The authors would like to acknowledge support from Spinal Cord Injury Ontario, the Ontario-China Research and Innovation Fund, the Toronto General and Western Hospital Foundation, and Physicians&#8217; Services Incorporated Foundation. The authors thank Dr. Tasneem Zahir for expert advice in human spinal cord NSPC culture, and Drs. Cindi Morshead and Iris Kulbatski for their expert advice in rat spinal cord NSPC isolation.

모든 동물의 절차는 동물 관리에 캐나다위원회에 의해 제조 된 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 설립 정책에 따라, 캐나다 동물 관리 대학 건강 네트워크의위원회, 토론토에 의해 승인됩니다. 인간의 척수 조직의 수확 용, 승인 대학 건강 네트워크 연구 윤리위원회에서 온타리오, 캐나다에 장기 기증을 감독 생활 재단의 트릴 - 선물로부터 얻은 것입니다. 해부 버퍼 문화 미디어 1. 준비 <ol><li> 쥐 척수의 분리를 들어, 100 ㎖ 해부 버퍼 (1X PBS + 0.6 % 포도당 + 2 % 페니실린 - 스트렙토 마이신) 냉장을 준비합니다. 인간의 척수를 들어 100 ㎖ 해부 버퍼 (1X HBSS + 0.6 % 포도당 + 2 % 페니실린 - 스트렙토 마이신) 냉장을 준비합니다. </li><li> 37 ° C에서 100 ml의 무 혈청 배지 (SFM)과 따뜻한을 준비합니다. SFM을 준비하기 위해, 2 mM L- 글루타민을 추가, 100 μg의 / m-A로 Neurobasal 배지에 L 페니실린 - 스트렙토 마이신, 2 % B27, 및 10 % 호르몬 믹스. 호르몬 믹스를 준비하려면,은 1 : 0.6 %의 포도당을 함유 한 DMEM / F12 배지를, 3 mM의 NaHCO3를, 5 mM의 HEPES, 25 μg의 / ㎖ 인슐린, 100 μg의 / ㎖ 아포 트랜스페린, 10 μm의 퓨 트레 신 (putrescine), 30 나노 셀레늄, 20 나노 프로게스테론. </li><li> EFH 성장 인자가 풍부한 도금 미디어를 준비 37 ° C에서 따뜻한 SFM (20 NG / ㎖ EGF, 20 NG / ㎖의 bFGF, 2 μg의 / ㎖ 헤파린을 추가 할 수 있습니다). 인간의 EFH 인간 재조합 성장 인자 (재료의 표 참조)이 포함되어 있는지 확인합니다. </li></ol> 2. 수확 및 성인 쥐 뇌실 주위 척수 조직의 해부 <ol><li> 에탄올 해부기구를 소독하고 사전에 멸균 생리 식염수, 또는 오토 클레이브 장비에 헹군다. 쥐 제공 - 하나의 기관에 따라 (6 ~ 8 주 이전) 나트륨 펜 토바 비탈 (65 ㎎ / ㎖에서 1 CC) 또는 마취 (즉, 4 % 이소 플루오 란)의 과다 복용의 독극물 주사는 동물 프로토콜을 승인했다. 디70 % 에탄올로 쥐의 뒷면을 여러개 대형 해부 가위 등의 표면에 피부를 제거합니다. </li><li> 등의 표면에 수직 가위를 잡고 가로 뒷다리 위의 척추를 잘라. 길이 방향으로 가시 돌기를 노출 주동이의 방향으로 척추를 덮는 등의 근육을 잘라 작은 가위를 사용합니다. </li><li> 노출 된 꼬리 끝에서 시작, 척수와 척추 사이의 공간에서 척추관의 측면 측면에 extradurally rongeurs 또는 작은 무딘 뼈 절단 공구를 삽입합니다. 얇은 판에 작은 상처 (왼쪽 뼈 아치와 척추의 양쪽에 가시 돌기의 권리를) 확인하고 조심스럽게 척수 (그림 1A-D)를 노출하는 얇은 판을 벗겨. 블레이드의 각도가 얕은 확인하고 기본 척수가 손상되지 않도록 코드 평행. </li><li> 박람회에 주동이의 방향으로 추궁 절제술 계속흉부와 경부 척수를 전자. </li><li> 조심스럽게 조심스럽게 코드를 해제 뿌리를 절단하는 무딘 조직 집게 및 사용 microscissors와 척추에서 척수를 절제. (1.1 전술) 4 ℃ 무균 쥐 해부 버퍼를 포함하는 페트리 접시에 절제 척수를 놓습니다. 갓 준비 4 ° C의 해부 버퍼에 조직을 씻어 사용하는 가위는 1cm 세그먼트 (그림 1E)에 횡 방향으로 척수를 잘라. </li><li> 조직의 각 세그먼트를 들어, 미세 집게로 조직을 잡고 한 손을 사용합니다. 다른 손으로 조심스럽게 해부 범위의 도움으로 덮는 수막, 백질과 회백질의 대부분을 제거 할 수 microscissors를 사용합니다. 대안 적으로, ependyma과 회백질 (도 1F-H)를 둘러싸는 소량 포함 척수의 뇌실 주위 영역을 남기고 회색 및 백색 물질의 대부분을 벗겨 미세 겸자 (4 듀 #)를 사용한다.</li><li> 차가운 쥐 해부 버퍼를 포함하는 10cm 멸균 페트리 접시에 해부 뇌실 주위 조직을 풀. </li></ol> 3. 수확 및 성인의 뇌실 주위 척수 조직의 해부 참고 : 다른 장기는 장기 이식을 위해 제거 된 후 인간의 척수 조직이 성인 장기 이식 기증자에서 수확 (기증자 나이의 2~60년 시대​​였다). 생활 프로그램의 연령초-선물은 환자의 가족에서 연구 목적으로 조직의 제거를위한 동의를 얻고 우리가 대동맥 크로스 클램핑의 2 시간 이내에 코드를 수확 할 수 있었다 있도록 적시에 우리의 수확 팀을 알립니다. 남성과 여성의 성인 부정적인 혈청과 공여자없이 감염이 허용됩니다. <ol><li> 같은 전방 노출을 사용하여 전방 접근법을 통해 수술실에서 멸균 방식으로 수확 조직은 이미 장기 TRANSP에 의한 장기 제거 해부LANT 수확 팀. </li><li> 큰 리브 살포기와 큰 혈관을 포함한 나머지 조직과 장기의 큰 패들 견인기와 후퇴를 통해 전방 척추를 노출. </li><li> 절제 할 수있는 척추의 원하는 길이의 주동이와 꼬리 끝의 추간판 통해 잘라 긴 칼날이 장착 된 흉골 톱을 사용합니다. 각도 톱은 약 45 ° 내측 척추관 단지 짧은 정지 추체의 측면 부분에서 삼각 골을 잘라. </li><li> 일괄 경질을 통해 절단되지 않도록주의하면서 곡선 osteotomes와 망치의 도움으로 원하는 부분의 추체의 중간 부분을 제거합니다. 부드럽게 톱니 집게로 경질 덮여 척수를 들어 올려 급격히 코드의 주동이와 꼬리 끝을 절개. 