The authors would like to acknowledge support from Spinal Cord Injury Ontario, the Ontario-China Research and Innovation Fund, the Toronto General and Western Hospital Foundation, and Physicians&#8217; Services Incorporated Foundation. The authors thank Dr. Tasneem Zahir for expert advice in human spinal cord NSPC culture, and Drs. Cindi Morshead and Iris Kulbatski for their expert advice in rat spinal cord NSPC isolation.

Tutte le procedure di animali sono approvati dal Comitato cura degli animali della University Health Network, Toronto ON Canada, in conformità con le politiche stabilite nella Guida per la cura e l&#39;uso degli animali sperimentali predisposti dal Consiglio canadese cura degli animali. Per la raccolta di tessuto del midollo spinale umano, l&#39;approvazione è stata ottenuta dal Research Ethics Consiglio University Health Network e dal Trillium Gift of-Life Foundation che sovrintende la donazione di organi in Ontario, Canada. 1. Preparazione di dissezione buffer e cultura dei media <ol><li> Per l&#39;isolamento di topo midollo spinale, la preparazione di 100 ml di buffer dissezione (1x PBS + 0,6% di glucosio + 2% di penicillina-streptomicina) e conservare in frigorifero. Per midollo spinale umano preparare 100 ml di tampone di dissezione (1x HBSS + 0,6% di glucosio + 2% di penicillina-streptomicina) e conservare in frigorifero. </li><li> Preparare 100 ml di mezzo privo di siero (SFM) e calda a 37 ° C. Per preparare SFM, aggiungere 2 mM L-glutammina, 100 mg / ml di penicillina-streptomicina, 2% B27, e il 10% della miscela ormone Neurobasal-A medio. Per preparare mix ormonale, fare un 1: medio / F12 1 DMEM contenente 0,6% di glucosio, 3 NaHCO mm 3, 5 mM HEPES, 25 mg / ml di insulina, 100 mg / ml apo-transferrina, 10 micron putrescina, 30 nm selenio, e 20 nM progesterone. </li><li> Preparare la crescita EFH fattore arricchita di placcatura dei media (a SFM aggiungere 20 ng / ml EGF, 20 ng / ml bFGF, e 2 mg / ml di eparina) e calda a 37 ° C. Assicurarsi che EFH umano contiene fattori di crescita ricombinante umano (vedi Tabella dei Materiali). </li></ol> 2. La raccolta e la dissezione di Adult Rat periventricolare midollo spinale Tissue <ol><li> Sterilizzare strumenti sezionare in etanolo e risciacquare in soluzione fisiologica sterile, o strumenti autoclave in anticipo. Dare rat (6-8 settimane) una iniezione letale di pentobarbital di sodio (1 cc a 65 mg / ml) o overdose di anestetico (vale a dire, il 4% isofluorane) secondo una dell&#39;ente approvato protocollo animale. Douse parte posteriore del ratto con 70% etanolo e rimuovere la pelle sulla superficie dorsale con grandi forbici dissezione. </li><li> Tenendo le forbici perpendicolari alla superficie dorsale, trasversalmente tagliare la colonna vertebrale sopra arti posteriori. Usare le forbici piccole per longitudinalmente tagliare il muscolo dorsale sovrastante la colonna vertebrale in una direzione rostrale per esporre i processi spinosi. </li><li> A partire dalla fine caudale esposta, inserire rongeurs o un piccolo strumento osso-taglio smussato extradurally nella parte laterale del canale spinale nello spazio tra il midollo spinale e la colonna vertebrale. Fare piccoli tagli nella lamina (archi ossee a destra ea sinistra delle apofisi spinose su ogni lato delle vertebre) e con attenzione staccarsi la lamina per esporre il midollo spinale (Figura 1A-D). Verificare l&#39;angolo delle pale è bassa e parallela al cavo in modo che il midollo spinale sottostante non sia danneggiato. </li><li> Continuare laminectomia in direzione rostrale a fierevia e il midollo spinale toracico e cervicale. </li><li> Accise delicatamente il midollo spinale dalla colonna vertebrale, con una pinza di tessuto smussato e uso microscissors per tagliare con attenzione alle radici per rilasciare il cavo. Posizionare il midollo spinale asportato in una capsula di Petri contenente 4 ° C tampone sterile dissezione ratto (descritto in 1.1). Lavare il tessuto in appena preparato 4 ° C tampone dissezione e con le forbici hanno tagliato il midollo spinale trasversalmente in 1 centimetro segmenti (Figura 1E). </li><li> Per ogni segmento di tessuto, usare una mano per tenere il tessuto con una pinza sottile. Con l&#39;altra mano, utilizzare microscissors per rimuovere con attenzione le meningi sovrastanti, sostanza bianca, e la maggior parte della materia grigia con l&#39;aiuto di un ambito dissezione. In alternativa, utilizzare una pinza sottile (Dumont 4 #) a staccarsi maggior parte della materia grigia e bianca, lasciando solo la regione periventricolare del midollo spinale che comprende la ependyma e una piccola quantità di materia grigia circostante (Figura 1F-H).