgãos foram removidos para o transplante de órgãos. O Trillium Gift of-Life Program obtém consentimento para a remoção de tecido para fins de pesquisa de familiares do paciente e notifica a nossa equipa de colheita em uma forma oportuna de tal modo que temos sido capazes de colher os cabos dentro de 2 horas de pinçamento aórtico. Doadores adultos masculinos e femininos com sorologia negativa e não há infecções são aceitos. <ol><li> Tecido colheita de uma forma estéril na sala de operação através de uma abordagem anterior usando a mesma exposição anterior já dissecados para remoção de órgãos pelo órgão transpequipa de colheita lant. </li><li> Expor a coluna vertebral anterior através de retração com grandes propagadores de costela e grandes afastadores de remo dos restantes tecidos e órgãos, incluindo os grandes vasos sanguíneos. </li><li> Utilize uma serra de esterno montado com uma lâmina longa para cortar através dos discos intervertebrais nas extremidades rostral e caudal do comprimento desejado da coluna vertebral a ser ressecado. Ângulo da serra cerca de 45 ° medial para cortar uma calha triangular a partir da parte lateral dos corpos vertebrais apenas evitando o canal espinhal. </li><li> Retirar em bloco os aspectos medial dos corpos vertebrais dos segmentos desejados com o auxílio de osteï¿½omos curvas e malho tendo o cuidado de evitar o corte através da dura-máter. Em seguida, levante suavemente a dura coberta medula espinal com pinças dentadas e agudamente inciso as extremidades rostrais e caudais do cabo. Use a tesoura e pinça para longas transecto bilateralmente as raízes individuais. </li><li> Colocar o segmento excisado da medula espinhal em 4 °; C tampão estéril (1x HBSS + 0,6% de glucose + 2% de penicilina-estreptomicina) num tubo de ensaio grande para o transporte para a sala de cultura do tecido. </li> <li> Nota: Em geral, uma 3 - segmento de 6 cm de medula espinal do torácica superior e / ou no meio-para-baixo nível torácico é removido na sala de operações sob condições estéreis, assim que possível após a interrupção da circulação e colocados em tampão estéril frio . O tempo decorrido entre a cessação da circulação e remoção da medula espinhal varia com o tempo necessário para colher os órgãos visados ​​para doação e variou entre 45 minutos e 2 horas. Se o coração e pulmões também foram removidos, a dissecção pode ser feita muito rostral para a colheita de uma porção da medula cervical inferior bem. </li><li> Dissecar o tecido da medula espinal humana, logo que possível após a colheita, geralmente no prazo de 3 horas. Remover a dura-máter e meninges outros com uma pinça. Lavar o tecido da medula espinhal em tampão C dissecção 4 ° frescos ecortado transversalmente em segmentos de 1 centímetro. </li><li> Com o auxílio de um escopo de dissecação, excisar as meninges sobrejacente, matéria branca, e a maior parte da massa cinzenta usando uma pinça, uma pinça fina e microtesouras para cada segmento de tecido. A piscina do tecido periventricular dissecados, que inclui o ependyma e uma pequena quantidade de matéria cinzenta em redor, em um prato de 10 centímetros estéril Petri contendo tampão dissecação humana frio. </li></ol> 4. Isolamento e Cultura de rato adulto e NSPCs da Medula Espinal Humanos <ol><li> Execute as seguintes etapas assepticamente numa câmara de fluxo laminar. <ol><li> Picar o rato dissecado ou tecido periventricular humana em um milímetro 3 peças com microtesoura. </li><li> Enzimaticamente dissociar o tecido moído com enzimas proteolíticas, utilizando o kit de dissociação de papaína como indicado na tabela de materiais / reagentes. Nota: Os componentes de reagentes incluem 4 frascos; Frasco 1: Solução Salina Equilibrada de Earle (EBSS), Frasco 2: contend papaínag de L-cisteína e EDTA, Frasco 3: desoxirribonuclease I (ADNase), Frasco 4: inibidor de protease ovomucóide com albumina de soro bovino (BSA). Nota: Nota: A papaína é uma protease sulfidrilo que tem larga especificidade para substratos proteicos. A papaína aqui é derivado do látex da planta Carica papaya e degrada a maior parte dos substratos proteicos mais ampla do que as proteases pancreáticas. Durante o processo de dissociação há algum dano celular, causando ADN a ser libertado para o meio de dissociação que vai aumentar a viscosidade e tornar difícil a pipetagem. Assim, a DNase é incluída no procedimento de isolamento de células para digerir o DNA, sem danificar as células intactas. Ovomucoids glicoproteína são inibidores da protease utilizados para inibir a actividade da papaína, após o passo de dissociação. </li></ol></li><li> Na primeira utilização, reconstituir a mistura de inibidor de albumina de ovomucóide (4 frasco) com 32 mL de EBSS (frasco 1), e, em seguida, armazenar a 4 ° C e usado para isolamentos subsequentes.Nota: Isto produz uma solução a uma concentração eficaz de 10 mg de inibidor de ovomucóide e 10 mg de albumina por ml. </li><li> Adiciona-se 5 mL de EBSS (frasco 1) para um frasco de papaína (frasco 2), obtendo-se uma solução a 20 unidades de papaina / ml em 1 mM de L-cisteína com EDTA 0,5 mM. Verificar que a solução de papaína aparece clara, após dissolução completa, de outra forma colocar o frasco num banho de água a 37 ° C durante 10 minutos até que a papaína esteja completamente dissolvido para assegurar a actividade total da enzima. </li><li> Adicionar 500 mL de EBSS (frasco 1) para um frasco de ADNase (frasco 3) e misturar delicadamente como ADNase cisalhamento é sensível à desnaturação. Adicionar 250 ul da solução de ADNase para o frasco contendo a papaína, resultando numa concentração final de aproximadamente 20 unidades / mL de papaína e 0,005% de DNase. Guardar o equilíbrio do frasco ADNase para usar mais tarde. </li><li> Colocar o rato picada ou tecido humano na solução de papaína como foi preparada na etapa 4.4 acima. Para o isolamento de tecido humano, o tecido dividido igualmente entre dois picadafrascos de papaína (cerca de 0,2 g / frasco). </li><li> Incubar a 37 ° C com agitação constante sobre uma plataforma basculante para dissociar o tecido em solução de papaína activada. Incubar tecido