좌우 각각의 뿌리를 가로로 쪼개다 긴 가위와 집게를 사용합니다. </li><li> 4 °에서 척수의 절제 세그먼트를 배치; C 살균 버퍼 (1X HBSS + 0.6 % 포도당 + 2 % 페니실린 - 스트렙토 마이신) 조직 배양 방에 수송을위한 대형 시험관에서. </li> <li> 참고 : 일반적으로 3 - 상부 흉추에서 척수의 6 CM 구간 및 / 또는 중간에 낮은 흉부 수준은 가능한 한 빨리 순환의 중단 후 멸균 조건에서 수술실에서 제거하고 차가운 멸균 버퍼에 배치됩니다 . 순환의 중단 및 척수의 제거 사이에 경과 된 시간은 기부 표적 장기를 수확하는 데 필요한 시간에 따라 변화하고 45 분에서 2 시간 범위였다있다. 심장 및 폐도 제거 된 경우, 절개도 하부 경추 코드의 일부분을 수확하기까지 rostrally 취할 수있다. </li><li> 3 시간 이내에 일반적으로, 수확 후 가능한 한 빨리 인간의 척수 조직을 해부하다. 집게로 경질 및 기타 수막을 제거합니다. 갓 만든 4 ° C의 해부 버퍼의 척수 조직을 씻어1cm 세그먼트에 횡 방향으로 절단. </li><li> 해부 범위의 도움으로, 각 조직 세그먼트에 대한 조직 포셉, 미세 집게와 microscissors를 사용하여 회색 물질의 대부분을 덮는 수막, 백질을 절제합니다. 차가운 인간 해부 버퍼를 포함 10cm 무균 페트리 접시에 ependyma 주변 회백질 소량 포함 해부 뇌실 조직을 풀. </li></ol> 4. 분리 및 배양 성인 쥐와 인간의 척수 NSPCs의 <ol><li> 층류 후드에서 무균 적으로 다음 단계를 수행한다. <ol><li> microscissors와 1mm 3 조각으로 해부 쥐 또는 인간의 뇌실 주위 조직을 말하다. </li><li> 효소 물질 / 시약의 표에 나타낸 바와 같이 파파인 해리 키트를 사용하여 단백질 분해 효소 다진 조직을 해리. 참고 : 시약 구성 요소 4 튜브를 포함한다; 유리 병 1 : 얼의 균형 소금 솔루션 (EBSS), 유리 병 2 : 파파인 containing L의 시스테인 및 EDTA, 바이알 3 : 데 옥시 리보 뉴 클레아 제 I (DNase의), 비알 4 : 소 혈청 알부민 (BSA)과 Ovomucoid 프로테아제 억제제. 참고 : 참고 : 파파인은 단백질 기질에 대한 폭 넓은 특이성을 가지고 설 프히 드릴 프로테아제이다. 파파인은 여기 카 리카 파파야 공장에서 라텍스에서 파생 된 대부분의 단백질 기질 더욱 광범위보다 췌장 단백질 분해 효소를 저하된다. 해리 과정에서 점성을 증가시키고 피펫 어려운 것 해리 배지로 방출 될 일부 세포 손상 유발 DNA가있다. 따라서, 그대로는 DNase의 세포에 손상을주지 않고 DNA를 소화하는 세포 분리 방법에 포함된다. Ovomucoids는 분리 단계 이후 파파인 활성을 억제하는 데 사용되는 프로테아제 억제제 당단백된다. </li></ol></li><li> 처음 사용시, EBSS (유리 병 1) 32 mL로 알부민 ovomucoid 억제제 혼합물 (유리 병 4)를 재구성 한 후 4 ℃에서 저장하고 이후의 절연 부에 사용.참고 :이 ovomucoid 억제제의 10 mg을하고 mL의 알부민 10 ㎎의 유효 농도에서 솔루션을 얻을 수 있습니다. </li><li> 0.5 mM의 EDTA 1 MM의 L 시스테인에서 파파인 / ㎖의 20 대에서 해결책을 산출, 파파인 유리 병 (유리 병 2)에 EBSS (유리 병 1) 5 mL를 추가합니다. 파파인이 완전히 효소의 전체 활동을 보장하기 위해 용해 될 때까지 다른 십분의 37 ° C의 물을 욕조에 병을 배치, 완전히 용해 할 때 파파인 솔루션은 분명 나타나는지 확인합니다. </li><li> (3 병) DNase의 약병에 EBSS (유리 병 1)의 500 μl를 추가하고 DNase의가 변성 전단에 민감한으로 가볍게 섞는다. 약 20 단위 / ml의 파파인 및 0.005 %의 DNase의 최종 농도 결과, 파파인 함유 바이알 DNase의 용액 250 μL를 추가한다. 나중에 사용하기 위해 DNase의 유리 병의 균형을 저장합니다. </li><li> 위의 단계 4.4에서 제조 된 파파인 솔루션에 다진 쥐 또는 인간의 조직을 놓습니다. 인간의 조직 분리를 들어, 둘 사이에 동등하게 다진 조직을 분할파파인 바이알 (약 0.2 g / 병). </li><li> 파파인 활성화 용액 중에 조직을 해리 로커 플랫폼에서 일정한 교반하에 37 ℃에서 인큐베이션. 각각 0.4 g - 약 0.2 다진 조직의 크기에 따라 1 내지 2 시간 동안 45 분에 1 시간, 및 인체 조직에 대한 쥐 조직을 인큐베이션. </li><li> 흐린 세포 현탁액을 수득 나머지 조직편을 해리 10 ㎖ 피펫 혼합물 씹다. 실온에서 5 분 동안 300 XG에 멸균 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 세포 현탁액을 (해리되지 않은 조직의 조각을 포함하지 않는다) 전송합니다. </li><li> 매체에 함유 ovomucoid 파파인​​ 억제제 펠렛 세포를 재현 탁. <ol><li> 15 ML 원뿔 튜브에 재구성 알부민 ovomucoid 방지 액 (유리 병 4) 300 μL와 2.7 ml의 EBSS (유리 병 1)을 혼합하여 ovomucoid 솔루션을 준비합니다. 위의 단계 4.4에서 저장 (3 병)의 DNase 솔루션 150 μl를 추가합니다. </li><li> 에서 상층 액을 버린다세포 펠렛은 즉시 희석 DNase의 알부민 억제제 혼합물에서 세포 펠렛을 재현 탁. </li></ol></li><li> 단일 단계 불연속 밀도 기울기를 통해 원심 분리하여 세포 점막에서 별도의 손상 세포. <ol><li> 위에 부드럽게 15ml의 튜브 (4 바이​​알) 알부민 억제제 용액 5 mL를 첨가하고, 5 ㎖ 피펫을 사용하여 불연속 밀도 구배를 준비 서서히 세포 현탁액 레이어 (단계 4.8에서 상술 한 바와 같이 제조) 알부민 억제제 솔루션입니다. </li><li> 실온에서 6 분 70 XG에 원심 분리기. </li><li> 주 :이 경계에서 최소의 혼합이 결과에 영향을주지 않지만 구배의 두 층 사이의 인터페이스는, 명확하게 볼 수 있어야한다. 멤브레인 단편 계면에 남아 해리 세포 튜브의 하단에 펠렛. </li></ol></li><li> 쥐 세포의 경우, 상층 액을 제거하고 래트 EFH 배지 1 ㎖에서 세포 펠렛을 재현 탁 (37 ° C에서 미리는 예열).혈구와 라이브 세포 밀도를 계산하고 EFH에 / μL (10) 세포의 밀도로 T25 문화 플라스크에 넣고 세포를 접시. 