The authors would like to acknowledge support from Spinal Cord Injury Ontario, the Ontario-China Research and Innovation Fund, the Toronto General and Western Hospital Foundation, and Physicians&#8217; Services Incorporated Foundation. The authors thank Dr. Tasneem Zahir for expert advice in human spinal cord NSPC culture, and Drs. Cindi Morshead and Iris Kulbatski for their expert advice in rat spinal cord NSPC isolation.

Todos los animales procedimientos son aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Health Network, Toronto ON Canadá, de acuerdo con las políticas establecidas en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales Experimentales preparados por el Consejo Canadiense de los Animales. Para la recolección de tejido de la médula espinal humana, la aprobación se obtuvo de la Junta Ética de la Investigación Red de Salud de la Universidad y de la Trillium-regalo de la Fundación Vida, que supervisa la donación de órganos en Ontario, Canadá. 1. Preparación de Disección Los tampones y medios de cultivo <ol><li> Para el aislamiento de médula espinal de ratas, preparar 100 ml de tampón de disección (1x PBS + 0,6% de glucosa + 2% de penicilina-estreptomicina) y refrigerar. Para la médula espinal humana preparar 100 ml de tampón de disección (1x HBSS + 0,6% de glucosa + 2% de penicilina-estreptomicina) y refrigerar. </li><li> Preparar medio 100 ml sin suero (SFM) y caliente a 37 ° C. Para preparar el MFS, agregue 2 mM L-glutamina, 100 g / ml de penicilina-estreptomicina, 2% B27, y 10% de la mezcla hormona para Neurobasal-A medio. Para preparar la mezcla de hormonas, hacer una 1: media / F12 1 DMEM que contenía 0,6% de glucosa, 3 mM NaHCO 3, 5 mM HEPES, 25 mg / ml de insulina, 100 g / ml apo-transferrina, 10 mM de putrescina, 30 nM selenio, y 20 nM de progesterona. </li><li> Preparar el factor enriquecido medios chapado crecimiento EFH (a SFM añadir 20 ng / ml de EGF, 20 ng / ml de bFGF, y 2 mg / ml de heparina) y caliente a 37 ° C. Asegúrese de que EFH humana contiene factores de crecimiento recombinantes humanos (véase la Tabla de Materiales). </li></ol> 2. Recolección y Disección de adulto Rata periventricular Tejido de la médula espinal <ol><li> Esterilizar los instrumentos de disección en etanol y enjuague con solución salina estéril, o instrumentos de autoclave con antelación. Dar de rata (6 - 8 semanas de edad) una inyección letal de pentobarbital de sodio (1 cc a 65 mg / ml) o sobredosis de anestésico (es decir, 4% isofluorano) según una de institución aprobó el protocolo animal. Douse la parte trasera de la rata con 70% de etanol y quitar la piel en la superficie dorsal con grandes tijeras de disección. </li><li> Sosteniendo las tijeras perpendiculares a la superficie dorsal, transversalmente cortar la columna vertebral por encima de las extremidades posteriores. Con unas tijeras pequeñas para cortar longitudinalmente el músculo dorsal que recubre la columna vertebral en una dirección rostral para exponer las apófisis espinosas. </li><li> Comenzando en el extremo caudal expuesta, inserte gubia o un instrumento pequeño hueso de corte romo extradurally en la cara lateral del canal espinal en el espacio entre la médula espinal y la columna vertebral. Hacer pequeños cortes en la lámina (arcos óseos izquierdo y derecho de las apófisis espinosas en cada lado de las vértebras) y cuidadosamente retire la lámina para exponer la médula espinal (Figura 1A-D). Asegúrese de que el ángulo de las palas es poco profunda y paralela a la cuerda de modo que la médula espinal subyacente no está dañado. </li><li> Continuar laminectomía en dirección rostral a expose la médula espinal torácica y cervical. </li><li> Escindir suavemente la espina dorsal de la columna vertebral con pinzas de tejido contundentes y uso microtijeras para cortar cuidadosamente las raíces para liberar el cable. Coloque la médula espinal extirpado en una placa de Petri que contiene 4 ° C tampón de disección estéril rata (descrito más arriba en 1.1). Enjuague el tejido en 4 ° C tampón de disección recién preparados y con unas tijeras cortar la médula espinal transversalmente en segmentos de 1 cm (Figura 1E). </li><li> Para cada segmento de tejido, utilice una mano para sujetar el tejido con unas pinzas finas. Con la otra mano, use microtijeras para eliminar cuidadosamente las meninges que recubren, la materia blanca, y la mayor parte de la materia gris, con la ayuda de un microscopio de disección. Alternativamente, utilizar unas pinzas finas (Dumont # 4) a despegarse la mayor parte de la materia gris y blanca, dejando sólo la región periventricular de la médula espinal que incluye el epéndimo y una pequeña cantidad de materia gris circundante (Figura 1F-H).