de rato durante 45 min a 1 h, e os tecidos humanos durante 1 a 2 horas, dependendo da quantidade de tecido moído, cerca de 0,2-0,4 g, respectivamente. </li><li> Tritura-se a mistura com uma pipeta de 10 ml a dissociar quaisquer pedaços de tecido restantes para se obter uma suspensão de células turva. Transferir a suspensão de célula (não incluem quaisquer pedaços de tecido não dissociado) em um tubo de 15 ml estéril e centrifugar a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Ressuspender as células peletizadas em meio contendo ovomucóide, um inibidor da papaína. <ol><li> Preparar a solução de ovomucóide por mistura de 2,7 mL de EBSS (1 frasco) com 300 ul da solução de inibidor de albumina-ovomucóide reconstituído (frasco 4) em um tubo de 15 ml. Adicione 150 ml de solução de ADNase (frasco 3) guardados no passo 4.4 acima. </li><li> Descartar o sobrenadante a partir deas células sedimentadas e imediatamente ressuspender o sedimento de células na mistura albumina-inibidor ADNase diluída. </li></ol></li><li> Células intactas a partir de membranas celulares separadas por centrifugação através de um único passo de gradiente de densidade descontínuo. <ol><li> Prepara-se o gradiente de densidade descontínuo, adicionando 5 ml de solução de albumina-inibidor (vial 4) para um tubo de 15 ml, e usando uma pipeta de 5 ml, e suavemente camada lentamente a suspensão de células (preparado como descrito acima no passo 4.8) na parte superior de a solução de albumina-inibidor. </li><li> Centrifugar a 70 xg durante 6 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Nota: A interface entre as duas camadas do gradiente deverá ser claramente visível, embora mistura mínima neste limite não afecta o resultado. Fragmentos de membrana permanecem na interface e células dissociadas sedimentar no fundo do tubo. </li></ol></li><li> Para as células de rato, descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 1 ml de meio de rato EFH (pré-aquecido a 37 ° C).Contagem de densidade de células vivas com um hemocitómetro e as células em placa num frasco de cultura T25, a uma densidade de 10 células / ul em EFH. O rendimento típico de células a partir de tecido de rato é cerca de 2 x 10 6 células, com cerca de 80% viability.If culturas clonais são desejadas células de sementes, com uma densidade de menos de 10 células / ul. Incubar os frascos a 37 ° C em 5% de CO 2 e permitir que as culturas a crescer em repouso durante uma semana para evitar a agregação das esferas. </li><li> Para células humanas, descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 10 ml de meio de EFH humano (pré-aquecido a 37 ° C). Filtra-se a suspensão de células através de um coador de células de 40 um seguido de nylon com 30 ml de EFH para remover fragmentos de mielina e células de membrana. Centrifuga-se a 300 xg durante 5 minutos e ressuspender o sedimento de células em 1 ml de meio de EFH. </li><li> Contagem de densidade de células vivas com um hemocitómetro e as células humanas placa em placas de cultura de 6 poços a uma densidade de 10 5 células / poço num volume totalde 5 ml de EFH / poço. O rendimento típico de células a partir de tecido humano é de cerca de 1 x 10 6 células, com cerca de 70% de viabilidade. Poços do pré-revestimento com um substrato aderente tal como Matrigel (ver nota abaixo). Dilui-se a uma razão de 40 ul de Matrigel: 1 ml de SFM. </li><li> Nota: Em alternativa, podem ser utilizados outros substratos aderentes, tais como poli-D-lisina / laminina, fibronectina, ou colagénio. </li><li> Incubar as placas a 37 ° C em 5% de CO 2 e permitir que as culturas a crescer em repouso durante uma semana. </li></ol> 5. Passaging de rato adulto e NSPCs medula espinhal humanos <ol><li> Rato NSPCs irá formar pequenas neuroesferas cerca de 70 um de diâmetro dentro de 1 semana de sementeira inicial; NSPCs passagem de rato semanais por recolha da suspensão de células, centrifugação a 300 xg durante 5 min, e triturando mecanicamente a pelete de células a dissociar as neuroesferas. </li><li> Semente as células dissociadas em frascos T25 contendo rato fresco meio EFH. Alternativamente,usar 50% de meio condicionado para rato passaging. O rendimento típico de NSPCs rato no passaging é de cerca de 5 x 10 6 células, o que aumenta exponencialmente com o número de passagens. </li><li> Para as culturas humanas, uma semana após o plaqueamento inicial, substituir metade do meio de cultura fresco com EFH duas vezes por semana para permitir que as células aderem ao substrato. Geralmente, 1-2 semanas mais tarde, uma vez que as células tenham anexado ao substrato, substituir todo o volume do meio de cultura duas vezes por semana com EFH fresco. </li><li> Células subcultura antes de atingir confluência entre 4-8 semanas. <ol><li> Subcultura de células destacando as células a partir do substrato enzimaticamente (ver Tabela de Materiais) com 2 ml de enzima por poço incubado durante cerca de 10 min a 37 ° C. Recolhe suspensão de células, centrifugar a 300 xg durante 5 min, e ressuspender cuidadosamente a pelete de células em 1 ml de meio de EFH acabado de fazer. </li><li> Contagem de células vivas com um hemocitómetro e as células placa em placas de cultura de 6 poços (pré-co-ATED como acima no passo 4.12) a uma densidade de 10 5 células / poço num volume total de 5 ml de EFH / poço. O rendimento típico de NSPCs humanos no passaging é de cerca de 2 x 10 6 células e, geralmente, isso vai dobrar com passagem. Geralmente, manter culturas com 50% de meio condicionado de EFH 2 - 3 vezes por semana entre passaging. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Durante a dissecção da medula espinal do tecido cuidados devem ser tomados para não danificar a medula espinhal durante a realização da laminectomia. É mais fácil isolar o tecido periventricular quando os segmentos da medula espinal estão intactos. Os segmentos de tecido deve ser totalmente imersa em tampão de dissecação e as meninges que recobrem e substância branca pode ser cortada como tiras longitudinais com microtesoura. Alternativamente, uma pinça fina pode ser usada para descascar a substância branc...