랫트 조직에서 세포의 전형적인 수율은 / μL 미만 10 세포의 밀도로 요구되는 약 80 % viability.If 클론 배양 종자 세포는 약 2 × 106 세포이다. 5 % CO 2, 37 ℃에서 플라스크를 품어 1 주 분야의 응집을 방지하는 문화가 방해받지 않고 성장할 수 있습니다. </li><li> 인체 세포의 경우, 상층 액을 제거하고, 인간 EFH 배지 10ml에 세포 펠렛을 재현 탁 (37 ° C에서 미리는 예열). 도 40㎛ 나일론 세포 여과기를 통하여 세포 현탁액을 필터 미엘린 및 세포막 파편을 제거하기 위해 EFH 30 ㎖로 하였다. 5 분 동안 300 XG 원심 분리기 및 EFH 배지 1 ㎖로 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 혈구와 살아있는 세포 밀도를 계산하고 총 부피 / 웰 105 세포의 밀도로 6 웰 배양 플레이트에 인간 세포 판형5 ㎖의 EFH / 웰. 인체 조직에서 세포의 전형적인 수율은 약 70 %의 생존과 약 1 × 10 6 세포입니다. 같은 마트 리겔로 부착 기판과 사전 코트 우물 (아래 참고 참조). 1 ml의 SFM : 40 μL 마트 리겔의 비율로 희석. </li><li> 주 : 대안 적으로, 폴리 D 라이신 / 라미닌, 피브로넥틴, 콜라겐과 같은 다른 부착 기질을 사용할 수있다. </li><li> 5 % CO 2에서 37 ° C에서 접시를 품어과 문화 1 주일 동안 방해받지 않고 성장할 수 있습니다. </li></ol> 성인 쥐와 인간의 척수 NSPCs 5.과 Passaging <ol><li> 쥐 NSPCs 작은 neurosphere를 초기 파종 1 주일 이내에 직경 약 70 μm의를 형성 할 것이다; 상기 세포 현탁액을 수집하고 5 분 동안 300 XG에서 원심 분리하고, 기계적으로 해리를 neurosphere를 세포 펠렛을 분쇄하여 주간에 의해 통로 쥐 NSPCs. </li><li> 신선한 쥐 EFH 매체를 함유하는 T25 플라스크에 세포를 해리 시드. 또한,계대 50 % 조건 쥐 매체를 사용합니다. 계대에서 쥐 NSPCs의 전형적인 수율은 통로 수를 기하 급수적으로 증가 약 5 × 10 6 세포입니다. </li><li> 인간의 문화를 들어 일주일 초기 도금 후, 세포를 기판에 부착 할 수 있도록 회 매주 신선한 EFH와 배양액의 절반을 교체한다. 일반적 1~2주 이상 세포가 기판에 부착되면 신선한 EFH로 일주일에 두 번 배양액의 전체 부피를 대체. </li><li> 4-8주 사이의 합류에 도달하기 전에 배양 세포. <ol><li> 또한 37 ° C에서 약 10 분간 인큐베이션 당 효소 기질로부터 세포를 분리하여 배양 세포를 효소의 2 ㎖로 (자재 표 참조). 5 분 동안 300 XG에 세포 현탁액을 원심 분리 수집하고 부드럽게 갓 EFH 배지 1 ㎖로 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 혈구와 살아있는 세포를 계산하고 6 웰 배양 접시에 세포를 플레이트 (사전 공동위와 같은 단계 4.12)에서 105 세포의 밀도 / 웰 / 웰 EFH 5 ㎖의 전체 부피에 ated. 계대에서 인간 NSPCs의 전형적인 수율은 약 2 × 10 6 세포이며, 일반적으로는 통로에 두 배로. 계대 사이에 주 3 회 - 일반적으로 50 % 조건 EFH 매체 (2) 문화를 유지한다. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+neural+stem+cells.">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287, 1433-1438 (2000).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Gritti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotential+stem+cells+from+the+adult+mouse+brain+proliferate+and+self-renew+in+response+to+basic+fibroblast+growth+factor.">Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor.</a> J Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).</li><li>Morshead, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+in+the+adult+mammalian+forebrain:+a+relatively+quiescent+subpopulation+of+subependymal+cells.">Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells.</a> Neuron. 13, 1071-1082 (1994).</li><li>Weiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+CNS+stem+cells+are+present+in+the+adult+mammalian+spinal+cord+and+ventricular+neuroaxis.">Multipotent CNS stem cells are present in the adult mammalian spinal cord and ventricular neuroaxis.</a> J Neurosci. 16, 7599-7609 (1996).</li><li>Martens, D. J., Seaberg, R. M., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+infusions+of+exogenous+growth+factors+into+the+fourth+ventricle+of+the+adult+mouse+brain+increase+the+proliferation+of+neural+progenitors+around+the+fourth+ventricle+and+the+central+canal+of+the+spinal+cord.">In vivo infusions of exogenous growth factors into the fourth ventricle of the adult mouse brain increase the proliferation of neural progenitors around the fourth ventricle and the central canal of the spinal cord.</a> Eur J Neurosci. 16, 1045-1057 (2002).