</li><li> Pool il tessuto periventricolare sezionato in una capsula di Petri 10 centimetri sterile contenente freddo tampone dissezione ratto. </li></ol> 3. La raccolta e la dissezione di Adult periventricolare umana midollo spinale Tessuto Nota: il tessuto del midollo spinale umano è raccolto da donatori di trapianto di organi adulti (i donatori avevano un&#39;età compresa 2-60 anni) dopo che gli altri organi sono stati rimossi per il trapianto di organi. Il Trillium Gift of-Life Program ottiene il consenso per la rimozione di tessuto per la ricerca da parte della famiglia del paziente e avvisa il nostro team di raccolta in modo tempestivo in modo che siamo stati in grado di raccogliere le corde entro 2 ore di clampaggio aortico. Si accettano donatori adulti maschili e femminili con sierologia negativa e senza infezioni. <ol><li> Tessuto raccolto in un modo sterile in sala operatoria attraverso un approccio anteriore utilizzando la stessa esposizione anterior già sezionato per la rimozione di organi dal transp organosquadra raccolta lant. </li><li> Esporre la colonna spinale anteriore attraverso svincolo con grandi crocette costola e grandi divaricatori paddle dei rimanenti tessuti e organi, tra cui i grandi vasi sanguigni. </li><li> Utilizzare una sega sternale montato con una lunga lama per tagliare i dischi intervertebrali alle estremità rostrale e caudale della lunghezza desiderata della colonna vertebrale, per essere asportato. Angolo della sega circa 45 ° medialmente per tagliare un trogolo triangolare dalla parte laterale dei corpi vertebrali fermandosi poco prima del canale spinale. </li><li> Togliere in blocco gli aspetti mediali dei corpi vertebrali dei segmenti desiderati con l&#39;ausilio di osteotomi curve e maglio avendo cura di evitare il taglio attraverso la dura. Sollevare delicatamente la dura ricoperta midollo spinale con una pinza dentata e fortemente incidere le estremità rostrale e caudale del cavo. Utilizzare lunghe forbici e pinze per transetto bilateralmente le singole radici. </li><li> Posizionare il segmento asportato del midollo spinale in 4 °; C tampone sterile (1x HBSS + 0,6% di glucosio + 2% di penicillina-streptomicina) in una grande provetta per il trasporto verso la camera di coltura tissutale. </li> <li> Nota: Generalmente, un 3 - segmento 6 cm midollo spinale dal toracico superiore e / o medio-basso livello toracico viene rimosso in sala operatoria in condizioni sterili non appena possibile dopo la cessazione della circolazione e posto in fredda tampone sterile . Il tempo trascorso tra la cessazione della circolazione e la rimozione del midollo spinale varia con il tempo necessario per raccogliere gli organi bersaglio per la donazione e variava da 45 minuti a 2 ore. Se il cuore e polmoni sono anche state rimosse, la dissezione può essere preso lontano rostrally per raccogliere una porzione del midollo cervicale inferiore. </li><li> Sezionare il tessuto del midollo spinale umano il più presto possibile dopo la raccolta, generalmente entro 3 ore. Rimuovere la dura e altri meningi con una pinza. Sciacquare il tessuto del midollo spinale in appena fatto 4 ° C tampone dissezione etagliate trasversalmente in 1 centimetro segmenti. </li><li> Con l&#39;aiuto di un ambito dissezione, accise meningi sovrastanti, sostanza bianca, e la maggior parte della materia grigia con pinze dei tessuti, una pinza sottile e microscissors per ogni segmento del tessuto. Pool tessuto periventricolare sezionato, che include il ependima e una piccola quantità di materia grigia circostante, in una piastra di Petri 10 centimetri sterile contenente freddo tampone dissezione umana. </li></ol> 4. L&#39;isolamento e coltura di Adult Rat e NSPCs midollo spinale umano <ol><li> Effettuare le seguenti operazioni asetticamente in una cappa a flusso laminare. <ol><li> Tritare il ratto sezionato o tessuto periventricolare umana in 1 mm 3 pezzi con microscissors. </li><li> Enzimaticamente dissociare il tessuto macinata con enzimi proteolitici