NSPCs são células multipotentes comprometidos com a linhagem neural que podem se auto renovar e expandir rapidamente in vitro. Nós nos referimos a essas células como uma população mista de células estaminais / progenitoras neurais uma vez que eles exibem propriedades de células-tronco multipotentes auto-renovação e progenitores mais restritas. NSPCs são encontradas tanto no cérebro fetal e adulto e na medula espinal 1,2. No adulto, NSPCs são normalmente quiescentes e residir dentro nichos específicas, incluindo a zona subventricular alinhando os ventrículos laterais de 2-4, e a região periventricular torno do canal central da medula espinal 5,6. Normalmente, NSPCs são cultivadas como neurospheres livre flutuação ou monocamadas como aderentes em meio isento de soro suplementado com EGF e bFGF, mitogens que selecionam para as populações de células estaminais / progenitoras. O ensaio neuroesfera originalmente desenvolvido por Reynolds e Weiss 2, é mais vulgarmente utilizado para a cultura eexpandir as células-tronco neurais. NSPCs mostram multipotência quando eles são plaqueadas em crescimento isento de factor de meio contendo soro, diferenciar-se em neurónios, astrócitos e oligodendrócitos. Multipotentes, NSPCs auto-renovação podem ser isoladas e cultivadas a partir da medula espinal roedor adulto quando o tecido cultivado inclui regiões do canal central 6,7. Uma vantagem potencial na utilização NSPCs gerados a partir da medula espinal adulta em oposição a geração de células a partir de outras regiões é que estas células de tecidos específicos mais se assemelham células na medula espinal que são perdidas ou danificadas após a lesão ou doença. Trabalhos anteriores mostraram que neuroesferas derivadas da medula espinal adulto humano não podia ser propagada a longo prazo ou passadas para gerar números suficientes de células de 8,9. No entanto, com modificações em condições de cultura, nós informamos a expansão e transplante de NSPCs derivadas de medula espinhal humanos adultos, o que demonstra que a auto-renovaçãoe NSPCs multipotentes podem ser isolados a partir da medula espinal humano adulto de 10 doadores de transplante de órgãos. Em primeiro lugar, a remoção da maior parte da matéria branca durante a dissecção e a cultura destas células em um substrato aderente em meio de crescimento enriquecido com factor seleccionado para a proliferação de adultos humanos NSPCs da medula espinal. Neste protocolo, descrevemos a colheita da medula espinhal de ratos adultos e de dadores humanos de transplante de órgãos, a dissecção do tecido periventricular, e o isolamento, e expansão da cultura NSPCs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#10010023</td>
			<td>Dissection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#14175095</td>
			<td>Dissection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># G-6152</td>
			<td>Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#15140-148</td>
			<td>Dissection buffer and culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal-A&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#10888-022</td>
			<td>Culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine, 200mM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#25030-081</td>
			<td>Culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#12587010</td>
			<td>Culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#11885084</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#21700-075</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># S-5761</td>
			<td>Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#H9136</td>
			<td>Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#I-5500</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#T-2252</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># P7505</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selenium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#S-9133</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P-6149</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF, mouse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#E4127</td>
			<td>Prepare 100 &#956;g/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF, human recombinant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#E9644</td>
			<td>Prepare 100 &#956;g/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF, human recombinant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#F0291</td>
			<td>Prepare 100 &#956;g/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin, 10000U</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#H3149</td>
			<td>Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain dissociation kit</td>
			<td>Worthington Biochemicals</td>
			<td>#LK003150</td>
			<td>Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pentobarbital</td>
			<td>Bimeda &#8211; MTC Animal Health Inc</td>
			<td>DIN 00141704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps: Addisons</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#11006-12&#160;</td>
			<td>Serrated standard tip; micro-tip also available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps: Dumont #4</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#11241-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#15024-10</td>
			<td>Round-handled Vannas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeurs</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>N1430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mm Petri dishes&#160;</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Culture flasks</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA21008-949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>CA73520-906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, growth factor reduced (100X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 &#956;l Matrigel: 1 ml SFM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord

Rato adulto e medula espinhal células humanas neuronais estaminais / progenitoras (NSPCs) cultivadas em meio de crescimento enriquecido com fator permite a proliferação de multipotentes, e células-tronco neurais expansíveis auto-renovação. Em condições de soro, estes NSPCs multipotentes vai diferenciar, gerando neurônios, astrócitos e oligodendrócitos. O tecido colhido é enzimaticamente dissociada em uma solução de papaína-EDTA e depois dissociados mecanicamente e separado através de um gradiente de densidade descontínuo para produzir uma suspensão de célula única que é banhado em meio neurobasal suplementado com factor de crescimento epidérmico (EGF), factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF ), e heparina. Rato adulto NSPCs medula espinhal são cultivadas como neurospheres livre flutuação e adulto humanos NSPCs da medula espinhal são cultivadas como culturas aderentes. Sob estas condições, adultos NSPCs medulares proliferam, expressam marcadores de células precursoras, e pode ser continuamente aumentada passagem. Estas células pode be estudada in vitro em resposta a vários estímulos, e factores exógenos pode ser usada para promover a restrição de linhagem para examinar a diferenciação de células estaminais neurais. Multipotentes NSPCs ou sua progénie também podem ser transplantadas em vários modelos animais para avaliar a reparação regenerativa.