</li><li> En común el tejido periventricular diseccionado en una placa de Petri de 10 cm estéril que contiene tampón de disección rata frío. </li></ol> 3. Recolección y Disección de adulto periventricular humano Tejido de la médula espinal Nota: el tejido de la médula espinal humana se cosecha de donantes de trasplante de órganos adultos (donantes con edades de 2 a 60 años de edad) después de que los otros órganos se han eliminado para el trasplante de órganos. El Trillium-Regalo del Programa Vida obtiene el consentimiento para la extracción de tejido con fines de investigación de la familia del paciente y notifica a nuestro equipo de recolección en el momento oportuno de tal manera que hemos sido capaces de cosechar las cuerdas dentro de 2 horas de pinzamiento aórtico. Se aceptan donantes adultos masculinos y femeninos con serología negativa y no hay infecciones. <ol><li> Tejido de cosecha de una manera estéril en el quirófano a través de un abordaje anterior usando la misma exposición anterior ya diseccionado para la extracción de órganos por el órgano Transpequipo de recolección lant. </li><li> Exponer la columna vertebral anterior a través de la retracción con grandes esparcidores de costillas y grandes retractores de pádel de los tejidos y órganos que quedan incluidos los grandes vasos sanguíneos. </li><li> Use una sierra esternal montado con una larga hoja para cortar a través de los discos intervertebrales en los extremos rostral y caudal de la longitud deseada de la columna vertebral a ser resecado. Ángulo de la sierra cerca de 45 ° en sentido medial para cortar un canal triangular de la parte lateral de los cuerpos vertebrales de detención justo en el canal espinal. </li><li> Eliminar en bloque los aspectos mediales de los cuerpos vertebrales de los segmentos deseados con la ayuda de osteotomos curvos y mazo teniendo cuidado de evitar el corte a través de la duramadre. A continuación, levante suavemente la dura cubierta de la médula espinal con pinzas dentadas y agudamente incidir los extremos rostral y caudal de la médula. Use las tijeras largas y fórceps para seccionar bilateralmente las raíces individuales. </li><li> Coloque el segmento escindido de la médula espinal en 4 °; C tampón estéril (1x HBSS + 0,6% de glucosa + 2% de penicilina-estreptomicina) en un tubo de ensayo grande para el transporte a la sala de cultivo de tejidos. </li> <li> Nota: Por lo general, un 3 - segmento de 6 cm de la médula espinal de la columna torácica superior y / o media-baja nivel torácico se retira de la sala de operaciones bajo condiciones estériles, tan pronto como sea posible después de la interrupción de la circulación y se colocaron en tampón estéril fría . El tiempo transcurrido entre el cese de la circulación y la eliminación de la médula espinal varía con el tiempo requerido para cosechar los órganos específicos para la donación y ha oscilado entre 45 min a 2 horas. Si también se han eliminado el corazón y los pulmones, la disección puede ser tomado lejos rostral para cosechar una porción de la médula cervical inferior, así. </li><li> Diseccionar el tejido de la médula espinal humana tan pronto como sea posible después de la cosecha, generalmente dentro de 3 hrs. Retire la duramadre y otros meninges con fórceps. Enjuague el tejido de la médula espinal en recién hecho 4 ° C y tampón de diseccióncortar transversalmente en segmentos de 1 cm. </li><li> Con la ayuda de un microscopio de disección, extirpar las meninges que recubren, la materia blanca, y la mayoría de la materia gris utilizando pinzas de tejido, unas pinzas finas y microtijeras para cada segmento de tejido. En común el tejido diseccionado periventricular, que incluye el epéndimo y una pequeña cantidad de materia gris circundante, en una placa de Petri de 10 cm estéril que contiene tampón de disección humana frío. </li></ol> 4. Aislamiento y cultivo de adulto Rata y NSPCs Médula Espinal Humanos <ol><li> Realice los siguientes pasos asépticamente en una campana de flujo laminar. <ol><li> Picar la rata disecada o tejido periventricular humano en 1 mm 3 piezas con micro tijeras. </li><li> Enzimáticamente disociar el tejido picado con enzimas proteolíticas utilizando