Name: athymic rat model for evaluation of engineered anterior cruciate ligament grafts
Uploaded: 2015-03-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
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Die Autoren bedanken sich bei Gabriel Arom und Michael Yeranosian für ihre technischen Beiträge zu früheren Iterationen dieses Projekts danken. Dieses Projekt wurde von der OREF Kliniker Scientist Ausbildung Grant (NL) finanziert, HH Lee Surgical Research Grant (NL), Veterans Administration BLR &amp; E Merit Bewertung 1 I01 BX00012601 (DM) und Muskel-Skelett-Stiftung für Transplantation Young Investigator Award (FP).

HINWEIS: Alle Tier Operationen wurden von der örtlichen Tierärzten und Tier Verwendung Ausschuss vor Beginn der Experimente zugelassen. 1. Vorbereitung von elektro Polycaprolacton Gerüste <ol><li> Einwiegen und lösen Grade Ester medizinischen Poly (ε-caprolacton) in Granulatform, in 1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-propanol, um eine 10% w erstellen / w Lösung des PCL-Polymer. Lassen Sie die Lösung für Aufsehen mit einer Rührplatte für mindestens 3 Stunden um eine homogene Lösung zu gewährleisten. </li><li> Elektrospinnen den PCL-Lösung, um eine Manschette hoch ausgerichtet PCL-Fasern für Gerüstherstellung erstellen. <ol><li> Bereiten Sie das Elektrospinnen Setup in einem Laborabzug mit dem Lüfter auf zu allen Zeiten. Diese besteht aus einem großen Acryl-Box, die als isolierte Vakuum Medium für die Elektrospinnverfahren Einstiegspunkte für die Quelle PCL-Lösung durch eine Spannungsquelle, die motorgetriebene Sammeln Dorn und einem Vakuumanschluss angetrieben dienen und hat. Reinigen Sie die acrylic Kasten gründlich mit Ethanol und decken alle Oberflächen mit Parafilm Blätter, um Verunreinigungen, die die Qualität der elektro Produkts beeinträchtigen können, zu entfernen. </li><li> Last ungefähr 3 ml der obigen Lösung in eine 10 ml-Spritze mit einer stumpfen Enden 18 G, 1 ½ inch Nadel. Entfernen Sie alle Luftblasen, indem Sie die Spritze auf. Schleusenlösung in eine programmierbare Spritzenpumpe. Führen Sie die Nadel durch ein kleines Loch in die Acryl-Box, während ca. ½ Zoll der Nadel außerhalb des Acryl-Box für die Befestigung der Spannungsquelle Draht. </li><li> Verwenden Sie eine 30 mm-Drehmaschine Drehdorn als Kollektor für die hoch ausgerichtet PCL-Fasern; decken den Dorn fest mit einem dünnen Streifen aus Aluminiumfolie. Verriegeln des Dorns in den Motor auf der gegenüberliegenden Seite der Box, etwa 15 cm weg von der Injektionsnadel. </li><li> Stecken Sie den Kunststoffschlauch in die Vakuumanschluss und eine Verbindung zum Abzug Vakuumquelle. Einschalten der Vakuumquelle und decken das Acryl-Box mit einem Deckel. </li><li> Set die Infusionsrate der programmierbaren Spritzenpumpe auf 2,5 ml / hr. Schalten Sie den Motor, um den Dorn bei 3450 Umdrehungen pro Minute betrieben und bringen Sie den Pluspol der Spannungsquelle an der Nadelspitze außerhalb der Box mit einer Krokodilklemme. </li><li> Nach Infusion der PCL-Lösung begonnen hat, schalten Sie die Spannungsquelle und zu einer 20 kV Betriebsspannung eingestellt. </li><li> Die Infusion erfolgt die Lösung für 12 min, um eine homogene Manschette 0,5 ml der PCL-Lösung. HINWEIS: Im Durchschnitt hat jeder Manschette genügend elektro Material zwei Sechsstreifen Blätter, die verwendet werden können, um insgesamt drei vierlagige Gerüste zu schaffen. </li></ol></li><li> Laser schneiden Sie die PCL-Manschette, mehrere kleine Blätter auf einem VersaLaser Cutter 2.3 bei niedrigem Vakuumeinstellung, 10,0 keV Landespannung, 6,4 mm Arbeitsabstand und Sondendurchmesser von 3,0 betrieben zu bilden. HINWEIS: In diesem Beispiel wurde ein Computer Aided Design verwendet, um den Schneider anzuweisen, mehrere Blätter x 35 mm x 150 um Gerüste mit einer Ausbeute von 1,5 mmgleichmäßig verteilt 150 um Löcher mit einem Durchmesser von 15% Porenfläche. </li><li> Plasma ätzen die PCL Gerüste mit einem Plasma-Reiniger, um Hydrophilie der PCL-Oberfläche mit Ionenbeschleunigung zu induzieren. Stellen Sie das Vakuum auf 450 mTorr und dem Genuss die Gerüste für 30 Sekunden bei hoher Leistung (29,6 W). </li><li> Bathe die Gerüste in 70% Ethanol in einer sterilen Umgebung. </li><li> Bestreichen Sie die einzelnen Gerüste mit Kollagen, zelluläre Adhäsion und Proliferation in vivo zu erleichtern. <ol><li> Erstellung einer Kollagenbeschichtungslösung durch Verdünnen einer 8: 1: 2,5 sterile Lösung Purecol Kollagen 3 mg / ml Standardlösung, 10x PBS und 0,1 N NaOH 1: 9 in 1x PBS bei 4 ° C. Gründlich mischen, um Lösung Homogenität zu gewährleisten. </li><li> Coat einzelnen 1,5 mm x 35 mm x 150 um Gerüste mit einer dünnen Folie aus dem obigen Kollagenlösung. Man lässt 24 h in einer sterilen Umgebung zu trocknen. </li></ol></li><li> Mit 5-0 Vicryl Nahtmaterial, stapeln und bringen vier Einzel 1,5 mm x 35 mm x 150 um Gerüstemit einem Krackow Stich, um eine endgültige Dicke von 0,6 mm, vielschichtig, mit Kollagen beschichteten Gerüst, das bereit für die Implantation zu schaffen. </li></ol> 2. Rat Chirurgie Protocol <ol><li> Anästhesie herbei indem Ratte in der Inhalationskammer und liefert 2% Isofluran mit 2 l / min Sauerstoff. Bestätigen Sie die Ratte ausreichend durch Druck auf Fuß hinter und Bewertung für jede Antwort betäubt. </li><li> Auf der nicht-sterilen zurück Tabelle, subkutan injiziert 25 mg / kg Ampicillin und 0,03 mg / kg Buprenorphin. </li><li> Bewerben Augensalbe für die Augen. Befestigen Sie den Pelz aus dem operativen Hinterbein und prep die Operationsstelle mit drei Wechsel Peelings von Chlorhexidin und 70% Ethanol. </li><li> Übertragen Sie die Ratte auf dem OP-Tisch, auf einem Heizkissen zu Unterkühlung zu verhindern. Sichere Bugnase und Aufrechterhaltung einer Narkose durch das Verfahren mit 2% Isofluran in 2 l / min Sauerstoff, geliefert Nasenkegel. Abdecktuch steril, so dass die operative Glied ausgesetzt. </li><li&gt; Vor dem Start der Operation, nach Best angemessene Betäubung durch Fehlen einer Reaktion auf Fußdruck hinter. </li><li> Einen 2 cm langen vertikalen Einschnitt medial zum Knie, auf der Ebene der Patella zentriert. Ziehen Sie die Haut seitlich, bis der Schnitt über dem Knie zentriert. </li><li> Verwenden Sie ein Skalpell, um einen medialen parapatellar Arthrotomie, indem nur der Patella medial und proximal zu dem Niveau der Muskelsehnenverbindung des Quadrizeps und distal zu der Ebene der Patellarsehnenansatzes auf dem Schienbein tubercule machen. Darauf achten, dass die Patella oder Quadrizeps Sehnen schneiden. </li><li> Seitlich Mitteilung Kniescheibe, indem Sie einen 1 cm vertikaler Schnitt durch die Kniekapsel unmittelbar lateral der Patellarsehne. </li><li> Stellen Sie sicher, das Knie gestreckt. Nehmen Sie ein Paar für feine Schneid fahren unter der Kniescheibe von lateral nach medial. Verbreiten Sie die Schere ein paar Mal, so dass