Rato adulto células da medula espinhal crescidas em cultura em suspensão em meio EFH irá formar pequenas neurospheres (colônias de células indiferenciadas) dentro de uma semana de plaqueamento inicial. Em culturas primárias, a maioria das células plaqueadas morrerão de crescimento e factor de células estaminais que respondem irão proliferar e são seleccionados de EFH no meio. Por passagem 3, não haverá numerosas neuroesferas livre flutuação de cerca de 100 um de diâmetro (Figura 2A). As ...

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Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

Isolamento de Neural Stem / células progenitoras da Região Periventricular do rato adulto e Medula Espinhal Humano

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

isolation-neural-stemprogenitor-cells-from-periventricular-region

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.1K visualizações.  Toronto Western Research Institute and Krembil Neuroscience Center. The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors. 

Vídeo: Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

Isolamento e expansão de CTM / células estromais derivadas de placenta humana Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Biologia do Desenvolvimento

Isolation and Expansion of Adult Canine Hippocampal Neural Precursors

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural intermediacy between the rodent and human hippocampi, is therefore a valuable model in which to study adult neurogenesis. In vitro culture assays are an essential component of characterizing neurogenesis and adult neural precursor cells, allowing for precise control over the cellular environment. To date however, culture protocols for canine cells remain under-represented in the literature. Detailed here are systematic protocols for the isolation and culture of hippocampal neural precursor cells from the adult canine brain. We demonstrate the expansion of canine neural precursor cells as floating neurospheres and as an adherent monolayer culture, producing stable cell lines that are able to differentiation into mature neural cell types in vitro. Adult canine neural precursors are an underused resource that may provide a more faithful analogue for the study of human neural precursors and the cellular mechanisms of adult neurogenesis.