el kit de la disociación de papaína como se indica en la tabla de materiales / reactivos. Nota: Los componentes reactivos incluyen 4 viales; Vial 1: solución salina equilibrada de Earle (EBSS), Vial 2: containin papaínag L-cisteína y EDTA, Vial 3: Deoxyribonuclease I (DNasa), Vial 4: inhibidor de la proteasa ovomucoide con albúmina de suero bovino (BSA). Nota: Nota: La papaína es una proteasa sulfhidrilo que tiene amplia especificidad de sustratos proteicos. La papaína en el presente documento se deriva a partir del látex de la planta de Carica papaya y degrada la mayoría de los sustratos de proteína más ampliamente que las proteasas pancreáticas. Durante el proceso de disociación hay algún daño celular causando ADN para ser liberado en el medio de disociación que aumentará la viscosidad y hacer pipeteando difícil. Por lo tanto, la ADNasa se incluye en el procedimiento de aislamiento de células para digerir el ADN sin dañar las células intactas. Ovomucoides se glicoproteína inhibidores de la proteasa utilizados para inhibir la actividad de papaína después de la etapa de disociación. </li></ol></li><li> En el primer uso, reconstituir la mezcla de inhibidor de ovomucoide albúmina (vial 4) con 32 ml de EBSS (vial 1), y luego almacenar a 4 ° C y el uso para aislamientos posteriores.Nota: Esto produce una solución a una concentración eficaz de 10 mg de inhibidor de ovomucoide y 10 mg de albúmina por ml. </li><li> Añadir 5 ml de EBSS (vial 1) a un vial de papaína (vial 2), produciendo una solución en 20 unidades de papaína / ml en 1 mM de L-cisteína con EDTA 0,5 mM. Compruebe que la solución de papaína parece claro cuando está completamente disuelto, si no colocar el frasco en un 37 ° C baño de agua durante diez minutos hasta que la papaína se disuelva por completo para garantizar la plena actividad de la enzima. </li><li> Añadir 500 l de EBSS (vial 1) a un vial de DNasa (vial 3) y mezclar suavemente como DNasa es sensible a la cizalla desnaturalización. Añadir 250 l de la solución de DNasa al vial que contiene la papaína, resultando en una concentración final de aproximadamente 20 unidades / ml de papaína y 0,005% de DNasa. Guardar el saldo de la DNasa vial para su uso posterior. </li><li> Coloque la rata picada o tejido humano en la solución de papaína como se ha preparado en el paso 4.4 anteriormente. Para el aislamiento de tejido humano, dividir el tejido picado por igual entre dosviales de papaína (aproximadamente 0,2 g / vial). </li><li> Incubar a 37 ° C con agitación constante en una plataforma basculante para disociar el tejido en la solución de papaína activada. Incubar el tejido de rata durante 45 min a 1 hr, y el tejido humano durante 1 a 2 horas, dependiendo de la cantidad de tejido picado, sobre desde 0,2 hasta 0,4 g respectivamente. </li><li> Se tritura la mezcla con una pipeta de 10 ml para disociar cualquier piezas de tejido restantes para producir una suspensión de células nublado. Transferir la suspensión celular (no incluyen piezas de tejido no disociado) en un tubo cónico de 15 ml estéril y se centrifuga a 300 g durante 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Resuspender las células sedimentadas en medio que contiene ovomucoide, un inhibidor de la papaína. <ol><li> Preparar la solución de ovomucoide mediante la mezcla de 2,7 ml EBSS (vial 1) con 300 l de la solución de inhibidor-albúmina ovomucoide reconstituido (vial 4) en un tubo cónico de 15 ml. Añadir 150 l de solución de DNasa (vial 3) guardados en el paso 4.4 anterior. </li><li> Descartar el sobrenadante delas células sedimentadas y de inmediato volver a suspender el sedimento celular en la mezcla de albúmina-inhibidor de ADNasa diluida. </li></ol></li><li> Células intactas separados de las membranas celulares por centrifugación a través de un gradiente de densidad discontinuo solo paso. <ol><li> Prepare el gradiente de densidad discontinuo mediante la adición de 5 ml de solución de albúmina-inhibidor (vial 4) a un tubo de 15 ml, y usando una pipeta de 5 ml, con suavidad y la capa lentamente la suspensión de células (preparado como se describe anteriormente en la etapa 4.8) en la parte superior de la solución de albúmina-inhibidor. </li><li> Centrifugar a 70 xg durante 6 min a TA. </li><li> Nota: La interfaz entre las dos capas de la gradiente debe ser claramente visible, aunque mezcla mínima en este límite no afecta el resultado. Fragmentos de membrana permanecen en la interfase y células