</li><li>Kulbatski, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocytes+and+radial+glia+derived+from+adult+rat+spinal+cord+progenitors:+morphological+and+immunocytochemical+characterization.">Oligodendrocytes and radial glia derived from adult rat spinal cord progenitors: morphological and immunocytochemical characterization.</a> J Histochem Cytochem. 55, 209-222 (2007).</li><li>Akesson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+and+neuronal+survival+after+intraspinal+transplantation+of+human+spinal+cord-derived+neurospheres.">Long-term culture and neuronal survival after intraspinal transplantation of human spinal cord-derived neurospheres.</a> Physiol Behav. 92, 60-66 (2007).</li><li>Dromard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+human+spinal+cord+harbors+neural+precursor+cells+that+generate+neurons+and+glial+cells+in+vitro.">Adult human spinal cord harbors neural precursor cells that generate neurons and glial cells in vitro.</a> J Neurosci Res. 86, 1916-1926 (2008).</li><li>Mothe, A. J., Zahir, T., Santaguida, C., Cook, D., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem/progenitor+cells+from+the+adult+human+spinal+cord+are+multipotent+and+self-renewing+and+differentiate+after+transplantation.">Neural stem/progenitor cells from the adult human spinal cord are multipotent and self-renewing and differentiate after transplantation.</a> PLoS One. 6, e27079 (2011).</li><li>Huettner, J. E., Baughman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+identified+neurons+from+the+visual+cortex+of+postnatal+rats.">Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats.</a> J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).</li><li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+the+adult+mouse+neural+stem+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat Methods. 2, 333-336 (2005).</li><li>Singec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+actual+sensitivity+and+specificity+of+the+neurosphere+assay+in+stem+cell+biology.">Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology.</a> Nat Methods. 3, 801-806 (2006).</li><li>Louis, S. A., Azari, H., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural-colony+forming+cell+assay:+an+assay+to+discriminate+bona+fide+neural+stem+cells+from+neural+progenitor+cells.">Neural-colony forming cell assay: an assay to discriminate bona fide neural stem cells from neural progenitor cells.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Louis, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+neural+stem+and+progenitor+cells+in+the+neural+colony-forming+cell+assay.">Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay.</a> Stem Cells. 26, 988-996 (2008).</li><li>Conti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-independent+symmetrical+self-renewal+of+a+mammalian+tissue+stem+cell.">Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell.</a> PLoS Biol. 3, e10 (2005).</li><li>Pollard, S. M., Conti, L., Sun, Y., Goffredo, D., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adherent+neural+stem+(NS)+cells+from+fetal+and+adult+forebrain.">Adherent neural stem (NS) cells from fetal and adult forebrain.</a> Cereb Cortex. 16, i112-i120 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