The canine brain is a valuable model in which to study adult neurogenesis. Presented here are protocols for isolating and expanding adult canine hippocampal neural precursor cells from primary brain tissue.

Isolamento e Expansão da mediana Canino hipocampo Neurais Precursores

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

Isolamento e Caracterização de células mesenquimais do estroma a partir de cordão umbilical humano e Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. Currently, efforts are being made to regenerate damaged cartilage with ex vivo expanded chondrocytes or bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs). However, the restricted viability and instability of these cells limit their application in cartilage reconstruction. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have received scientific attention as a new alternative for regenerative applications. With unlimited self-renewal ability and multipotency, hiPSCs have been highlighted as a new replacement cell source for cartilage repair. However, obtaining a high quantity of high-quality chondrogenic pellets is a major challenge to their clinical application. In this study, we used embryoid body (EB)-derived outgrowth cells for chondrogenic differentiation. Successful chondrogenesis was confirmed by PCR and staining with alcian blue, toluidine blue, and antibodies against collagen types I and II (COL1A1 and COL2A1, respectively). We provide a detailed method for the differentiation of cord blood mononuclear cell-derived iPSCs (CBMC-hiPSCs) into chondrogenic pellets.

Here, we propose a protocol for chondrogenic differentiation from cord blood mononuclear cell-derived human induced pluripotent stem cells.

Formação de grânulos condrogénicos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por sangue do cordão umbilical

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and colleagues1. Later, others documented the existence of similar types of EPCs originating from bone marrow2,3. More recently, Yoder and Ingram showed that EPCs derived from umbilical cord blood had a higher proliferative potential compared to ones isolated from adult peripheral blood4,5,6. Apart from being involved in postnatal vasculogenesis, EPCs have also shown promise as a cell source for creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs7,8. Various isolation protocols exist, some of which involve the cell sorting of mononuclear cells (MNCs) derived from the sources mentioned earlier with the help of endothelial and hematopoietic markers, or culturing these MNCs with specialized endothelial growth medium, or a combination of these techniques9. Here, we present a protocol for the isolation and culture of EPCs using specialized endothelial medium supplemented with growth factors, without the use of immunosorting, followed by the characterization of the isolated cells using Western blotting and immunostaining.

The goal of this protocol is to isolate endothelial progenitor cells from umbilical cord blood. Some of the applications include using these cells as a biomarker for identifying patients with cardiovascular risk, treating ischemic diseases, and creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs.

Isolamento de células progenitoras endoteliais de sangue humano do Cordão Umbilical

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and neurite outgrowth; and later stages characterized by axon/dendrite outgrowth and synapse formation. In neurodevelopmental disorders, often one or more of these processes are disrupted, leading to abnormalities in brain formation and function. With the advent of human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology, researchers now have an abundant supply of human cells that can be differentiated into virtually any cell type, including neurons. These cells can be used to study both normal brain development and disease pathogenesis. A number of protocols using hiPSCs to model neuropsychiatric disease use terminally differentiated neurons or use 3D culture systems termed organoids. While these methods have proven invaluable in studying human disease pathogenesis, there are some drawbacks. Differentiation of hiPSCs into neurons and generation of organoids are lengthy and costly processes that can impact the number of experiments and variables that can be assessed. In addition, while post-mitotic neurons and organoids allow the study of disease-related processes, including dendrite outgrowth and synaptogenesis, they preclude the study of earlier processes like proliferation and migration. In neurodevelopmental disorders, such as autism, abundant genetic and post-mortem evidence indicates defects in early developmental processes. Neural precursor cells (NPCs), a highly proliferative cell population, may be a suitable model in which to ask questions about ontogenetic processes and disease initiation. We now extend methodologies learned from studying development in mouse and rat cortical cultures to human NPCs. The use of NPCs allows us to investigate disease-related phenotypes and define how different variables (e.g., growth factors, drugs) impact developmental processes including proliferation, migration, and differentiation in only a few days. Ultimately, this toolset can be used in a reproducible and high-throughput manner to identify disease-specific mechanisms and phenotypes in neurodevelopmental disorders.