die Streckapparat ist zu beiden Seiten übersetzt werden. </li><li> Während Biegen ter Knie, übersetzen die Patella seitlich an der Innenseite des Kniegelenks aussetzen. Stellen Sie sicher, klare Visualisierung der Fossa intercondylaris und Femurkondylen. Mit einem Skalpell durchschneiden die ACL und PCL in die Kerbe. </li><li> Last Bohrmaschine mit einem 1,6 mm K-Draht. Zeigen k-Drahtspitze auf ACL Ursprung in der Fossa intercondylaris. Bohren Sie superolaterally und visualisieren den Ausgangspunkt auf der lateralen Seite des Oberschenkels, Entfernen von Weichgewebe bei Bedarf mit einem Skalpell. Übergeben Sie die k-Draht in und aus ein paar Mal, um freien Durchgang für das Transplantat zu gewährleisten. </li><li> Legen Sie die k-Draht auf der ACL-Fußabdruck auf dem Tibiaplateau. Bohren Sie anterolateral und visualisieren Austrittspunkt auf der anterolateralen Tibia. Verwenden Skalpell, um Weichgewebe bei Bedarf zu löschen, so dass der Punkt, wo die k-Draht verlässt die Tibia vollständig sichtbar ist. </li><li> Übergeben Sie eine verkürzte Keith Nadel (idealerweise nicht mehr als 2 cm lang) durch die Oberschenkelknochentunnel. Führen Sie die beiden Fadenenden von einem Ende des Transplantats durch das Auge des Keith Nadel. Verwenden Sie die Nadel an einem Ende des Transplantats durch den Femoral-Hohlraum zu ziehen. </li><li> Wiederholen Sie den vorherigen Schritt, um das andere Ende des Transplantats durch den tibialen Tunnel. </li><li> Verwenden Sie 4-0 Vicrylnaht die Oberschenkel Ende des Transplantats in die umliegenden Knochenhaut oder anderes weiches Gewebe mit einer Figur einer Acht Masche anzubringen. Manuelles Spannen des Transplantats mit dem Knie in Extension. Befestigen Sie den Tibia- Ende des Transplantats in die umliegenden Knochenhaut oder anderes weiches Gewebe mit einer Figur einer Acht Stich. </li><li> Verwenden Sie eine Schere abzuschneiden überschüssige Transplantat an beiden Enden, so dass 1-2 mm an jedem Ende an der Zahl Acht Stich. </li><li> Verlängern Sie die Knie und zur Verringerung der Kniescheibe. Mit 4-0 Vicryl, legen Sie eine einzelne Zahl Acht Masche, um die mediale Gelenkkapsel zu schließen, verhindert seitlichen Subluxation der Patella. </li><li> Schließen Sie die Haut mit einer Lauf subkutikuläre 5-0 Monocryl oder Vicrylnaht, mit darauf, dass die darunter liegende Muskulatur zu nähen oder sichtbare Naht, wenn die Haut wird geschlossen. </li><li> Inject Ratten subkutan mit Buprenorphin alle 12 h für insgesamt drei Tage nach der Operation. Prüfen Operationsstelle für jede Drainage oder Wunddehiszenz zum Zeitpunkt der Injektion. Hinken und einige Schwellungen sind normal in den ersten Tagen nach der Operation, aber prompt wenden Sie sich bei postoperativen Bedenken im Zusammenhang mit Tierärzten. Das Tier kann den sozialen Wohnungsbau der Operation zurück werden in 2 Wochen, als chirurgische Schnitte werden vollständig geheilt. </li></ol> 3. Datenerfassung Protocol <ol><li> Zum Zeitpunkt der Opfer ersticken Ratten einzeln in einem geschlossenen CO 2 Kammer gefolgt von Thorakotomie. </li><li> Ernten Sie sowohl die operativ rekonstruiert und kontralateralen Gliedmaßen durch die Trennung im Hüftgelenk. <ol><li> Für den rekonstruierten Gliedmaßen, entfernen Sie alle Weichgewebe, einschließlich des hinteren Kreuzbandes und den Überresten aus dem chirurgisch gestört Mutter ACL, mit feinen Sezierung, nur den Oberschenkel, Schienbein, und Graft isolieren. </li> &lt;li&gt; Für die kontralateralen Gliedmaßen, entfernen Sie alle Weichteile bis auf die Mutter ACL als auch die Ober- und Unterschenkel durch feinen Sezierung. </li><li> Verwenden eines Drehwerkzeuges, wie Dremel, alle bis ¾ bis 1 cm von Knochen von jedem Ende des Femur-graft-Tibia-Komplex zu entfernen. </li><li> Während dieses Prozesses und im gesamten biomechanischen Tests, regelmäßig und häufig sprühen die Band Regionen mit physiologischer Kochsalzlösung, um ein Austrocknen des geernteten Knie die fälschlicherweise Ergebnisse verändern können, zu verhindern. </li></ol></li><li> Für die histologische Analyse, beheben jedes Knie einzeln in 4% Paraformaldehyd-Lösung bei 25 ° C für 48 Stunden. Als nächstes tauchen das Knie in einer Lösung von Immunocal Reagenz für vollständige Entkalkung; Dieses Verfahren ist abhängig von den calcific Inhalt der Probe und kann bis zu fünf Tage dauern. Überprüfen Sie einzelne Proben täglich den Fortschritt als unvollständig Entkalkung kann Probenqualität senken zu bewerten. Wenn Sie fertig sind, führen Sie Schneiden, Schienenführung und Färbung nach Wunsch. </li><li> Perform biomechanische Tests, um die Funktionsfähigkeit des Tissue Engineering Bänder bewerten. <ol><li> Sichern Sie die Oberschenkel und Schienbein durch Umwickeln 28 G Stahl verzinkt Draht um die Epiphyse der einzelnen Knochen getrennt. Dies ist zu ungenauen biomechanischen Testdaten vor vorzeitiger Zugversagen der Probe am Knochen und nicht am Bandinteressiere verhindern. </li><li> Pot der Oberschenkelknochen in eine Mischung aus Polymethylmethacrylat (PMMA) Knochenzement. Dazu mischen Sie die beiden Zementkomponenten und sofort die viskose Mischung, um den Oberschenkelknochen in das Metall zu sichern, vollständig umschließt die Diaphyse des Knochens in dem Hart Topf mit der Epiphyse und die angeschlossenen Band frei herausragend. Lassen spontane radikalische Polymerisation nach und nach zu einer teigigen Material und schließlich in eine feste gehärtete Matrix-Transformation der gemischten viskosen Komponenten. HINWEIS: Dieser Vorgang dauert mehrere Minuten und kann durch die manuelle Prüfung der Temperatur des Bolus aus gemacht überwacht werdender restliche Zement; sollte die Temperatur vorübergehend während der exothermen Polymerisationsreaktion zu erhöhen und klingen auf RT nach dem Material erstarrt. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang über zum Zementieren der Tibia, nur unter Beibehaltung der Kreuzbandriss bei 20 ° Flexion für optimale mechanische Prüfung. </li><li> Montieren Sie den zementierten Femur-graft-Tibia-Komplex auf eine Zugprüfmaschine, und bereiten sich auf Rekord Last und Verschiebung als Funktion der Zeit vom Beginn der Spannung zum Scheitern. In diesem Beispiel verwendeten wir ein Instron Modell 5564 mit einer 1 kN Lastzelle. </li><li> Vorspannung das Transplantat zu 2 N bei einem Anstieg von 0,5 N / min und testen Sie dann das Transplantat zum Scheitern bei einer Verformungsgeschwindigkeit von 0,5 mm / sec. Während des Prozesses werden Sie sicher, dass das Band an der Mitte der Substanz versagen und dass die Knochen Oberschenkel und Schienbein sicher sind und nicht vorzeitig versagen, was ungenau abschätzen kann biomechanischen Eigenschaften der getesteten Ligament. </li><li> Verwenden Sie die erzeugte Last-Weg-Kurven, die Bruchlast und Steifigkeit des getesteten Ligament zu berechnen. </li></ol></li></ol>