쥐의 척수 조직 관리의 해부 동안 추궁 절제술을 수행하는 동안 척수 손상되지 않도록주의해야한다. 이것은 척수 세그먼트 그대로 때 뇌실 조직을 분리하기 쉽다. 조직 세그먼트 완전히 해부 완충액에 침지되어야하고 덮는 수막과 백질은 microscissors와 스트립 길이로 절단 할 수있다. 또한, 미세 조직 집게 멀리 백질을 벗겨하는 데 사용할 수 있습니다. NSPCs위한 분리 과정을 ?...

NSPCs 자기 갱신과 쉽게 체외에서 확장 할 수 있습니다 신경 혈통하기 위해 최선을 다하고 다 능성 세포이다. 그들은 자기 갱신 다 능성 줄기 세포보다 제한 조상의 속성을 표시하기 때문에 우리는 신경 줄기 / 전구 세포의 혼합 인구로이 세포를 참조하십시오. NSPCs은 태아와 성인 뇌와 척수 1, 2 모두에서 발견된다. 성인에서, NSPCs는 일반적으로 대기하고 측면 심실 2-4 안감 뇌실 영역 및 척수 5,6의 중심 운하를 둘러싼 뇌실 주위 백질 영역을 포함하는 특정 틈새 시장 내에 위치. 일반적으로, NSPCs는 EGF와 bFGF를 보충 무 혈청 배지에서 자유 부동 neurosphere를 또는 부착 단일 층, 줄기 / 전구 세포 집단에 대한 선택 분열 촉진으로 배양. 원래 레이놀즈와 바이스 (2)에 의해 개발 된 neurosphere 분석은 가장 일반적으로 문화에 사용되며,신경 줄기 세포를 확장합니다. 그들이 성장 인자 배지 포함 혈청에 도금 할 때 NSPCs는 신경 세포, 성상 세포 및 희소 돌기 아교 세포로 분화, 능성을 보여줍니다. 배양 된 조직이 중앙 운하 6,7의 영역을 포함하는 경우 다 능성, 자기 갱신 NSPCs은 성인 쥐에서 척수를 분리하고 배양 할 수있다. 다른 영역으로부터 세포를 생성 반대로 성인 척수에서 생성 NSPCs 사용에 잠재적 이점이 조직 - 특이 적 세포가 가장 근접 부상이나 질병 다음 분실되거나 손상된 척수 세포 유사 있다는 것이다. 이전의 연구는 인간 성인 척수로부터 유래 neurosphere를 장기 또는 세포를 전파 8,9 충분한 수를 생성하기 위해 계대 수 없다는 것을 보여 주었다. 그러나, 배양 조건의 수정을, 우리는 시연, 성인의 척수 유래 NSPCs의 확장과 이식을보고 그 자체 갱신및 다 능성 NSPCs는 장기 이식 공여자 (10)의 성인 인간 척수로부터 분리 될 수있다. 주로, 성장 인자가 풍부한 배지에서 부착 기판에 절개 및 이들 세포를 배양 중에 백질의 대부분의 제거는 인간 성인 척수 NSPCs 증식 선정. 이 프로토콜에서 우리는 성인 쥐에서 인간의 장기 이식 기증자, 뇌실 주위 조직의 절개 및 NSPCs의 분리, 배양 및 확장에서 척수의 수확에 대해 설명합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#10010023</td>
			<td>Dissection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#14175095</td>
			<td>Dissection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># G-6152</td>
			<td>Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#15140-148</td>
			<td>Dissection buffer and culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal-A&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#10888-022</td>
			<td>Culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine, 200mM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#25030-081</td>
			<td>Culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#12587010</td>
			<td>Culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#11885084</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#21700-075</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># S-5761</td>
			<td>Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#H9136</td>
			<td>Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#I-5500</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#T-2252</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># P7505</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selenium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#S-9133</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P-6149</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF, mouse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#E4127</td>
			<td>Prepare 100 &#956;g/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF, human recombinant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#E9644</td>
			<td>Prepare 100 &#956;g/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF, human recombinant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#F0291</td>
			<td>Prepare 100 &#956;g/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin, 10000U</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#H3149</td>
			<td>Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain dissociation kit</td>
			<td>Worthington Biochemicals</td>
			<td>#LK003150</td>
			<td>Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pentobarbital</td>
			<td>Bimeda &#8211; MTC Animal Health Inc</td>
			<td>DIN 00141704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps: Addisons</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#11006-12&#160;</td>
			<td>Serrated standard tip; micro-tip also available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps: Dumont #4</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#11241-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#15024-10</td>
			<td>Round-handled Vannas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeurs</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>N1430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mm Petri dishes&#160;</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Culture flasks</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA21008-949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>CA73520-906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, growth factor reduced (100X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 &#956;l Matrigel: 1 ml SFM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord

성인 쥐 및 성장 인자가 풍부한 배지에서 배양 인간 척수 신경 줄기 / 선조 세포 (NSPCs)는 자기 갱신, 및 확장 신경 줄기 세포의 분화능 증식을 허용한다. 혈청 조건에서 이러한 능성 NSPCs는 신경 세포, 성상 세포 및 희소 돌기 아교 세포를 생성, 차별화됩니다. 수확 된 조직의 bFGF (효소 파파인-EDTA 용액 중에서 해리 한 후 기계적으로 표피 성장 인자 (EGF)가 보충 된 배지로 Neurobasal 배지, 염기성 섬유 아세포 성장 인자에 도금 단일 세포 현탁액을 수득 해리 불연속 밀도 구배를 통해 분리되고 ) 및 헤파린. 성인 쥐 척수 NSPCs은 자기편 문화로 성장 자유 부동 neurosphere를 성인 인간의 척수 NSPCs으로 배양. 이러한 조건 하에서, 성인 척수 NSPCs은 전구 세포의 마커 익스프레스, 증식, 연속적 통로에 확장 될 수있다. 이러한 세포 수 bE는 다양한 자극에 반응하여 시험관 내에서 연구 및 외인성 인자는 신경 줄기 세포의 분화를 검사 혈통 제한을 촉진하기 위해 사용될 수있다. 능성 NSPCs 또는 그들의 자손 또한 회생 수리를 평가하기 위해 다양한 동물 모델에 이식 할 수있다.