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs

Neurodevelopmental processes such as proliferation, migration, and neurite outgrowth are often perturbed in neuropsychiatric diseases. Thus, we present protocols to rapidly and reproducibly assess these neurodevelopmental processes in human iPSC-derived NPCs. These protocols also allow the assessment of the effects of relevant growth factors and therapeutics on NPC development.

Detecção rápida de desenvolvimento neurológico fenótipos nas células precursoras neurais humanas (NPCs)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

O isolamento e a cultura de células primárias de Epicárdica derivado de espécimes de coração adulto e Fetal humano

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally isolated and characterized from bone marrow (BM), then acquired from tissues including adipose tissue, synovium, skin, dental pulp, and fetal appendages such as placenta, umbilical cord blood (UCB), and umbilical cord (UC). MSCs are a heterogeneous cell population with the capacity for (1) adherence to plastic in standard culture conditions, (2) surface marker expression of CD73+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-/CD14-/CD19-/HLA-DR- phenotypes, and (3) trilineage differentiation into adipocytes, osteocytes, and chondrocytes, as currently defined by the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Although BM is the most widely used source of MSCs, the invasive nature of BM aspiration ethically limits its accessibility. Proliferation and differentiation capacity of MSCs obtained from BM generally decline with the age of the donor. In contrast, fetal MSCs obtained from UC have advantages such as vigorous proliferation and differentiation capacity. There is no ethical concern for UC sampling, as it is typically regarded as medical waste. Human UC starts to develop with continuing growth of the amniotic cavity at 4-8 weeks of gestation and keeps growing until reaching 50-60 cm in length, and it can be isolated during the whole newborn delivery period. To gain insight into the pathophysiology of intractable diseases, we have used UC-derived MSCs (UC-MSCs) from infants delivered at various gestational ages. In this protocol, we describe the isolation and characterization of UC-MSCs from fetuses/infants at 19-40 weeks of gestation.

Human umbilical cord (UC) can be obtained during the perinatal period as a result of preterm, term, and postterm delivery. In this protocol, we describe the isolation and characterization of UC-derived mesenchymal stem cells (UC-MSCs) from fetuses/infants at 19-40 weeks of gestation.

Isolamento e caracterização de células humanas de Cordão Umbilical-derivados mesenquimais haste de prematuros e recém-nascidos de termo

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

Geração de organoides pele 3D do cordão hemoderivados induzida por células-tronco pluripotentes

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a differentiation state to sustain demands of the blood formation. However, it has been difficult to analyze the metabolic status (mitochondrial respiration and glycolysis) of HSPCs due to their limited numbers and lack of optimized protocols for non-adherent, fragile HSPCs. Here, we provide a set of clear, step-by-step instructions to measure metabolic respiration (oxygen consumption rate; OCR) and glycolysis (extracellular acidification rate; ECAR) of murine bone marrow-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs. This protocol provides a higher amount of LSK HSPCs from murine bone marrow, improves the viability of HSPCs during incubation, facilitates extracellular flux analyses of non-adherent HSPCs, and provides optimized injection protocols (concentration and time) for drugs targeting oxidative phosphorylation and glycolytic pathways. This method enables the prediction of the metabolic status and the health of HSPCs during blood development and diseases.

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) transition from a quiescent state to a differentiation state due to their metabolic plasticity during blood formation. Here, we present an optimized method for measuring mitochondrial respiration and glycolysis of HSPCs.