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+fiber+diameter+and+alignment+of+electrospun+polyurethane+meshes+on+mesenchymal+progenitor+cells.">Effect of fiber diameter and alignment of electrospun polyurethane meshes on mesenchymal progenitor cells.</a> Tissue Eng Part A. 15 (9), 2435-2445 (2009).</li><li>Dash, T. K., Konkimalla, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly-&#1108;-caprolactone+based+formulations+for+drug+delivery+and+tissue+engineering:+A+review.">Poly-&#1108;-caprolactone based formulations for drug delivery and tissue engineering: A review.</a> J Control Release. 158 (1), 15-33 (2012).</li><li>Yoshimoto, H., Shin, Y. M., Terai, H., Vacanti, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biodegradable+nanofiber+scaffold+by+electrospinning+and+its+potential+for+bone+tissue+engineering.">A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering.</a> Biomaterials. 24 (12), 2077-2082 (2003).</li><li>Xu, Y., Ao, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+and+biomechanical+studies+of+inter-strand+healing+in+four-strand+autograft+anterior+cruciate+ligament+reconstruction+in+a+rabbit+model.">Histological and biomechanical studies of inter-strand healing in four-strand autograft anterior cruciate ligament reconstruction in a rabbit model.</a> Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 17 (7), 770-777 (2009).</li><li>Shino, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replacement+of+the+anterior+cruciate+ligament+by+an+allogeneic+tendon+graft.+An+experimental+study+in+the+dog.">Replacement of the anterior cruciate ligament by an allogeneic tendon graft. An experimental study in the dog.</a> J Bone Joint Surg Br. 66 (5), 672-681 (1984).</li><li>Stasiak, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+device+to+apply+controlled+flexion+and+extension+to+the+rat+knee+following+anterior+cruciate+ligament+reconstruction.">A novel device to apply controlled flexion and extension to the rat knee following anterior cruciate ligament reconstruction.</a> J Biomech Eng. 134 (4), 041008 (2012).</li><li>Brophy, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+short-duration+low-magnitude+cyclic+loading+versus+immobilization+on+tendon-bone+healing+after+ACL+reconstruction+in+a+rat+model.">Effect of short-duration low-magnitude cyclic loading versus immobilization on tendon-bone healing after ACL reconstruction in a rat model.</a> J Bone Joint Surg Am. 93 (4), 381-393 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