utilizzando il kit di dissociazione papaina come indicato nella tabella di materiali / reagenti. Nota: i componenti dei reagenti includono 4 flaconcini; Fiala 1: soluzione salina bilanciata di Earle (EBSS), Fiala 2: contenent papainag L-cisteina e EDTA, Fiala 3: Deoxyribonuclease I (DNasi), Fiala 4: inibitore della proteasi ovomucoid con albumina sierica bovina (BSA). Nota: Nota: La papaina è una proteasi solfidrile che ha un&#39;ampia specificità per i substrati di proteine. La papaina qui è derivato dal lattice dall&#39;impianto papaya Carica e degrada maggior parte dei substrati proteici più esteso rispetto proteasi pancreatiche. Durante il processo di dissociazione c&#39;è qualche danno cellulare del DNA che causano per essere rilasciato nel medium di dissociazione che aumenterà la viscosità e rendere pipettaggio difficile. Così, DNase è inclusa nella procedura di isolamento cellulare per digerire il DNA senza danneggiare le cellule intatte. Ovomucoids sono glicoproteina inibitori della proteasi utilizzati per inibire l&#39;attività papaina dopo la fase di dissociazione. </li></ol></li><li> Al primo utilizzo, ricostituire la miscela inibitore albumina ovomucoid (fiala 4) con 32 ml di EBSS (fiala 1), e quindi conservare a 4 ° C e utilizzare per isolamenti successive.Nota: Si ottiene una soluzione ad una concentrazione efficace di 10 mg di inibitore ovomucoid e 10 mg di albumina per ml. </li><li> Aggiungere 5 ml di EBSS (fiala 1) per una fiala papaina (fiala 2), ottenendo una soluzione a 20 unità di papaina / ml in 1 mM L-cisteina con EDTA 0,5 mm. Verificare che la soluzione papaina appare chiaro quando disciolto completamente, altrimenti posizionare il flacone in un bagno di acqua 37 ° C per dieci minuti fino a quando la papaina è completamente sciolto a garantire la piena attività dell&#39;enzima. </li><li> Aggiungere 500 ml di EBSS (fiala 1) per una fiala DNasi (fiala 3) e mescolare delicatamente come DNasi è sensibile al taglio denaturazione. Aggiungere 250 microlitri della soluzione di DNasi al flaconcino contenente la papaina, ottenendo una concentrazione finale di circa 20 unità / ml papaina e 0,005% DNasi. Salvare l&#39;equilibrio della fiala DNasi da utilizzare in seguito. </li><li> Posizionare il ratto macinate o tessuti umani nella soluzione papaina come preparata al precedente punto 4.4. Per l&#39;isolamento tessuto umano, suddividere il tessuto tritato equamente tra duefiale papaina (circa 0,2 g / flacone). </li><li> Incubare a 37 ° C con agitazione costante su una piattaforma rocker dissociare il tessuto nella soluzione papaina attivato. Incubare tessuti di ratto per 45 minuti a 1 ora, e tessuti umani per 1 a 2 ore a seconda della quantità di tessuto tritato, circa 0,2-0,4 g rispettivamente. </li><li> Triturare la miscela con una pipetta 10 ml di dissociare eventuali pezzi di tessuto rimanenti per produrre una sospensione cellulare torbida. Trasferire la sospensione cellulare (non includono pezzi di tessuto non dissociato) in una sterile tubo da 15 ml e centrifugare a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Risospendere le cellule pellet in terreno contenente ovomucoid, un inibitore della papaina. <ol><li> Preparare la soluzione ovomucoid mescolando 2,7 ml EBSS (fiala 1) con 300 ml di soluzione di albumina-inibitore ovomucoid ricostituito (flaconcino 4) in un tubo da 15 ml. Aggiungere 150 ml di soluzione di DNasi (fiala 3) salvato in precedente punto 4.4. </li><li> Eliminare il surnatante dale cellule pellet e immediatamente risospendere il pellet cellulare nella miscela di albumina-inibitore DNasi diluito. </li></ol></li><li> Cellule intatte separati da membrane cellulari mediante centrifugazione attraverso un unico passaggio gradiente di densità discontinuo. <ol><li> Preparare il gradiente di densità discontinuo aggiungendo 5 ml di soluzione di albumina-inibitore (fiala 4) in una provetta da 15 ml, e utilizzando una pipetta da 5 ml, delicatamente e lentamente strato la sospensione cellulare (preparato come descritto in precedenza al passo 4.8) sopra la soluzione di albumina-inibitore. </li><li> Centrifugare a 70 xg per 6 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Nota: L&#39;interfaccia tra i due strati di gradiente deve essere chiaramente visibile, anche se miscelazione minima in quel punto non influisce sul risultato. Frammenti di