disociadas de pellets en la parte inferior del tubo. </li></ol></li><li> Para células de rata, descartar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células en 1 ml de rata medio EFH (pre-calentado a 37 ° C).Contar densidad de células vivas con un hemocitómetro y la placa de las células en un matraz de cultivo T25 a una densidad de 10 células / l en EFH. El rendimiento típico de las células a partir de tejido de rata es de aproximadamente 2 x 10 6 células con aproximadamente el 80% viability.If cultivos clonales se desea, las células de semillas a una densidad de menos de 10 células / mL. Incubar los matraces a 37 ° C en 5% de CO 2 y permiten que los cultivos crezcan en reposo durante 1 semana para evitar la agregación de las esferas. </li><li> Para células humanas, desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 10 ml de medio de EFH humano (pre-calentado a 37 ° C). Se filtra la suspensión celular a través de un filtro de células de 40 micras nylon siguió con 30 ml de EFH para eliminar los fragmentos de mielina y de la membrana celular. Centrifugar a 300 xg durante 5 minutos y resuspender el sedimento celular en 1 ml de medio de EFH. </li><li> Contar densidad de células vivas con un hemocitómetro y la placa de las células humanas en placas de cultivo de 6 pocillos a una densidad de 10 5 células / pocillo en un volumen totalde 5 ml EFH / pocillo. El rendimiento típico de las células de tejido humano es de aproximadamente 1 x 10 6 células con aproximadamente el 70% de viabilidad. Pozos pre-capa con un sustrato adherente como Matrigel (ver nota abajo). Diluir en una proporción de 40 l Matrigel: 1 ml SFM. </li><li> Nota: Como alternativa, se pueden utilizar otros sustratos adherentes tales como poli-D-lisina / laminina, fibronectina, o colágeno. </li><li> Incubar las placas a 37 ° C en 5% de CO 2 y permitir que los cultivos crezcan en reposo durante 1 semana. </li></ol> 5. pases de rata adulta y NSPCs médula espinal humanos <ol><li> NSPCs Rat formarán pequeños neuroesferas aproximadamente 70 micras de diámetro dentro de 1 semana de siembra inicial; NSPCs rata pasaje semanales mediante la recopilación de la suspensión celular, centrifugación a 300 xg durante 5 min, y triturando mecánicamente el sedimento de células para disociar las neuroesferas. </li><li> Semilla las células disociadas en matraces T25 que contienen rata fresca medio EFH. Alternativamente,utilizar 50% de medio acondicionado de rata para los pases. El rendimiento típico de NSPCs rata en pases es de unos 5 x 10 6 células que aumenta exponencialmente con el número de pases. </li><li> Para los cultivos humanos, una semana después del recubrimiento inicial, reemplace la mitad del medio de cultivo fresco con EFH dos veces por semana para permitir que las células se adhieran al sustrato. Generalmente, 1 - 2 semanas más tarde una vez que las células se han unido al sustrato, reemplazar todo el volumen de medio de cultivo dos veces a la semana con EFH fresco. </li><li> Células subcultura antes de llegar a la confluencia entre 4-8 semanas. <ol><li> Células de subcultivo separando las células del sustrato enzimáticamente (véase la Tabla de Materiales) con 2 ml de enzima por pocillo se incubó durante aproximadamente 10 min a 37 ° C. Recoger suspensión de células, centrifugar a 300 xg durante 5 min, y resuspender suavemente el sedimento celular en 1 ml de medio de EFH recién hecho. </li><li> Contar las células vivas con un hemocitómetro y placa las células en placas de cultivo de 6 pocillos (pre-coado como anteriormente en la etapa 4.12) a una densidad de 10 5 células / pocillo en un volumen total de 5 ml de HEP / pocillo. El rendimiento típico de NSPCs humanos en pases es de aproximadamente 2 x 10 6 células y en general este será el doble con el pasaje. En general, mantener los cultivos con 50% de medio acondicionado EFH 2 - 3 veces por semana entre pases. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Durante la disección de la médula espinal de ratas cuidado el tejido se debe tomar para no dañar la médula espinal en el desempeño de la laminectomía. Es más fácil de aislar el tejido periventricular cuando los segmentos de la médula espinal están intactos. Los segmentos de tejido deben sumergirse plenamente en el tampón de disección y las meninges que recubren y la materia blanca se pueden cortar a medida que tiras longitudinales con micro tijeras. Alternativamente, fórceps de tejidos finos se pueden utili...