ACL Verletzungen sind eine häufige Erkrankung in der orthopädischen Sportchirurgie, mit begrenzten Möglichkeiten für den Wiederaufbau in der heutigen Zeit. Um einen geeigneten Tissue-Engineering Ersatz für die ACL, die Regeneration in vivo ermöglicht entwickeln wird ein geeignetes Tiermodell erforderlich. In dieser Studie wird die Herstellung eines biologisch abbaubaren Werk Transplantats beschrieben, so ist seine in vivo-Implantation unter Verwendung eines reproduzierbaren Modell ACL-Rekonstrukt...

Ruptur des vorderen Kreuzbandes (ACL) ist eine der häufigsten Verletzungen der Bänder des Knies 1. Da die gerissenen ACL nicht ohne chirurgischen Eingriff zu heilen ist, die Einschränkungen in Aktivitäten des täglichen Lebens, sowie die Teilnahme an Sport fahren mehr als 175.000 Patienten einer Operation unterziehen jedes Jahr 2, mit geschätzten Kosten von einer Milliarde Dollar jährlich 3. Derzeit wird entweder autologe oder Allograft-Sehne für Bandrekonstruktion verwendet. Obwohl hohe Erfolgsraten kann sowohl mit Autograft und Transplantatersatz erreicht werden, sind schwere Komplikationen mit diesen Wiederaufbau Optionen 4 verbunden. Autologe Gewebe mit Entnahmemorbidität assoziiert und ist im Lieferumfang beschränkt, vor allem in Fällen von Wieder Bruch oder Mehrbandverletzung. Auf der anderen Seite wird Allotransplantatgewebe mit verzögerter Transplantatintegration, schädliche Entzündungsreaktion, theoretische Infektionsrisiko und begrenzte supp verbundenly 5. Synthetische nicht abbaubaren Transplantate wurden in den 1970er und 1980er Jahren entwickelt wurden aber von vorzeitigen Bruch Transplantat, Fremdkörperreaktionen, Osteolyse und Synovitis 6 behindert. Als Ergebnis dieser ernsthaften Bedenken gibt es noch keine synthetische Transplantate für den klinischen Einsatz in den Vereinigten Staaten zur Verfügung. Aufgrund dieser Einschränkungen mit bestehenden Transplantat-Optionen und die jüngsten Entwicklungen in der Biologie, Technik und regenerative Medizin, gab es ein großes Interesse an einer Tissue Engineering Lösung für ACL Pfropfen. Aktuelle Tissue-Engineering-Strategien beschäftigen abbaubaren biologischen und synthetischen Materialien, um für Host Einwachsen von Gewebe zu ermöglichen, während die Vermeidung der Einschränkungen mit Permanent Kunststoff Implantation 7 verbunden. Polycaprolacton (PCL) ist ein biologisch abbaubares Polymer, das von der FDA für eine Reihe von medizinischen Anwendungen einschließlich Adhäsionsbarriere und Wundverband 8 ist, dass u gewesen istin einer Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Gefäß, Knochen, Knorpel, Nerven, Haut, und Speiseröhrenkrebs Tissue Engineering 5,9-16 sed. Günstige Biokompatibilität relativ lange in-vivo-Halbwertszeit, eine ausreichende mechanische Festigkeit und hohe Elastizität tragen zur Popularität dieses Polymer in Tissue Engineering. In einem Nagetiermodell der Wundheilung wurde implantierten elektro PCL gezeigt, dass nicht-immunogen und in lokale Gewebe ohne Nebenwirkungen bei 13 zu integrieren. Ein SEM-Bild von elektro PCL ist in Abbildung 1 dargestellt. Mit aktuellen FDA regulatorischen Standards, Wirksamkeit und Sicherheit in kleinen und großen Tiermodellen würde bei einer PCL oder andere technisch ACL Transplantat benötigt, um in klinischen Studien in den Vereinigten Staaten zu bewegen. Darüber hinaus können in vivo-Bedingungen oft erweitern die Eigenschaften eines in vitro Gewebezüchtung ACL Transplantat. Ein Rattenmodell der autologen ACL-Rekonstruktion mit Beuge digitorum longus wurde bereits beschrieben, in dem die Mutter ACL wurde abgetrennt, Oberschenkel- und Schienbein Tunnel wurden gebohrt, und das Transplantat wurde verabschiedet und an Ort und Stelle mit Naht 17-22 gesichert. In dieser Arbeit werden wir eine Änderung des Modells für die Auswertung von technischen ACL Ersetzungen nicht für Autograft-basierte Rekonstruktion (Abbildung 2) zu beschreiben. Obwohl viele Tiermodelle für Bandgewebetechnik vorhanden sind, ist die Ratte vorteilhaft im Vergleich zu größeren Modelle für eine Reihe von Gründen. Zu diesen Vorteilen gehören einfacher Haltung und Handhabung, weniger ethische Überlegungen und reduzierte Kosten 17,23. Darüber hinaus ist die Ratten-Modell wurde umfangreich als ein Modell für orthopädische Geweberegeneration, einschließlich Knorpel, Sehnen und Knochengewebe 24 verwendet. Insbesondere wurden athymische Nacktratten aufgrund ihrer mangel der zellvermittelten Immunantwort 25 gewählt, so dass für die spätere Implantation of xenogenen Spenderzellen in diesem Modell zur weiteren Verbesserung der technisch Transplantat in der Zukunft. In diesem Verfahren Papier beschreiben wir die Herstellung und chirurgischen Implantation einer zellfreien, biologisch abbaubaren Polymer Transplantat in einer athymischen Rattenmodell der ACL-Rekonstruktion.