membrana rimangono all&#39;interfaccia e cellule dissociate pellet sul fondo della provetta. </li></ol></li><li> Per le cellule di ratto, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 ml di ratto EFH media (pre-riscaldato a 37 ° C).Contare densità cellulare in tempo reale con un emocitometro e piastra le cellule in un pallone di coltura T25 ad una densità di 10 cellule / microlitro in EFH. La resa tipica di cellule da tessuto di ratto è di circa 2 x 10 6 cellule con circa il 80% viability.If colture clonali sono desiderati, alveoli con una densità inferiore a 10 cellule / microlitro. Incubare le beute a 37 ° C in 5% CO 2 e consentire le culture di crescere indisturbata per 1 settimana per evitare l&#39;aggregazione di sfere. </li><li> Per le cellule umane, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di terreno EFH umana (pre-riscaldato a 37 ° C). Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino 40 micron cella nylon seguita con 30 ml di EFH per rimuovere frammenti mielina e membrana cellulare. Centrifugare a 300 xg per 5 minuti e risospendere il pellet cellulare in 1 ml di EFH media. </li><li> Contare densità cellulare in tempo reale con un emocitometro e piastra cellule umane in piastre di coltura da 6 pozzetti ad una densità di 10 5 cellule / pozzetto in un volume totaledi 5 ml EFH / bene. La resa tipica di cellule da tessuto umano è di circa 1 x 10 6 cellule con circa il 70% redditività. Pozzi Pre-coat con un substrato aderenti come Matrigel (vedi nota sotto). Diluire con un rapporto di 40 microlitri Matrigel: 1 ml SFM. </li><li> Nota: In alternativa, possono essere utilizzati altri substrati aderenti come il poli-D-lisina / laminina, fibronectina o collagene. </li><li> Incubare le piastre a 37 ° C in 5% CO 2 e consentire le culture di crescere indisturbata per 1 settimana. </li></ol> 5. Passaging di ratto adulto e NSPCs midollo spinale umano <ol><li> NSPCs Rat formeranno piccoli neurosfere di circa 70 micron di diametro entro 1 settimana dalla semina iniziale; NSPCs passaggio ratto settimanali raccogliendo la sospensione cellulare, centrifugazione a 300 xg per 5 min, e triturazione meccanicamente il pellet cellulare dissociare le neurosfere. </li><li> Seme le cellule dissociate in fiasche T25 contenenti ratto fresco EFH medio. Alternativamente,utilizzare il 50% di media ratto condizionata per passaging. La resa tipica di NSPCs ratto a passaging è di circa 5 x 10 6 cellule che aumenta in maniera esponenziale con il numero di passaggio. </li><li> Per le culture umane, una settimana dopo la placcatura iniziale, sostituire la metà del terreno di coltura con fresca EFH due volte alla settimana per permettere alle cellule di aderire al substrato. Generalmente, 1 - 2 settimane dopo una volta che le cellule sono attaccate al substrato, sostituire l&#39;intero volume del terreno di coltura due volte alla settimana con EFH fresca. </li><li> Cellule Subculture prima di raggiungere confluenza tra 4-8 settimane. <ol><li> Cellule Subculture staccando le cellule dal substrato enzimatica (vedere Tabella dei materiali) con 2 ml di enzima per pozzetto incubate per circa 10 minuti a 37 ° C. Raccogliere sospensione cellulare, centrifugare a 300 xg per 5 minuti, e risospendere delicatamente il pellet cellulare in 1 ml di appena fatto medio EFH. </li><li> Contare le cellule vive con un emocitometro e piastra le cellule in piastre di coltura 6 pozzetti (pre-coated come sopra al punto 4.12) ad una densità di 10 5 cellule / pozzetto in un volume totale di 5 ml EFH / pozzetto. La resa tipica di NSPCs umani a passaging è di circa 2 x 10 6 cellule e, in generale questo sarà il doppio con il passaggio. In generale, mantenere le culture con il 50% di media condizionata EFH 2 - 3 volte a settimana tra passaging. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Durante la dissezione del midollo spinale di ratto cura tessuto dovrebbe essere presa non danneggiare il midollo spinale durante l&#39;esecuzione della laminectomia. È facile isolare il tessuto periventricular quando i segmenti del midollo spinale sono intatti. I segmenti di tessuto devono essere completamente immersi in tampone dissezione e le meningi sovrastanti e della sostanza bianca possono essere tagliate via come strisce longitudinali con microscissors. In alternativa, pinze dei tessuti fini possono essere utili...

