This research was supported by the S-Innovation project of the Japan Science and technology Agency (JST), the Graduate Program for Leaders in Life Innovation (GPLLI) of the University of Tokyo, and the Research Fellowship for Young Scientists of Japan Society for the Promotion of Science. We thank nac Image Technology Inc. for taking movies using a hi-speed camera.

1. Vorbereitung Materialien <ol><li> Herstellung von 10 mM HEPES-Puffer. Den pH-Wert auf 7,0 bei RT und fügen NaCl auf 0,9%. </li><li> Bereiten Sie 5% Alginat-Lösung und 10 mM EDTA-Lösung durch Mischen von HEPES-gepufferte Kochsalzlösung in 1.1 vorbereitet. Man stellt den pH auf 7,0 bei RT. </li><li> Autoklaven werden die Reagenzien (1.1, 1.2) für 20 Minuten bei 121 ° C. </li><li> Vorbereitung Gelatine beschichteten 60 mm-Schalen mit 1,2 geschichtet - 2,0 × 10 6 embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) Zellen, die als Feeder-Zellen durch Inkubation in DMEM, das 10% ES-qualifizierte FBS und 10 ug / ml Mitomycin C für 90 behandelt werden, - 120 min. </li><li> Aufrechterhaltung der Maus induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) Zellen auf der Schale mit der Feeder-Zellen in Gegenwart von 5 ml DMEM mit hohem Glucose mit 20% ES-qualifizierte FBS, 50 uM 2-Mercaptoethanol, nicht-essentielle Aminosäure und Antibiotika ( 100 Einheiten / ml Penicillin G Natrium, 100 &amp; mgr; g / ml Streptomycinsulfat, und 250 ng / ml amphotericin B). </li><li> Seed 4 x 10 5 Zellen auf einer iPS Gelatine beschichteten 60 mm-Schale und inkubieren bei 37 ° C und 5% CO 2. Ändern Sie das Kulturmedium täglich während der Inkubation. Nach 3-4 Tagen Kultur trypsinize Zellen für 1 min mit 500 ul 0,05% Trypsin, enthaltend 0,02% EDTA bei 37 ° C und 5% CO 2. Danach lösen Zellen durch Antippen der Kulturschale zehnmal. </li><li> In 2,5 ml DMEM mit 10% der ES-qualifizierte FBS und Antibiotika (nach Dissoziation Maus iPS-Zellen in einzelne Zellen durch Pipettieren mit 1000 ul Mikropipette dreimal) Zentrifuge Zellsuspension bei 160 × g für 3 min und entfernen Überstand und zählen Sie die Zellen . Nach Zellzählung, ein erneutes Seeding der gesammelten Zellen auf einem mit Gelatine beschichtete Schale und Inkubation für 30 min, um die iPS-Zellen aus den MEF-Zellen zu isolieren. Nach dem Zählen der Zellen (in der Regel 1 bis 3 x 10 6 Zellen / Schale gesammelt werden kann), reseed 4 × 10 5 Zellen auf iPSder Teller. </li></ol> 2. Zell Encapsulation in Alginat-Hydrogel-Kapseln <ol><li> Sammeln Sie die Zellen, die durch in 1.5 und 1.6 beschrieben das gleiche Verfahren. Nach der Zentrifugation bei 160 × g für 3 Minuten, waschen Sie die iPS-Zellpellet mit HEPES-gepufferte Kochsalzlösung dreimal. Nach Resuspendieren der Zellen in HEPES-gepufferter Kochsalzlösung, Filtern der Zellsuspension durch ein 40 &amp; mgr; m Zellsieb um große Aggregate, die andernfalls die Düse verstopfen können. </li><li> Mix 2 ml der Zellsuspension in HEPES-gepufferter Kochsalzlösung und 3 ml 5% Alg-Na-Lösung. Schließlich 5 ml Zellsuspension innerhalb von 3% Alg-Na-Lösung erhalten wird. Zelldichte ist wünschenswerterweise mehr als 10 6 Zellen / ml. </li><li> Nach dem Sammeln der Zellsuspension in eine 5-ml-Spritze, installieren Sie eine koaxiale Düse (1A, B) auf der Spritze und setzen Sie sie auf Spritzenpumpe. Emit N 2 -Gasstrom (niedriger als 1 l / min) durch die äußere Nadel des koaxialen Düse undvertreiben die Zellsuspension durch die innere Düse. </li><li> Sammeln Tröpfchen in 250 ml einer 0,5% CaCl 2 -Lösung und warten 10-20 min zur Gelbildung unter Rühren bei 60-90 Umdrehungen pro Minute. </li></ol> 3. Behandlung von Alginat-Kapseln (optional) <ol><li> Alg-Ca Kapseln Inkubieren in 0,05% (w / v) Poly-L-Lysin (PLL) Lösung für 5 min bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Nach dem Waschen der Kapseln mit HEPES-gepufferter Kochsalzlösung, inkubieren in DMEM enthaltend 10% FBS, um die elektrische Ladung auf ihrer Oberfläche zu neutralisieren. Nutzen sie als überzogene Kapseln (Abbildung 1c). </li><li> Inkubieren der Kapseln in HEPES-gepufferter Salzlösung, enthaltend 10 mM EDTA für 5 min. Die EDTA-behandelten Kapseln sind als Hohlkapseln (1C) eingesetzt. </li></ol> 4. Kultur und sammeln Zellen in Alginat-Kapseln <ol><li> Die eingekapselten Zellen mit 75 UpM mit inkubieren bei 37 ° C und 5% CO 2 Schüttelnfür 10 Tage. </li><li> Sammeln und inkubieren der Kapseln in 10 mM EDTA bei 37 ° C und 5% CO 2 für 10 min. Sammeln Zellen aus den Alginatkapseln ohne PLL-Behandlung durch Zentrifugation bei 1.000 × g für 3 min. </li><li> Wenn Alginat Kapseln mit PLL behandelt, brechen die Alg-PLL Membran durch Auf- und Abpipettieren rund zehnmal mit einer Nadel an einer Spritze und Zentrifuge es bei 1000 angebracht - 5.000 × g für 5 min. Nadeldurchmesser sollte niedriger sein als Kapselgröße und 25 g (260 &amp; mgr; m) Nadeln werden in diesem Experiment verwendet werden (600 um) </li><li> Nach dem Zentrifugieren sammeln Zellpellet strikt von gebrochenen Alg-PLL-Membranen, wenn Sie mRNA Proben von Zellen zu sammeln möchten. Verbleibende Alg-PLL Membranen möglicherweise verhindern, dass mRNA Reinigung. </li></ol>