<table><tbody><tr><td>Medical grade ester terminated poly (&amp;epsilon;-caprolactone), granule form (MW = 110,000)</td><td><a href="http://www.absorbables.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Lactel Absorbable Polymers</a></td><td></td><td>Custom synthesized polymer to desired molecular weight</td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>105228</td><td>Solvent for PCL polymer</td></tr><tr><td>18 G x 1&amp;#189;&quot; bevel needle</td><td>BD Medical</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Remote Infuse/Withdraw Programmable Syringe Pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702101</td><td></td></tr><tr><td>VersaLaser VLS2.30 Laser Engraver</td><td>Microgeo USA</td><td>VLS2.30</td><td></td></tr><tr><td>Expanded Plasma Cleaner 115&amp;nbsp;V</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td>Plasma etch just prior to collagen coating for surface modification</td></tr><tr><td>PureCol Collagen Standard Solution, 3&amp;nbsp;mg/ml</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5015-A</td><td>Mix 8:1:2.5 solution of PureCol, 10x PBS, 0.1&amp;nbsp;N NaOH 1:9 in 1x PBS</td></tr><tr><td>Suture, 5-0 Vicryl</td><td>Henry Schein</td><td>1086471</td><td></td></tr><tr><td>Suture, 4-0 Vicryl</td><td>Henry Schein</td><td>6540072</td><td></td></tr><tr><td>Sharp-pointed Dissecting Scissors (Straight; 4.5&amp;nbsp;inch)</td><td>Fisher Scientific</td><td>8940</td><td></td></tr><tr><td>Buphrenorphine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9275</td><td>Use 0.03 mg/kg for both intra- and post-operatively for pain control</td></tr><tr><td>Ampicillin, injectable</td><td>Henry Schein</td><td>1185678</td><td>Use 25 mg/kg subcutaneously during the procedure</td></tr><tr><td>K-wire, 1.6 mm</td><td>Spectrum Surgical</td><td>SI040062</td><td></td></tr><tr><td>Keith Needle, Straight 1&amp;#189;&quot;</td><td>Delasco Dermatology Lab &amp;amp; Supply</td><td>KE-112</td><td></td></tr><tr><td>Immunocal Decalcifying Solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9491030</td><td></td></tr><tr><td>Opticryl Acrylic Resin Bone Cement (PMMA) (Monomer and polymer)</td><td>US Dental Depot</td><td>OPTICRYL 100410&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Instron Model 5564 Tensile Testing Machine</td><td>Instron</td><td>5564</td><td>Any comparable tensile testing apparatus is suitable</td></tr></tbody></table>

athymic rat model for evaluation of engineered anterior cruciate ligament grafts

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without intervention. Current treatment strategies include ligament reconstruction with either autograft or allograft, which each have their associated limitations. Thus, there is interest in designing a tissue-engineered graft for use in ACL reconstruction. We describe the fabrication of an electrospun polymer graft for use in ACL tissue engineering. This polycaprolactone graft is biocompatible, biodegradable, porous, and is comprised of aligned fibers. Because an animal model is necessary to evaluate such a graft, this paper describes an intra-articular athymic rat model of ACL reconstruction that can be used to evaluate engineered grafts, including those seeded with xenogeneic cells. Representative histology and biomechanical testing results at 16 weeks postoperatively are presented, with grafts tested immediately post-implantation and contralateral native ACLs serving as controls. The present study provides a reproducible animal model with which to evaluate tissue engineered ACL grafts, and demonstrates the potential of a regenerative medicine approach to treatment of ACL rupture.