NSPCs sono cellule multipotenti impegnate per il lignaggio neurale che possono auto rinnovarsi e facilmente espandere in vitro. Ci riferiamo a queste cellule come una popolazione mista di cellule staminali / progenitrici neurali dal momento che espongono proprietà delle cellule staminali multipotenti auto-rinnovamento e progenitori più ristretti. NSPCs si trovano sia nel cervello fetale e adulto e il midollo spinale 1,2. Nell&#39;adulto, NSPCs sono normalmente quiescenti e di soggiornare all&#39;interno di nicchie specifiche, tra cui la zona subventricolare rivestimento dei ventricoli laterali 2-4, e la regione periventricolare che circonda il canale centrale del 5,6 del midollo spinale. In genere, NSPCs sono coltivate come neurosfere fluttuanti o monostrato come aderenti in mezzo privo di siero integrato con EGF e bFGF, mitogeni che selezionano per le popolazioni di cellule staminali / progenitrici. Il saggio neurosfere originariamente sviluppato da Reynolds e Weiss 2, è più comunemente usato per la cultura eespandere le cellule staminali neurali. NSPCs mostrano multipotenza quando sono placcati in siero terreno contenente senza fattore di crescita, differenziarsi in neuroni, astrociti, oligodendrociti e. Multipotenti, NSPCs auto-rinnovamento possono essere isolate e coltivate da roditore midollo spinale adulto quando il tessuto coltivato comprende le regioni del canale centrale 6,7. Un potenziale vantaggio nell&#39;utilizzo NSPCs generati dal midollo spinale adulto al contrario di generare cellule da altre regioni è che queste cellule tessuto-specifiche più simili cellule del midollo spinale che sono perso o danneggiato seguenti infortunio o malattia. Lavoro precedente ha mostrato che neurosfere derivate dal midollo spinale adulto umano non vengano estese a lungo termine o diversi passaggi per generare un numero sufficiente di cellule 8,9. Tuttavia, con modificazioni in condizioni di coltura, abbiamo riportato l&#39;espansione e trapianto di midollo NSPCs derivati ​​da spinale umani adulti, dimostrando che l&#39;auto-rinnovamentoe NSPCs multipotenti possono essere isolate dal midollo spinale adulto umano dei donatori di trapianto di organi 10. Principalmente, la rimozione della maggior parte della sostanza bianca durante la dissezione e coltura di tali cellule su un substrato aderente in crescita a medio fattore arricchito selezionato per proliferanti adulti NSPCs midollo spinale umano. In questo protocollo si descrive la raccolta del midollo spinale di ratto adulto e da donatori umani di trapianto di organi, la dissezione dei tessuti periventricolare, e l&#39;isolamento, la cultura e l&#39;espansione di NSPCs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#10010023</td>
			<td>Dissection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#14175095</td>
			<td>Dissection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># G-6152</td>
			<td>Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#15140-148</td>
			<td>Dissection buffer and culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal-A&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#10888-022</td>
			<td>Culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine, 200mM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#25030-081</td>
			<td>Culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#12587010</td>
			<td>Culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#11885084</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#21700-075</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># S-5761</td>
			<td>Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#H9136</td>
			<td>Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#I-5500</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#T-2252</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># P7505</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selenium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#S-9133</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P-6149</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF, mouse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#E4127</td>
			<td>Prepare 100 &#956;g/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF, human recombinant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#E9644</td>
			<td>Prepare 100 &#956;g/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF, human recombinant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#F0291</td>
			<td>Prepare 100 &#956;g/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin, 10000U</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#H3149</td>
			<td>Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain dissociation kit</td>
			<td>Worthington Biochemicals</td>
			<td>#LK003150</td>
			<td>Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pentobarbital</td>
			<td>Bimeda &#8211; MTC Animal Health Inc</td>
			<td>DIN 00141704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps: Addisons</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#11006-12&#160;</td>
			<td>Serrated standard tip; micro-tip also available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps: Dumont #4</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#11241-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#15024-10</td>
			<td>Round-handled Vannas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeurs</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>N1430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mm Petri dishes&#160;</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Culture flasks</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA21008-949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>CA73520-906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, growth factor reduced (100X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 &#956;l Matrigel: 1 ml SFM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord

Ratto adulto e del midollo spinale cellule neurali staminali / progenitrici umane (NSPCs) coltivate in crescita a medio fattore arricchito consente la proliferazione di multipotenti, e le cellule staminali neurali espandibili auto-rinnovamento. In condizioni di siero, questi NSPCs multipotenti si differenziano, generando neuroni, astrociti, oligodendrociti e. Il tessuto raccolto viene enzimaticamente dissociato in una soluzione di papaina-EDTA e poi dissociato meccanicamente e separati mediante un gradiente di densità discontinuo per produrre una sospensione di cellule singole che è placcato in medium Neurobasal supplementato con fattore di crescita epidermico (EGF), fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF ), ed eparina. Ratto adulto NSPCs midollo spinale sono coltivate come neurosfere libero di fluttuare e adulti NSPCs midollo spinale umano vengono coltivate come le culture aderenti. In queste condizioni, per adulti NSPCs midollo spinale proliferano, i marcatori espressi di cellule precursori, e possono essere continuamente ampliati al passaggio. Queste cellule possono be studiato in vitro in risposta a vari stimoli, e fattori esogeni può essere usato per promuovere restrizione lineage esaminare neurali differenziazione delle cellule staminali. Multipotenti NSPCs o loro discendenti possono essere trapiantate in vari modelli animali per valutare riparazione rigenerativa.