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	<li>Zweigerdt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+production+of+stem+cells+and+their+derivatives.">Large scale production of stem cells and their derivatives.</a> Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 114, 201-235 (2009).</li><li>Chen, A., Chen, X., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+microcarrier+properties+affecting+the+expansion+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells.">Critical microcarrier properties affecting the expansion of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Stem cell Res. 7 (2), 97-111 (2011).</li><li>Schroeder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+lineage+selection+of+mouse+embryonic+stem+cells+in+a+stirred+bench+scale+bioreactor+with+automated+process+control.">Differentiation and lineage selection of mouse embryonic stem cells in a stirred bench scale bioreactor with automated process control.</a> Biotechnol. Bioeng. 92 (7), 920-933 (2005).</li><li>Leung, H. W., Chen, A., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agitation+can+induce+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+in+microcarrier+cultures.">Agitation can induce differentiation of human pluripotent stem cells in microcarrier cultures.</a> Tissue Eng. Part C. 17 (2), 165-172 (2011).</li><li>Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled,+scalable+embryonic+stem+cell+differentiation+culture.">Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture.</a> Stem Cells. 22 (3), 275-282 (2004).</li><li>Weber, L. M., He, J., Haskins, K., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG-based+hydrogels+as+an+in+vitro+encapsulation+platform+for+testing+controlled+for+testing+controlled+&#223;-cell+microenvironments.">PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled for testing controlled &#223;-cell microenvironments.</a> Acta Biomater. 2 (1), 1-8 (2006).</li><li>Horiguchi, I., Chowdhury, M. M., Sakai, Y., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation,+morphology,+and+pluripotency+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells+in+three+different+types+of+alginate+beads+for+mass+production.">Proliferation, morphology, and pluripotency of mouse induced pluripotent stem cells in three different types of alginate beads for mass production.</a> Biotechnol. Prog. 30 (4), 896-904 (2014).</li><li>Rahman, N., Purpura, K. A., Wylie, R. G., Zandstra, P. W., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+vascular+endothelial+growth+factor+functionalized+agarose+to+guide+pluripotent+stem+cell+aggregates+toward+blood+progenitor+cells.">The use of vascular endothelial growth factor functionalized agarose to guide pluripotent stem cell aggregates toward blood progenitor cells.</a> Biomaterials. 31 (32), 8262-8270 (2010).</li><li>Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+benefit+of+human+embryonic+stem+cell+encapsulation+for+prolonged+feeder-free+maintenance.">The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance.</a> Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).</li><li>Magyer, J. P., Nemir, M., Ehler, E., Suter, N., Perriard, J., Eppenberger, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Production+of+Embryoid+Bodies+in+Microbeads.">Mass Production of Embryoid Bodies in Microbeads.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 944, 135-143 (2001).</li><li>Xu, J., Li, S., Tan, J., Luo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controllable+Preparation+of+Monodispersed+Calcium+Alginate+Microbeads+in+a+Novel+Microfluidic+System.">Controllable Preparation of Monodispersed Calcium Alginate Microbeads in a Novel Microfluidic System.</a> Chem. Eng. Technol. 31 (8), 1223-1226 (2008).</li><li>Sakai, M. P., Y, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Bioactive+Hydrogel+Capsules+for+The+3D+Expansion+of+Pluripotent+Stem+Cells+in+Bioreactors.">Development of Bioactive Hydrogel Capsules for The 3D Expansion of Pluripotent Stem Cells in Bioreactors.</a> Biomater. Sci. 2 (176), 176-183 (2014).</li><li>Chowdhury, M. M., Katsuda, T., Montagne, K., Kimura, H., Kojima, N., Akutsu, H., Ochiya, T., Fujii, T., Sakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+effects+of+secreted+soluble+factor+preserve+better+pluripotent+state+of+embry-+onic+stem+cell+culture+in+a+membrane-based+compartmentalized+micro-bioreactor.">Enhanced effects of secreted soluble factor preserve better pluripotent state of embry- onic stem cell culture in a membrane-based compartmentalized micro-bioreactor.</a> Biomed. Microdevices. 12 (6), 1097-1105 (2010).</li><li>Chowdhury, M. M., Kimura, H., Fujii, T., Sakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+alternative+fate+other+than+default+neuronal+fate+of+embryonic+stem+cells+in+a+membrane-based+two-chambered+micro-+bioreactor+by+cell-secreted+BMP4.">Induction of alternative fate other than default neuronal fate of embryonic stem cells in a membrane-based two-chambered micro- bioreactor by cell-secreted BMP4.</a> Biomicrofluidics. 6 (1), 14117-14117-13 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> Encapsulation Kultur kann mit direktem Suspensionskulturen verglichen werden. Suspensionskultur ist eine einfachere Methode, um große Mengen von pluripotenten Stammzellen als Einkapselungsverfahren erhalten. , Steuerung der Aggregation von Zellen in Suspensionskultur ist jedoch immer noch eine Herausforderung. Im Verkapselungsverfahren wird Zellaggregation in Kapseln beschränkt und kann daher gut kontrolliert werden. In einer früheren Publikation zeigte, dass eingekapselten Zellen gebildeten Aggregate von einhe...