EFH 매체에 현탁 배양에서 자란 성인 쥐 척수 세포는 초기 도금의 일주일 내 작은 neurosphere를 (미분화 세포의 콜로니)을 형성한다. 차 배양에서 도금 셀의 대부분은 죽게되고 성장 인자 응답 줄기 세포가 증식되고 EFH 매체에 대해 선택된다. 통로 (3)에 의해, 다수의 자유 부동 neurosphere를 약 100 μm의 직경 (그림 2A)에있을 것입니다. neurosphere를 라운드 및 위상 밝은이며, 고배율, 섬모 형상 m...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord at JoVE.com

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

뇌실 주위 백질 성인 쥐의 지역 및 인간의 척수에서 신경 줄기 / 전구 세포의 분리

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

isolation-neural-stemprogenitor-cells-from-periventricular-region

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.1K 조회수.  Toronto Western Research Institute and Krembil Neuroscience Center. The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors. 

비디오: Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

인간 태반 조직에서 추출 분리 및 중간 엽 줄기의 확장 / 기질 세포

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

연구

발생학

Isolation and Expansion of Adult Canine Hippocampal Neural Precursors

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural intermediacy between the rodent and human hippocampi, is therefore a valuable model in which to study adult neurogenesis. In vitro culture assays are an essential component of characterizing neurogenesis and adult neural precursor cells, allowing for precise control over the cellular environment. To date however, culture protocols for canine cells remain under-represented in the literature. Detailed here are systematic protocols for the isolation and culture of hippocampal neural precursor cells from the adult canine brain. We demonstrate the expansion of canine neural precursor cells as floating neurospheres and as an adherent monolayer culture, producing stable cell lines that are able to differentiation into mature neural cell types in vitro. Adult canine neural precursors are an underused resource that may provide a more faithful analogue for the study of human neural precursors and the cellular mechanisms of adult neurogenesis.

The canine brain is a valuable model in which to study adult neurogenesis. Presented here are protocols for isolating and expanding adult canine hippocampal neural precursor cells from primary brain tissue.

분리 및 성인 개 해마 신경 전구체의 확장

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

인간 제대혈 및 태아 태반에서 중간 엽 기질 세포의 분리 및 특성

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. Currently, efforts are being made to regenerate damaged cartilage with ex vivo expanded chondrocytes or bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs). However, the restricted viability and instability of these cells limit their application in cartilage reconstruction. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have received scientific attention as a new alternative for regenerative applications. With unlimited self-renewal ability and multipotency, hiPSCs have been highlighted as a new replacement cell source for cartilage repair. However, obtaining a high quantity of high-quality chondrogenic pellets is a major challenge to their clinical application. In this study, we used embryoid body (EB)-derived outgrowth cells for chondrogenic differentiation. Successful chondrogenesis was confirmed by PCR and staining with alcian blue, toluidine blue, and antibodies against collagen types I and II (COL1A1 and COL2A1, respectively). We provide a detailed method for the differentiation of cord blood mononuclear cell-derived iPSCs (CBMC-hiPSCs) into chondrogenic pellets.

Here, we propose a protocol for chondrogenic differentiation from cord blood mononuclear cell-derived human induced pluripotent stem cells.

제대혈 유래 다 능성 줄기 세포로부터 연골 형성 펠렛 형성

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and colleagues1. Later, others documented the existence of similar types of EPCs originating from bone marrow2,3. More recently, Yoder and Ingram showed that EPCs derived from umbilical cord blood had a higher proliferative potential compared to ones isolated from adult peripheral blood4,5,6. Apart from being involved in postnatal vasculogenesis, EPCs have also shown promise as a cell source for creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs7,8. Various isolation protocols exist, some of which involve the cell sorting of mononuclear cells (MNCs) derived from the sources mentioned earlier with the help of endothelial and hematopoietic markers, or culturing these MNCs with specialized endothelial growth medium, or a combination of these techniques9. Here, we present a protocol for the isolation and culture of EPCs using specialized endothelial medium supplemented with growth factors, without the use of immunosorting, followed by the characterization of the isolated cells using Western blotting and immunostaining.

The goal of this protocol is to isolate endothelial progenitor cells from umbilical cord blood. Some of the applications include using these cells as a biomarker for identifying patients with cardiovascular risk, treating ischemic diseases, and creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs.