NSPCs son células multipotentes comprometidas con el linaje neuronal que puede auto renovar y ampliar fácilmente in vitro. Nos referimos a estas células como una población mixta de células madre / progenitoras neurales ya que presentan propiedades de las células madre multipotentes auto-renovación y progenitores más restringidas. NSPCs se encuentran tanto en el cerebro fetal y adulto y la médula espinal 1,2. En el adulto, NSPCs son normalmente quiescente y residen en nichos específicos, incluyendo la zona subventricular recubre los ventrículos laterales 2-4, y la región periventricular que rodea el canal central de la médula espinal 5,6. Típicamente, NSPCs se cultivan como neuroesferas flotantes o monocapas como adherentes en medio libre de suero suplementado con EGF y bFGF, mitógenos que seleccionan para las poblaciones de células madre / progenitoras. El ensayo neuroesfera desarrollado originalmente por Reynolds y Weiss 2, se usa más comúnmente para la cultura y laexpandir las células madre neurales. NSPCs muestran multipotencia cuando se sembraron en medio que contiene suero factor libre crecimiento, diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Multipotentes, NSPCs auto-renovación pueden ser aisladas y cultivadas a partir de la roedor adulto de la médula espinal cuando el tejido cultivado incluye regiones del canal central 6,7. Una ventaja potencial en el uso de NSPCs generados a partir de la médula espinal adulta en oposición a la generación de células de otras regiones es que estas células específicas de tejido se asemejan más estrechamente células en la médula espinal que se pierde o se daña después de una lesión o enfermedad. Trabajo previo mostró que neuroesferas derivadas de la médula espinal adulta humana no podrían ser propagadas a largo plazo o pases para generar un número suficiente de células 8,9. Sin embargo, con modificaciones en las condiciones de cultivo, se informó de la expansión y el trasplante de médula NSPCs derivadas de la médula humanos adultos, lo que demuestra que la auto-renovacióny NSPCs multipotentes se pueden aislar de la médula espinal adulto humano de donantes de trasplante de órganos 10. En primer lugar, la eliminación de la mayor parte de la materia blanca durante la disección y el cultivo de estas células sobre un sustrato adherente en un medio enriquecido con factor de crecimiento seleccionado para la proliferación de la médula espinal NSPCs adultos humanos. En este protocolo se describe la recolección de la médula espinal de rata adulta y de donantes humanos de trasplante de órganos, la disección del tejido periventricular, y el aislamiento, cultivo y expansión de NSPCs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#10010023</td>
			<td>Dissection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#14175095</td>
			<td>Dissection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># G-6152</td>
			<td>Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#15140-148</td>
			<td>Dissection buffer and culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal-A&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#10888-022</td>
			<td>Culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine, 200mM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#25030-081</td>
			<td>Culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#12587010</td>
			<td>Culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#11885084</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#21700-075</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># S-5761</td>
			<td>Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#H9136</td>
			<td>Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#I-5500</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#T-2252</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># P7505</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selenium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#S-9133</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P-6149</td>
			<td>Hormone mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF, mouse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#E4127</td>
			<td>Prepare 100 &#956;g/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF, human recombinant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#E9644</td>
			<td>Prepare 100 &#956;g/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF, human recombinant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#F0291</td>
			<td>Prepare 100 &#956;g/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin, 10000U</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#H3149</td>
			<td>Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain dissociation kit</td>
			<td>Worthington Biochemicals</td>
			<td>#LK003150</td>
			<td>Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pentobarbital</td>
			<td>Bimeda &#8211; MTC Animal Health Inc</td>
			<td>DIN 00141704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps: Addisons</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#11006-12&#160;</td>
			<td>Serrated standard tip; micro-tip also available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps: Dumont #4</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#11241-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#15024-10</td>
			<td>Round-handled Vannas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeurs</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>N1430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mm Petri dishes&#160;</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Culture flasks</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA21008-949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>CA73520-906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, growth factor reduced (100X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 &#956;l Matrigel: 1 ml SFM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord

Rata adulta y células humanas de la médula espinal neurales madre / progenitoras (NSPCs) cultivadas en medio enriquecido factor de crecimiento permite la proliferación de, y células madre neurales expandibles auto-renovación multipotentes. En condiciones de suero, estas NSPCs multipotentes se diferenciarán, generar neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. El tejido recogido se disocia enzimáticamente en una solución de papaína-EDTA y luego disociado mecánicamente y se separa a través de un gradiente de densidad discontinuo para producir una única suspensión celular que se sembró en medio neurobasal suplementado con factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF ), y heparina. Rata adulta NSPCs médula espinal se cultivan como neuroesferas que flotan libremente y adultos NSPCs médula espinal humanos se cultivan como cultivos adherentes. En estas condiciones, NSPCs de la médula espinal del adulto proliferan, marcadores expresas de células precursoras, y se pueden ampliar de forma continua durante el paso. Estas células pueden abe estudió in vitro en respuesta a diversos estímulos, y los factores exógenos puede ser utilizado para promover restricción linaje neural para examinar la diferenciación de células madre. Multipotentes NSPCs o su progenie también pueden ser trasplantadas en diversos modelos animales para evaluar la reparación regenerativa.

Las células de la médula espinal de ratas adultas cultivadas en cultivo en suspensión en un medio EFH formarán pequeños neuroesferas (colonias de células indiferenciadas) dentro de 1 semana de chapado inicial. En cultivos primarios, la mayoría de las células sembradas morirán y las células madre de factor de respuesta de crecimiento se proliferan y se seleccionan en el medio EFH. Por el paso 3, habrá numerosos neuroesferas que flotan libremente alrededor de 100 micras de diámetro (Figura 2A).</strong...