Wir haben die Erfahrung von 92 Ratten Operationen von einem einzigen Chirurgen, meine operative Zeit vom Schnitt bis zur Fertigstellung der Wunde war 16,9 min, mit einer Standardabweichung von 4,7 min. Zum Zeitpunkt der Opfer, wog Ratten 356 ± 23 g. Alle Ratten toleriert die Operation gut und hatten keine Komplikationen. Unmittelbar nach der Operation wurden die Ratten darauf hingewiesen, das Gewicht auf dem operativen Ende tragen, zeigten aber eine leichte schlaff. Um eine Woche nach der Operation wurden alle Ratten o...

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Athymic Rat Model for Evaluation of Engineered Anterior Cruciate Ligament Grafts

Animal models are important tools for the evaluation of tissue-engineered grafts. This paper presents the protocol for preparing an electrospun biodegradable polymer graft for use in anterior cruciate ligament tissue engineering, as well as a surgical protocol for implantation in a rat model.

Athymischen Rattenmodell für die Bewertung von Engineered vorderen Kreuzbandes Grafts

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without ...

athymic-rat-model-for-evaluation-engineered-anterior-cruciate

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.3K Aufrufe.  University of California Los Angeles. Animal models are important tools for the evaluation of tissue-engineered grafts. This paper presents the protocol for preparing an electrospun biodegradable polymer graft for use in anterior cruciate ligament tissue engineering, as well as a surgical protocol for implantation in a rat model.

Serie: Athymic Rat Model for Evaluation of Engineered Anterior Cruciate Ligament Grafts

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical deficiencies that impair function and stability. Current options for the treatment of partial ACL tears range from nonoperative, conservative management to multiple surgical options, such as: thermal modification, single-bundle repair, complete reconstruction, and reconstruction of the damaged portion of the native ligament. Few studies, if any, have demonstrated any single method for management to be consistently superior, and in many cases patients continue to demonstrate persistent instability and other comorbidities.
The goal of this study is to identify a potential cell source for utilization in the development of a tissue engineered patch that could be implemented in the repair of a partially torn ACL. A novel protocol was developed for the expansion of cells derived from patients undergoing ACL reconstruction. To isolate the cells, minced hACL tissue obtained during ACL reconstruction was digested in a Collagenase solution. Expansion was performed using DMEM/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin (P/S). The cells were then stored at -80 &#186;C or in liquid nitrogen in a freezing medium consisting of DMSO, FBS and the expansion medium. After thawing, the hACL derived cells were then seeded onto a tissue engineered scaffold, PLAGA (Poly lactic-co-glycolic acid) and control Tissue culture polystyrene (TCPS). After 7 days, SEM was performed to compare cellular adhesion to the PLAGA versus the control TCPS. Cellular morphology was evaluated using immunofluorescence staining. SEM (Scanning Electron Microscope) micrographs demonstrated that cells grew and adhered on both PLAGA and TCPS surfaces and were confluent over the entire surfaces by day 7. Immunofluorescence staining showed normal, non-stressed morphological patterns on both surfaces. This technique is promising for applications in ACL regeneration and reconstruction.

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

For future applications as a patch to repair partial tears of the Anterior Cruciate Ligament (ACL), human ACL derived cells were isolated from tissue obtained during reconstructive procedures, expanded in vitro and grown on tissue engineered scaffolds. Cellular adhesion and morphology was then performed to confirm biocompatibility on scaffold surface.

Chirurgische Retrieval, Isolierung und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Erweiterung des menschlichen vorderen Kreuzbandes abgeleiteten Zellen für Tissue Engineering Anwendungen

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Forschung

Biotechnik

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, and translation of findings is often poor. Thus, there is ample opportunity for alternative experimental approaches. Here we present an approach in which human cells are isolated from human anterior cruciate ligament tissue remnants, expanded in culture, and used to form engineered ligaments. Exercise alters the biochemical milieu in the blood such that the function of many tissues, organs and bodily processes are improved. In this experiment, ligament construct culture media was supplemented with experimental human serum that has been &#39;conditioned&#39; by exercise. Thus the intervention is more biologically relevant since an experimental tissue is exposed to the full endogenous biochemical milieu, including binding proteins and adjunct compounds that may be altered in tandem with the activity of an unknown agent of interest. After treatment, engineered ligaments can be analyzed for mechanical function, collagen content, morphology, and cellular biochemistry. Overall, there are four major advantages versus traditional monolayer culture and animal models, of the physiological model of ligament tissue that is presented here. First, ligament constructs are three-dimensional, allowing for mechanical properties (i.e., function) such as ultimate tensile stress, maximal tensile load, and modulus, to be quantified. Second, the enthesis, the interface between boney and sinew elements, can be examined in detail and within functional context. Third, preparing media with post-exercise serum allows for the effects of the exercise-induced biochemical milieu, which is responsible for the wide range of health benefits of exercise, to be investigated in an unbiased manner. Finally, this experimental model advances scientific research in a humane and ethical manner by replacing the use of animals, a core mandate of the National Institutes of Health, the Center for Disease Control, and the Food and Drug Administration.

We present a model of ligament tissue in which three-dimensional constructs are treated with the human exercise-conditioned serum and analyzed for collagen content, function, and cellular biochemistry.