Induced pluripotent stem cells (iPS cells) are currently the source of intense research due to their role in regenerative medicine. However, huge amounts of cells are required for tissue regeneration. For instance approximately one billion pancreatic cells required for a type 1 diabetic patient1. However, conventional dish culture is only able to obtain 1 &#215; 105 cells/cm2, thus requiring 1 m2 of culture area to obtain enough stem cell-derived pancreatic cells to treat a type 1 diabetic patient. The development of a system for the mass-culture of pluripotent stem cells, such as microcarrier2 and suspension culture is therefore required for regenerative medicine. Suspension culture represents a promising method of mass culture but controlling the aggregation of cells is challenging in direct suspension cultures of human iPS cells3. Indeed, suspended cells are exposed to shear stress, which causes cell damage3 or differentiation4.
Research into hydrogel-based encapsulation has been conducted to solve problems associated with suspension culture. In hydrogel capsules, cells are protected from the flow of the medium. Previous reports have documented the use of various types of hydrogel, including agarose5, PEG6, and alginate (Alg), for cellular encapsulation. Alg-Ca hydrogel is one of the most useful hydrogels for cell encapsulation because Alg&#8722;Ca hydrogel is formed immediately after dropping alginate solution into a CaCl2 solution and is also readily digested by enzymes or chelating reagents. 
Here, we have established a stable alginate encapsulation process for iPS cells using a co-axial nozzle. By using N2 gas flow for forming droplets, it is possible to encapsulate cells into uniform capsules without the need for other reagents such as oil. In this method, the flow rate of N2 and concentration of both CaCl2 and alginate are the major operating conditions affecting the size, shape, and uniformity of capsules. This report demonstrates the optimization of these operating conditions through the use of a hi-speed camera and a microscope.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mouse embryo fibroblast</td>
			<td>Cell Biolabs</td>
			<td>SNL 76/7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse induced pluripotent stem cell</td>
			<td>RIKEN Bio resorce centre</td>
			<td>iPS-MEF-Ng-20D-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high-glucose</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES qualified&#160; FBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>16141079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibacterial Antibiotics</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonessential Amino Acid</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESGRO Leukemia Inhibitory Factor</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G/16G needle</td>
			<td>Hoshiseido</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SS-10ESZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium&#160; Chloride</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Alginate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>194-09955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Wako</td>
			<td>039-00475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine (Mw=15,000-30,000)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P7890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>345-01865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylinge pump</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM IRB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hispeed camera</td>
			<td>nac image technology</td>
			<td>Memrecam HX-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

alginate encapsulation of pluripotent stem cells using a co-axial nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

Bei Protokoll 2.5, die vertrieben Alginat-Lösung bildet sofort eine Kugelform nach Vertreibung (2A - H). Wenn die Suspension mit einer N 2 Durchflussrate von weniger als 1 l / min ausgestoßen, der Größe der Tröpfchen einheitlicher (2I). Wenn die N 2 -Strom größer ist als 1 l / min, unterbricht jedoch die Tröpfchen unten (Figur 2G, weiße Pfeile) und die Größe der Tröpfchen heterogen (2J). Angesichts dieser Tatsache ist e...

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Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

Alginat Encapsulation pluripotenter Stammzellen Mit einer Co-Axial Düsen

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.5K Aufrufe.  The University of Tokyo. We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.