Ratto adulto cellule del midollo spinale cresciute in coltura in sospensione in EFH medio formeranno piccoli neurosfere (colonie di cellule indifferenziate) entro 1 settimana di placcatura iniziale. In colture primarie, la maggior parte delle cellule placcato moriranno e le cellule staminali fattore-sensibile crescita proliferare e sono selezionati per nel mezzo EFH. In passaggio 3, ci saranno numerose neurospheres fluttuanti circa 100 micron di diametro (Figura 2A). Neurosfere sono rotonde e la fase-lu...

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Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

Isolamento di Neural cellule staminali / progenitrici dalla Regione periventricolare del ratto adulto e midollo spinale umano

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

isolation-neural-stemprogenitor-cells-from-periventricular-region

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.1K Views.  Toronto Western Research Institute and Krembil Neuroscience Center. The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors. 

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Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

Isolamento e l&#39;espansione delle staminali mesenchimali stromali derivate / cellule da placenta umana Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Isolation and Expansion of Adult Canine Hippocampal Neural Precursors

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural intermediacy between the rodent and human hippocampi, is therefore a valuable model in which to study adult neurogenesis. In vitro culture assays are an essential component of characterizing neurogenesis and adult neural precursor cells, allowing for precise control over the cellular environment. To date however, culture protocols for canine cells remain under-represented in the literature. Detailed here are systematic protocols for the isolation and culture of hippocampal neural precursor cells from the adult canine brain. We demonstrate the expansion of canine neural precursor cells as floating neurospheres and as an adherent monolayer culture, producing stable cell lines that are able to differentiation into mature neural cell types in vitro. Adult canine neural precursors are an underused resource that may provide a more faithful analogue for the study of human neural precursors and the cellular mechanisms of adult neurogenesis.

The canine brain is a valuable model in which to study adult neurogenesis. Presented here are protocols for isolating and expanding adult canine hippocampal neural precursor cells from primary brain tissue.

Isolamento ed espansione di Canine Adult Hippocampal neurali Precursori

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

Isolamento e caratterizzazione di cellule mesenchimali stromali dal Cordone ombelicale e placenta fetale

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. Currently, efforts are being made to regenerate damaged cartilage with ex vivo expanded chondrocytes or bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs). However, the restricted viability and instability of these cells limit their application in cartilage reconstruction. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have received scientific attention as a new alternative for regenerative applications. With unlimited self-renewal ability and multipotency, hiPSCs have been highlighted as a new replacement cell source for cartilage repair. However, obtaining a high quantity of high-quality chondrogenic pellets is a major challenge to their clinical application. In this study, we used embryoid body (EB)-derived outgrowth cells for chondrogenic differentiation. Successful chondrogenesis was confirmed by PCR and staining with alcian blue, toluidine blue, and antibodies against collagen types I and II (COL1A1 and COL2A1, respectively). We provide a detailed method for the differentiation of cord blood mononuclear cell-derived iPSCs (CBMC-hiPSCs) into chondrogenic pellets.

Here, we propose a protocol for chondrogenic differentiation from cord blood mononuclear cell-derived human induced pluripotent stem cells.

Formazione di pellet condensato da cellule staminali pluripotenti indotte dal sangue

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and colleagues1. Later, others documented the existence of similar types of EPCs originating from bone marrow2,3. More recently, Yoder and Ingram showed that EPCs derived from umbilical cord blood had a higher proliferative potential compared to ones isolated from adult peripheral blood4,5,6. Apart from being involved in postnatal vasculogenesis, EPCs have also shown promise as a cell source for creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs7,8. Various isolation protocols exist, some of which involve the cell sorting of mononuclear cells (MNCs) derived from the sources mentioned earlier with the help of endothelial and hematopoietic markers, or culturing these MNCs with specialized endothelial growth medium, or a combination of these techniques9. Here, we present a protocol for the isolation and culture of EPCs using specialized endothelial medium supplemented with growth factors, without the use of immunosorting, followed by the characterization of the isolated cells using Western blotting and immunostaining.

The goal of this protocol is to isolate endothelial progenitor cells from umbilical cord blood. Some of the applications include using these cells as a biomarker for identifying patients with cardiovascular risk, treating ischemic diseases, and creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs.

Isolamento di cellule endoteliali progenitrici dal sangue del cordone ombelicale umano