Behandlung von Ligamentenkonstrukten mit ausüberschüssigem Serum: Ein Translations-Gewebe-Engineering-Modell

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

A Reliable and Reproducible Critical-Sized Segmental Femoral Defect Model in Rats Stabilized with a Custom External Fixator

Orthopedic research relies heavily on animal models to study mechanisms of bone healing in vivo as well as investigate the new treatment techniques. Critical-sized segmental defects are challenging to treat clinically, and research efforts could benefit from a reliable, ambulatory small animal model of a segmental femoral defect. In this study, we present an optimized surgical protocol for the consistent and reproducible creation of a 5 mm critical diaphyseal defect in a rat femur stabilized with an external fixator. The diaphyseal ostectomy was performed using a custom jig to place 4 Kirschner wires bicortically, which were stabilized with an adapted external fixator device. An oscillating bone saw was used to create the defect. Either a collagen sponge alone or a collagen sponge soaked in rhBMP-2 was implanted into the defect, and the bone healing was monitored over 12 weeks using radiographs. After 12 weeks, rats were sacrificed, and histological analysis was performed on the excised control and treated femurs. Bone defects containing only collagen sponge resulted in non-union, while rhBMP-2 treatment yielded the formation of a periosteal callous and new bone remodeling. Animals recovered well after implantation, and external fixation proved successful in stabilizing the femoral defects over 12 weeks. This streamlined surgical model could be readily applied to study bone healing and test new orthopedic biomaterials and regenerative therapies in vivo.

In vivo mammalian models of critical-sized bone defects are essential for researchers studying healing mechanisms and orthopedic therapies. Here, we introduce a protocol for the creation of reproducible, segmental, femoral defects in rats stabilized using external fixation.

Eine zuverlässige und reproduzierbare kritische Größe segmentale femoralen defekt-Modell bei Ratten mit einer benutzerdefinierten Fixateur externe stabilisiert

Orthopedic research relies heavily on animal models to study mechanisms of bone healing in vivo as well as investigate the new treatment techniques. ...

Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats

Regenerative medicine provides novel alternatives to conditions that challenge traditional treatments. The prevalence and morbidity of tendinopathy across species, combined with the limited healing properties of this tissue, have prompted the search for cellular therapies and propelled the development of experimental models to study their efficacy. Umbilical cord matrix-derived mesenchymal stem cells (UCM-MSC) are appealing candidates because they are abundant, easy to collect, circumvent the ethical concerns and risk of teratoma formation, yet resemble primitive embryonic stem cells more closely than adult tissue-derived MSCs. Significant interest has focused on chitosan as a strategy to enhance the properties of MSCs through spheroid formation. This paper details techniques to isolate UCM-MSCs, prepare spheroids on chitosan film, and analyze the effect of spheroid formation on surface marker expression. Consequently, creation of a bilateral patellar tendon injury model in rats is described for in vivo implantation of UCM-MSC spheroids formed on chitosan film. No complication was observed in the study with respect to morbidity, stress rising effects, or tissue infection. The total functional score of the operated rats at 7 days was lower than that of normal rats, but returned to normal within 28 days after surgery. Histological scores of tissue-healing confirmed the presence of a clot in treated defects evaluated at 7 days, absence of foreign body reaction, and progressing healing at 28 days. This bilateral patella tendon defect model controls inter-individual variation via creation of an internal control in each rat, was associated with acceptable morbidity, and allowed detection of differences between untreated tendons and treatments.

This paper describes the preparation and evaluation of umbilical cord matrix-derived mesenchymal stem cells spheroids with a bilateral patellar tendon defect model in a rat. This model was associated with an acceptable morbidity and was found to detect differences between untreated and treated tendons, and between the two treatments tested.

Bewertung von Stammzelltherapien in einem bilateralen Patellasehne Verletzungen Modell bei Ratten

Regenerative medicine provides novel alternatives to conditions that challenge traditional treatments. The prevalence and morbidity of tendinopathy across ...

Medizin

A Non-Invasive Method for Generating the Cyclic Loading-Induced Intra-Articular Cartilage Lesion Model of the Rat Knee

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely correlated with a history of articular cartilage damage and ligament avulsion. Surgical animal models of OA of the knee play an important role in understanding the onset and progression of post-traumatic OA and aid in the development of novel therapies for this disease. However, non-surgical models have been recently considered to avoid traumatic inflammation that could affect the evaluation of the intervention. 
In this study, an intra-articular cartilage lesion rat model induced by in vivo cyclic compressive loading was developed, which allowed researchers to (1) determine the optimal magnitude, speed, and duration of load that could cause focal cartilage damage; (2) assess post-traumatic spatiotemporal pathological changes in chondrocyte vitality; and (3) evaluate the histological expression of destructive or protective molecules that are involved in the adaptation and repair mechanisms against joint compressive loads. This report describes the experimental protocol for this novel cartilage lesion in a rat model.

Here, we present the cyclic loading-induced intra-articular cartilage lesion model of the rat knee, generated by 60 cyclic compressions over 20 N, resulting in damage to the femoral condylar cartilage in rats.

Eine nicht-invasive Methode zur Erzeugung des zyklischen Belastungsinduzierten intraartikulären Knorpelläsionsmodells des Rattenknies

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely ...

Development and Evaluation of a Rat Model of Full-Thickness Cartilage Defects

Cartilage defects of the knee joint caused by trauma are a common sports joint injury in the clinic, and these defects result in joint pain, impaired movement, and eventually, knee osteoarthritis (kOA). However, there is little effective treatment for cartilage defects or even kOA. Animal models are important for developing therapeutic drugs, but the existing models for cartilage defects are unsatisfactory. This work established a full-thickness cartilage defects (FTCD) model by drilling holes in the femoral trochlear groove of rats, and the subsequent pain behavior and histopathological changes were used as readout experiments. After surgery, the mechanical withdrawal threshold was decreased, chondrocytes at the injured site were lost, matrix metalloproteinase MMP13 expression was increased, and type II collagen expression decreased, consistent with the pathological changes observed in human cartilage defects. This methodology is easy and simple to perform and enables gross observation immediately after the injury. Furthermore, this model can successfully mimic clinical cartilage defects, thus providing a platform for studying the pathological process of cartilage defects and developing corresponding therapeutic drugs.