인간 탯 줄 혈액에서 내 피 조상 세포의 고립

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and neurite outgrowth; and later stages characterized by axon/dendrite outgrowth and synapse formation. In neurodevelopmental disorders, often one or more of these processes are disrupted, leading to abnormalities in brain formation and function. With the advent of human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology, researchers now have an abundant supply of human cells that can be differentiated into virtually any cell type, including neurons. These cells can be used to study both normal brain development and disease pathogenesis. A number of protocols using hiPSCs to model neuropsychiatric disease use terminally differentiated neurons or use 3D culture systems termed organoids. While these methods have proven invaluable in studying human disease pathogenesis, there are some drawbacks. Differentiation of hiPSCs into neurons and generation of organoids are lengthy and costly processes that can impact the number of experiments and variables that can be assessed. In addition, while post-mitotic neurons and organoids allow the study of disease-related processes, including dendrite outgrowth and synaptogenesis, they preclude the study of earlier processes like proliferation and migration. In neurodevelopmental disorders, such as autism, abundant genetic and post-mortem evidence indicates defects in early developmental processes. Neural precursor cells (NPCs), a highly proliferative cell population, may be a suitable model in which to ask questions about ontogenetic processes and disease initiation. We now extend methodologies learned from studying development in mouse and rat cortical cultures to human NPCs. The use of NPCs allows us to investigate disease-related phenotypes and define how different variables (e.g., growth factors, drugs) impact developmental processes including proliferation, migration, and differentiation in only a few days. Ultimately, this toolset can be used in a reproducible and high-throughput manner to identify disease-specific mechanisms and phenotypes in neurodevelopmental disorders.

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs

Neurodevelopmental processes such as proliferation, migration, and neurite outgrowth are often perturbed in neuropsychiatric diseases. Thus, we present protocols to rapidly and reproducibly assess these neurodevelopmental processes in human iPSC-derived NPCs. These protocols also allow the assessment of the effects of relevant growth factors and therapeutics on NPC development.

인간의 신경 선구자 세포 (Npc)에서 Neurodevelopmental 고기의 신속한 감지

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

분리와 인간 성인 그리고 태아 심장 표본에서 파생 하는 기본 Epicardial 세포의 문화

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally isolated and characterized from bone marrow (BM), then acquired from tissues including adipose tissue, synovium, skin, dental pulp, and fetal appendages such as placenta, umbilical cord blood (UCB), and umbilical cord (UC). MSCs are a heterogeneous cell population with the capacity for (1) adherence to plastic in standard culture conditions, (2) surface marker expression of CD73+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-/CD14-/CD19-/HLA-DR- phenotypes, and (3) trilineage differentiation into adipocytes, osteocytes, and chondrocytes, as currently defined by the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Although BM is the most widely used source of MSCs, the invasive nature of BM aspiration ethically limits its accessibility. Proliferation and differentiation capacity of MSCs obtained from BM generally decline with the age of the donor. In contrast, fetal MSCs obtained from UC have advantages such as vigorous proliferation and differentiation capacity. There is no ethical concern for UC sampling, as it is typically regarded as medical waste. Human UC starts to develop with continuing growth of the amniotic cavity at 4-8 weeks of gestation and keeps growing until reaching 50-60 cm in length, and it can be isolated during the whole newborn delivery period. To gain insight into the pathophysiology of intractable diseases, we have used UC-derived MSCs (UC-MSCs) from infants delivered at various gestational ages. In this protocol, we describe the isolation and characterization of UC-MSCs from fetuses/infants at 19-40 weeks of gestation.

Human umbilical cord (UC) can be obtained during the perinatal period as a result of preterm, term, and postterm delivery. In this protocol, we describe the isolation and characterization of UC-derived mesenchymal stem cells (UC-MSCs) from fetuses/infants at 19-40 weeks of gestation.

절연 및 인간의 탯 유래 중간 엽 줄기 세포 Preterm와 기간 유아에서의 특성화

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

코드 혈액 파생에서 3D 피부 Organoid의 생성 유도 만능 줄기 세포

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a differentiation state to sustain demands of the blood formation. However, it has been difficult to analyze the metabolic status (mitochondrial respiration and glycolysis) of HSPCs due to their limited numbers and lack of optimized protocols for non-adherent, fragile HSPCs. Here, we provide a set of clear, step-by-step instructions to measure metabolic respiration (oxygen consumption rate; OCR) and glycolysis (extracellular acidification rate; ECAR) of murine bone marrow-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs. This protocol provides a higher amount of LSK HSPCs from murine bone marrow, improves the viability of HSPCs during incubation, facilitates extracellular flux analyses of non-adherent HSPCs, and provides optimized injection protocols (concentration and time) for drugs targeting oxidative phosphorylation and glycolytic pathways. This method enables the prediction of the metabolic status and the health of HSPCs during blood development and diseases.

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) transition from a quiescent state to a differentiation state due to their metabolic plasticity during blood formation. Here, we present an optimized method for measuring mitochondrial respiration and glycolysis of HSPCs.