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Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

Aislamiento de células neurales madre / progenitoras de la región periventricular de la rata de Adultos y de la médula espinal humana

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

isolation-neural-stemprogenitor-cells-from-periventricular-region

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.1K vistas.  Toronto Western Research Institute and Krembil Neuroscience Center. The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors. 

Video: Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

Aislamiento y expansión de células madre mesenquimales / estromales derivadas de tejido de placenta humana

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Isolation and Expansion of Adult Canine Hippocampal Neural Precursors

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural intermediacy between the rodent and human hippocampi, is therefore a valuable model in which to study adult neurogenesis. In vitro culture assays are an essential component of characterizing neurogenesis and adult neural precursor cells, allowing for precise control over the cellular environment. To date however, culture protocols for canine cells remain under-represented in the literature. Detailed here are systematic protocols for the isolation and culture of hippocampal neural precursor cells from the adult canine brain. We demonstrate the expansion of canine neural precursor cells as floating neurospheres and as an adherent monolayer culture, producing stable cell lines that are able to differentiation into mature neural cell types in vitro. Adult canine neural precursors are an underused resource that may provide a more faithful analogue for the study of human neural precursors and the cellular mechanisms of adult neurogenesis.

The canine brain is a valuable model in which to study adult neurogenesis. Presented here are protocols for isolating and expanding adult canine hippocampal neural precursor cells from primary brain tissue.

El aislamiento y la expansión de los adultos canina hipocampo neuronales Precursores

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

Aislamiento y caracterización de las células mesenquimales del estroma de cordón umbilical humano y fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. Currently, efforts are being made to regenerate damaged cartilage with ex vivo expanded chondrocytes or bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs). However, the restricted viability and instability of these cells limit their application in cartilage reconstruction. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have received scientific attention as a new alternative for regenerative applications. With unlimited self-renewal ability and multipotency, hiPSCs have been highlighted as a new replacement cell source for cartilage repair. However, obtaining a high quantity of high-quality chondrogenic pellets is a major challenge to their clinical application. In this study, we used embryoid body (EB)-derived outgrowth cells for chondrogenic differentiation. Successful chondrogenesis was confirmed by PCR and staining with alcian blue, toluidine blue, and antibodies against collagen types I and II (COL1A1 and COL2A1, respectively). We provide a detailed method for the differentiation of cord blood mononuclear cell-derived iPSCs (CBMC-hiPSCs) into chondrogenic pellets.

Here, we propose a protocol for chondrogenic differentiation from cord blood mononuclear cell-derived human induced pluripotent stem cells.

Formación de gránulos condrogénicos a partir de células madre pluripotentes inducidas derivadas de sangre del cordón umbilical

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and colleagues1. Later, others documented the existence of similar types of EPCs originating from bone marrow2,3. More recently, Yoder and Ingram showed that EPCs derived from umbilical cord blood had a higher proliferative potential compared to ones isolated from adult peripheral blood4,5,6. Apart from being involved in postnatal vasculogenesis, EPCs have also shown promise as a cell source for creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs7,8. Various isolation protocols exist, some of which involve the cell sorting of mononuclear cells (MNCs) derived from the sources mentioned earlier with the help of endothelial and hematopoietic markers, or culturing these MNCs with specialized endothelial growth medium, or a combination of these techniques9. Here, we present a protocol for the isolation and culture of EPCs using specialized endothelial medium supplemented with growth factors, without the use of immunosorting, followed by the characterization of the isolated cells using Western blotting and immunostaining.

The goal of this protocol is to isolate endothelial progenitor cells from umbilical cord blood. Some of the applications include using these cells as a biomarker for identifying patients with cardiovascular risk, treating ischemic diseases, and creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs.

Aislamiento de células endoteliales progenitoras de la sangre de cordón Umbilical humano

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and neurite outgrowth; and later stages characterized by axon/dendrite outgrowth and synapse formation. In neurodevelopmental disorders, often one or more of these processes are disrupted, leading to abnormalities in brain formation and function. With the advent of human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology, researchers now have an abundant supply of human cells that can be differentiated into virtually any cell type, including neurons. These cells can be used to study both normal brain development and disease pathogenesis. A number of protocols using hiPSCs to model neuropsychiatric disease use terminally differentiated neurons or use 3D culture systems termed organoids. While these methods have proven invaluable in studying human disease pathogenesis, there are some drawbacks. Differentiation of hiPSCs into neurons and generation of organoids are lengthy and costly processes that can impact the number of experiments and variables that can be assessed. In addition, while post-mitotic neurons and organoids allow the study of disease-related processes, including dendrite outgrowth and synaptogenesis, they preclude the study of earlier processes like proliferation and migration. In neurodevelopmental disorders, such as autism, abundant genetic and post-mortem evidence indicates defects in early developmental processes. Neural precursor cells (NPCs), a highly proliferative cell population, may be a suitable model in which to ask questions about ontogenetic processes and disease initiation. We now extend methodologies learned from studying development in mouse and rat cortical cultures to human NPCs. The use of NPCs allows us to investigate disease-related phenotypes and define how different variables (e.g., growth factors, drugs) impact developmental processes including proliferation, migration, and differentiation in only a few days. Ultimately, this toolset can be used in a reproducible and high-throughput manner to identify disease-specific mechanisms and phenotypes in neurodevelopmental disorders.