This protocol establishes a full-thickness cartilage defects (FTCD) model by drilling holes in the femoral trochlear groove of rats and measuring the subsequent pain behavior and histopathological changes.

Entwicklung und Evaluierung eines Rattenmodells von Knorpeldefekten in voller Dicke

Cartilage defects of the knee joint caused by trauma are a common sports joint injury in the clinic, and these defects result in joint pain, impaired ...

Implantation of Electrospun Vascular Grafts with Optimized Structure in a Rat Model

Here, we present a protocol to fabricate macroporous PCL vascular graft and describe an evaluation protocol by using a rat model of abdominal aorta replacement. The electrospun vascular grafts often possess relatively small pores, which limit cell infiltration into the grafts and hinder the regeneration and remodeling of the neo-arteries. In this study, PCL vascular grafts with thicker fibers (5 - 6 &#181;m) and larger pores (~30 &#181;m) were fabricated by using a modified processing technique. The long-term performance of the graft was evaluated by implantation in a rat abdominal aorta model. Ultrasound analysis showed that the grafts remained patent without aneurysm or stenosis occurring even after 12 months of implantation. Macroporous structure improved the cell ingrowth and thus promoted tissue regenerated at 3 months. More importantly, there was no sign of adverse remodeling, such as calcification within the graft wall after 12 months. Therefore, electrospun PCL vascular grafts with modified macroporous processing hold potential to be an artery substitute for long-term implantation.

Here, we present a modified electrospinning method to fabricate PCL vascular grafts with thick fibers and large pores, and describe a protocol to evaluate the in vivo performance in a rat model of abdominal aorta replacement.

Implantation von Electrospun Vascular Grafts mit optimierter Struktur in einem Rattenmodell

Here, we present a protocol to fabricate macroporous PCL vascular graft and describe an evaluation protocol by using a rat model of abdominal aorta ...

Biologie

Einfluss von nicht-invasiven ACL-Verletzungen und -Operationen auf die Proteaseaktivität bei Mäusen

Non-Invasive Compression-Induced Anterior Cruciate Ligament (ACL) Injury and In Vivo Imaging of Protease Activity in Mice

Traumatic joint injuries such as anterior cruciate ligament (ACL) rupture or meniscus tears commonly lead to post-traumatic osteoarthritis (PTOA) within 10-20 years following injury. Understanding the early biological processes initiated by joint injuries (e.g., inflammation, matrix metalloproteinases (MMPs), cathepsin proteases, bone resorption) is crucial for understanding the etiology of PTOA. However, there are few options for in vivo measurement of these biological processes, and the early biological responses may be confounded if invasive surgical techniques or injections are used to initiate OA. In our studies of PTOA, we have used commercially available near-infrared protease activatable probes combined with fluorescence reflectance imaging (FRI) to quantify protease activity in vivo following non-invasive compression-induced ACL injury in mice. This non-invasive ACL injury method closely recapitulates clinically relevant injury conditions and is completely aseptic since it does not involve disrupting the skin or the joint capsule. The combination of these injury and imaging methods allows us to study the time course of protease activity at multiple time points following a traumatic joint injury.

Autor im Rampenlicht: Untersuchung früher Ereignisse und langfristiger Auswirkungen von ACL-Verletzungen auf das Fortschreiten der Osteoarthritis

Non-invasive ACL injury is a reliable and clinically relevant method for initiating post-traumatic osteoarthritis (PTOA) in mice. This injury method also allows for in vivo quantification of protease activity in the joint at early time points post-injury using protease-activatable near infrared probes and fluorescence reflectance imaging.

Nicht-invasive kompressionsinduzierte Verletzung des vorderen Kreuzbandes (ACL) und In-vivo-Bildgebung der Proteaseaktivität bei Mäusen

Traumatic joint injuries such as anterior cruciate ligament (ACL) rupture or meniscus tears commonly lead to post-traumatic osteoarthritis (PTOA) within ...

Athymischen Rattenmodell für die Bewertung von Engineered vorderen Kreuzbandes Grafts

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Chirurgische Retrieval, Isolierung und

Behandlung von Ligamentenkonstrukten mit ausüberschüssigem Serum: Ein Translations-Gewebe-Engineering-Modell

Eine zuverlässige und reproduzierbare kritische Größe segmentale femoralen defekt-Modell bei Ratten mit einer benutzerdefinierten Fixateur externe stabilisiert

Bewertung von Stammzelltherapien in einem bilateralen Patellasehne Verletzungen Modell bei Ratten

Eine nicht-invasive Methode zur Erzeugung des zyklischen Belastungsinduzierten intraartikulären Knorpelläsionsmodells des Rattenknies

Entwicklung und Evaluierung eines Rattenmodells von Knorpeldefekten in voller Dicke

Implantation von Electrospun Vascular Grafts mit optimierter Struktur in einem Rattenmodell

Nicht-invasive kompressionsinduzierte Verletzung des vorderen Kreuzbandes (ACL) und In-vivo-Bildgebung der Proteaseaktivität bei Mäusen

Nicht-invasive kompressionsinduzierte Verletzung des vorderen Kreuzbandes (ACL) und In-vivo-Bildgebung der Proteaseaktivität bei Mäusen

Nicht-invasive kompressionsinduzierte Verletzung des vorderen Kreuzbandes (ACL) und In-vivo-Bildgebung der Proteaseaktivität bei Mäusen