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and neurite outgrowth; and later stages characterized by axon/dendrite outgrowth and synapse formation. In neurodevelopmental disorders, often one or more of these processes are disrupted, leading to abnormalities in brain formation and function. With the advent of human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology, researchers now have an abundant supply of human cells that can be differentiated into virtually any cell type, including neurons. These cells can be used to study both normal brain development and disease pathogenesis. A number of protocols using hiPSCs to model neuropsychiatric disease use terminally differentiated neurons or use 3D culture systems termed organoids. While these methods have proven invaluable in studying human disease pathogenesis, there are some drawbacks. Differentiation of hiPSCs into neurons and generation of organoids are lengthy and costly processes that can impact the number of experiments and variables that can be assessed. In addition, while post-mitotic neurons and organoids allow the study of disease-related processes, including dendrite outgrowth and synaptogenesis, they preclude the study of earlier processes like proliferation and migration. In neurodevelopmental disorders, such as autism, abundant genetic and post-mortem evidence indicates defects in early developmental processes. Neural precursor cells (NPCs), a highly proliferative cell population, may be a suitable model in which to ask questions about ontogenetic processes and disease initiation. We now extend methodologies learned from studying development in mouse and rat cortical cultures to human NPCs. The use of NPCs allows us to investigate disease-related phenotypes and define how different variables (e.g., growth factors, drugs) impact developmental processes including proliferation, migration, and differentiation in only a few days. Ultimately, this toolset can be used in a reproducible and high-throughput manner to identify disease-specific mechanisms and phenotypes in neurodevelopmental disorders.

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs

Neurodevelopmental processes such as proliferation, migration, and neurite outgrowth are often perturbed in neuropsychiatric diseases. Thus, we present protocols to rapidly and reproducibly assess these neurodevelopmental processes in human iPSC-derived NPCs. These protocols also allow the assessment of the effects of relevant growth factors and therapeutics on NPC development.

Rilevamento rapido dei fenotipi di Neurodevelopmental in cellule precursori neurali umane (NPC)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

L'isolamento e coltura di cellule primarie dell'epicardio ricavate da campioni di cuore umano adulto e fetale

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally isolated and characterized from bone marrow (BM), then acquired from tissues including adipose tissue, synovium, skin, dental pulp, and fetal appendages such as placenta, umbilical cord blood (UCB), and umbilical cord (UC). MSCs are a heterogeneous cell population with the capacity for (1) adherence to plastic in standard culture conditions, (2) surface marker expression of CD73+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-/CD14-/CD19-/HLA-DR- phenotypes, and (3) trilineage differentiation into adipocytes, osteocytes, and chondrocytes, as currently defined by the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Although BM is the most widely used source of MSCs, the invasive nature of BM aspiration ethically limits its accessibility. Proliferation and differentiation capacity of MSCs obtained from BM generally decline with the age of the donor. In contrast, fetal MSCs obtained from UC have advantages such as vigorous proliferation and differentiation capacity. There is no ethical concern for UC sampling, as it is typically regarded as medical waste. Human UC starts to develop with continuing growth of the amniotic cavity at 4-8 weeks of gestation and keeps growing until reaching 50-60 cm in length, and it can be isolated during the whole newborn delivery period. To gain insight into the pathophysiology of intractable diseases, we have used UC-derived MSCs (UC-MSCs) from infants delivered at various gestational ages. In this protocol, we describe the isolation and characterization of UC-MSCs from fetuses/infants at 19-40 weeks of gestation.

Human umbilical cord (UC) can be obtained during the perinatal period as a result of preterm, term, and postterm delivery. In this protocol, we describe the isolation and characterization of UC-derived mesenchymal stem cells (UC-MSCs) from fetuses/infants at 19-40 weeks of gestation.

Isolamento e caratterizzazione di umani cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale-derivato da prematuri e neonati a termine

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

Generazione di pelle 3D Organoid dal cordone emoderivati indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a differentiation state to sustain demands of the blood formation. However, it has been difficult to analyze the metabolic status (mitochondrial respiration and glycolysis) of HSPCs due to their limited numbers and lack of optimized protocols for non-adherent, fragile HSPCs. Here, we provide a set of clear, step-by-step instructions to measure metabolic respiration (oxygen consumption rate; OCR) and glycolysis (extracellular acidification rate; ECAR) of murine bone marrow-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs. This protocol provides a higher amount of LSK HSPCs from murine bone marrow, improves the viability of HSPCs during incubation, facilitates extracellular flux analyses of non-adherent HSPCs, and provides optimized injection protocols (concentration and time) for drugs targeting oxidative phosphorylation and glycolytic pathways. This method enables the prediction of the metabolic status and the health of HSPCs during blood development and diseases.

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) transition from a quiescent state to a differentiation state due to their metabolic plasticity during blood formation. Here, we present an optimized method for measuring mitochondrial respiration and glycolysis of HSPCs.