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs

Neurodevelopmental processes such as proliferation, migration, and neurite outgrowth are often perturbed in neuropsychiatric diseases. Thus, we present protocols to rapidly and reproducibly assess these neurodevelopmental processes in human iPSC-derived NPCs. These protocols also allow the assessment of the effects of relevant growth factors and therapeutics on NPC development.

Rápida detección de los fenotipos del neurodesarrollo en las células precursoras neuronales humanos (PNJ)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

El aislamiento y cultivo de células epicárdicas principales derivan de ejemplares de corazón humano adulto y Fetal

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally isolated and characterized from bone marrow (BM), then acquired from tissues including adipose tissue, synovium, skin, dental pulp, and fetal appendages such as placenta, umbilical cord blood (UCB), and umbilical cord (UC). MSCs are a heterogeneous cell population with the capacity for (1) adherence to plastic in standard culture conditions, (2) surface marker expression of CD73+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-/CD14-/CD19-/HLA-DR- phenotypes, and (3) trilineage differentiation into adipocytes, osteocytes, and chondrocytes, as currently defined by the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Although BM is the most widely used source of MSCs, the invasive nature of BM aspiration ethically limits its accessibility. Proliferation and differentiation capacity of MSCs obtained from BM generally decline with the age of the donor. In contrast, fetal MSCs obtained from UC have advantages such as vigorous proliferation and differentiation capacity. There is no ethical concern for UC sampling, as it is typically regarded as medical waste. Human UC starts to develop with continuing growth of the amniotic cavity at 4-8 weeks of gestation and keeps growing until reaching 50-60 cm in length, and it can be isolated during the whole newborn delivery period. To gain insight into the pathophysiology of intractable diseases, we have used UC-derived MSCs (UC-MSCs) from infants delivered at various gestational ages. In this protocol, we describe the isolation and characterization of UC-MSCs from fetuses/infants at 19-40 weeks of gestation.

Human umbilical cord (UC) can be obtained during the perinatal period as a result of preterm, term, and postterm delivery. In this protocol, we describe the isolation and characterization of UC-derived mesenchymal stem cells (UC-MSCs) from fetuses/infants at 19-40 weeks of gestation.

Aislamiento y caracterización de humanas derivadas de cordón Umbilical las células madre mesenquimales de prematuros y recién nacidos a término

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

Generación de 3D piel organoide de cable derivadas de sangre inducida por las células de vástago Pluripotent

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a differentiation state to sustain demands of the blood formation. However, it has been difficult to analyze the metabolic status (mitochondrial respiration and glycolysis) of HSPCs due to their limited numbers and lack of optimized protocols for non-adherent, fragile HSPCs. Here, we provide a set of clear, step-by-step instructions to measure metabolic respiration (oxygen consumption rate; OCR) and glycolysis (extracellular acidification rate; ECAR) of murine bone marrow-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs. This protocol provides a higher amount of LSK HSPCs from murine bone marrow, improves the viability of HSPCs during incubation, facilitates extracellular flux analyses of non-adherent HSPCs, and provides optimized injection protocols (concentration and time) for drugs targeting oxidative phosphorylation and glycolytic pathways. This method enables the prediction of the metabolic status and the health of HSPCs during blood development and diseases.

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) transition from a quiescent state to a differentiation state due to their metabolic plasticity during blood formation. Here, we present an optimized method for measuring mitochondrial respiration and glycolysis of HSPCs.